[0001]
本发明涉及抗生素技术领域，具体而言，涉及一种去除血清中抗生素的方法及其应用。
背景技术：
[0002]
牛血清(主要为胎牛血清及新生小牛血清)作为细胞培养液的重要组成成分，自细胞培养技术应用以来，便几乎成为一种必不可少的添加成分，广泛应用于疫苗等生物制药行业及科学研究中。然而，四环素类抗生素因具有高效和广谱抗菌的特性，被广泛应用于农业、养殖行业，势必造成牛体内四环素类抗生素的累积，对牛血清造成污染。牛血清中存在的四环素等抗生素的残留一方面会影响生物制品的质量；另一方面，在四环素调控的基因表达系统研究中，若使用被四环素污染的牛血清将直接对试验造成干扰，甚至导致试验的失败。在动物细胞培养过程中，配制细胞培养基时通常需要加入一定体积的胎牛或小牛血清。若使用了含四环素的胎牛或小牛血清，将直接导致四环素调控系统的失灵，以至于实验的失败，因此，确保细胞培养过程中使用不含四环素的牛血清对四环素调控系统相关实验的成败至关重要。
[0003]
牛血清作为一种无菌生物制剂，该溶液中四环素等抗生素的去除办法与普通水处理存在较大差异，在牛血清的处理过程中，不仅需要确保全程无菌，还需保证没有其他的风险因子引入，否则将直接影响牛血清的质量。因此对处理的原材料及工艺条件都有一定的要求，不可将水处理的方法直接用于牛血清的处理。
[0004]
目前关于水溶液中四环素的去除方法主要包括物理吸附法、化学分解法及生物降解法等。但尚未见有关牛血清中四环素的去除方法的文献报道。在目前四环素去除的几种方法中，化学分解和生物降解法因会直接对牛血清品质造成影响，并且会引入新的风险因子，因此不适合用于无菌试剂牛血清的处理。同时牛血清中含有较高的蛋白质和较多的生物活性物质，因此在选用处理的材料时应特别注意不能影响牛血清本身的质量。
技术实现要素：
[0005]
为了克服现有技术的不足，本发明采用药用活性炭，吸附去除血清中残留的四环素等抗生素，之后采用无菌过滤工艺去除牛血清中的活性炭，最后通过超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测，显示该处理方法能安全、有效、简单地去除血清中的四环素。
[0006]
具体地，本发明提供了一种去除血清中抗生素的方法，s1、对血清样品进行四环素检测；s2、将活性炭加入到四环素检测为阳性的血清原液中；s3、将s2中获得的活性炭与血清的混合物，搅拌混匀；s4、吸附完成后，无菌过滤除去血清中的活性炭；s5、对处理后的血清样品进行四环素含量检测，检测结果为四环素阴性的血清为合格。
[0007]
优选地，所述的血清样品为牛血清、人血清、羊血清、马血清中的一种。
[0008]
优选地，所述步骤s1中血清样品中四环素的检测采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法。
[0009]
优选地，所述步骤s1中检测的血清样本的四环素为阳性。
[0010]
优选地，所述步骤s2中所述活性炭与血清原液的比例为1:1000-1:100。
[0011]
优选地，所述的活性炭为医用活性炭。
[0012]
优选地，所述的活性炭购自合格的活性炭厂家，厂家提供活性炭的质检报告，质检报告显示其质量均符合《中国药典(2015版四部)》的相关要求。
[0013]
优选地，所述的活性炭的用量为1-10g/l。
[0014]
优选地，所述步骤s3中搅拌时间为1～48小时。
[0015]
优选地，所述步骤s3中搅拌温度为4℃～37℃。
[0016]
优选地，所述步骤s3中搅拌方法为机械搅拌或磁力搅拌。
[0017]
优选地，所述步骤s4中采用多次无菌过滤法，将活性炭与牛血清进行分离。
[0018]
优选地，所述步骤s5中对处理后的牛血清样品进行检测，采用的方法为超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法，处理后的牛血清样品中四环素检测结果均为阴性即为合格。
[0019]
优选地，所述步骤s1中血清样品中四环素的检测方法，包括如下步骤：(1)向待测血清样品中加入三氯乙酸水溶液和edta-na2水溶液；(2)旋涡混合后，离心取上清，获得血清样品提取液；(3)对血清样品提取液进行检测分析。
[0020]
优选地，所述的血清样品为牛血清、人血清、羊血清、马血清中的一种。
[0021]
优选地，所述步骤(1)中三氯乙酸水溶液的浓度为10％。
[0022]
优选地，所述步骤(1)中edta-na2水溶液的浓度为4.9％。
[0023]
优选地，所述步骤(1)中三氯乙酸与edta-na2水溶液的体积比为6:4～9:1。
[0024]
优选地，所述步骤(1)中待测血清样品与样品提取液的体积比为1：10～1：8。
[0025]
优选地，所述步骤(2)中离心转速为10000-12000rpm。
[0026]
优选地，所述步骤(2)中离心温度为4℃。
[0027]
优选地，所述步骤(2)中离心时间为10～30分钟。
[0028]
优选地，所述步骤(3)中血清样品提取液中四环素的检测采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法。
[0029]
优选地，所述步骤(3)中超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法的色谱条件为色谱柱为zorbax rx-c8，2.1mm
×
150mm,5μm。
[0030]
优选地，所述步骤(3)中超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法的流动相a为0.1％甲酸-水；流动相b为甲醇。
[0031]
优选地，所述步骤(3)中超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法的a：b为9:1。
[0032]
优选地，所述步骤(3)中超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法的流速为0.3ml/min，柱温为30℃，进样量为5μl，洗脱时间为10min。
[0033]
优选地，所述步骤(3)中超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法的质谱条件为：离子化模式电喷雾正离子模式，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10l/min，雾化器压力为45psi，毛细管电压为4kv。
[0034]
本发明还提供了去除血清中抗生素的方法在去除血清中抗生素的应用。
[0035]
本发明的技术方案中，经过活性炭处理的牛血清，能更安全地应用于生物制药行业；同时能为四环素报告基因相关的科学研究，提供合格无四环素污染的牛血清，有助于研
究人员获得客观真实的科学研究数据。另外，本发明通过活性炭吸附处理，不仅能有效去除血清中的四环素，并且同时能有效去除血清中的激素、内毒素等有机小分子物质，不仅能满足相关科学研究的需求，更加提高了牛血清的品质。
具体实施方式
[0036]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0037]
活性炭作为一种多孔性物质，具有蜂窝状的孔隙结构，较大的比表面积，特异的表面官能团、稳定的物理和化学性能，是优良的吸附剂、催化剂或催化剂载体。根据原料来源的不同活性炭分为木质活性炭、矿物质原料活性炭和其他原料制成的活性炭等。活性炭以其优异的物理吸附性能，广泛应用于水溶液等的净化除杂等领域。
[0038]
本发明采用药用活性炭，吸附去除血清中残留的四环素等抗生素，之后采用无菌过滤工艺去除牛血清中的活性炭，最后通过超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测，显示该处理方法能安全、有效、简单地去除血清中的四环素。
[0039]
实施例1
[0040]
将从市面购得的胎牛血清，取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测，测得样品中四环素含量不高于1.0微克/毫升。无菌称取5g活性炭，加入到1l牛血清中，将二者于密闭无菌容器中，37摄氏度条件下磁力搅拌处理2小时，之后采用无菌装置进行多次无菌过滤，从而分离牛血清中的活性炭，收集分离后的血清并取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测。处理后的牛血清中四环素检测结果为阴性。
[0041]
实施例2
[0042]
将从市面购得的胎牛血清，取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测，测得样品中四环素含量不高于1.0微克/毫升。无菌称取5g活性炭，加入到1l牛血清中，将二者于密闭无菌容器中，室温条件下磁力搅拌处理5小时，之后采用无菌装置进行多次无菌过滤，从而分离牛血清中的活性炭，收集分离后的血清并取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测。处理后的牛血清中四环素检测结果为阴性。
[0043]
实施例3
[0044]
将从市面购得的胎牛血清，取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测，测得样品中四环素含量不高于1.0微克/毫升。无菌称取10g活性炭，加入到1l牛血清中，，将二者于密闭无菌容器中，室温条件下磁力搅拌处理1小时，之后采用无菌装置进行多次无菌过滤，从而分离牛血清中的活性炭，收集分离后的血清并取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测。处理后的牛血清中四环素检测结果为阴性。
[0045]
实施例4
[0046]
将从市面购得的胎牛血清，取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测，测得样品中四环素含量不高于1.0微克/毫升。无菌称取5g活性炭，加入到1l牛血清中，将二者于密闭无菌容器中，4摄氏度条件下磁力搅拌处理48小时，之后采用无菌装置进行多次无
菌过滤，从而分离牛血清中的活性炭，收集分离后的血清并取样进行超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测。处理后的牛血清中四环素检测结果为阴性。
[0047]
实施例5检测灵敏度试验
[0048]
5.1实验仪器
[0049]
超高效液相色谱-质谱(三重串联四级杆)联用系统(agilent lc1260-qqq 6495)。
[0050]
5.2实验试剂与耗材
[0051]
四环素标准品购自sigma公司；甲酸、甲醇均为色谱级；三氯乙酸和edta-na2为分析纯；实验用水均为超纯水。
[0052]
5.3溶液的配制
[0053]
四环素标准品：准确称取适量的四环素，用甲醇配制成0.5mg/ml的标准储备液，用0.2微米水系滤膜过滤后于-20℃冰箱储存，使用时，根据需要用10％的三氯乙酸稀释成适当浓度的标准液。
[0054]
样品提取液：分别称取一定质量的三氯乙酸和edta-na2溶解至超纯水中并定容，使终浓度分别为10％和4.9％，溶液配制完毕后，用0.2μm水系滤膜过滤后备用。
[0055]
0.1％的甲酸：取甲酸1ml，加超纯水定容至1l，0.2μm水系滤膜过滤后备用。
[0056]
5.4色谱条件
[0057]
色谱柱：zorbax rx-c8，2.1mm
×
150mm,5μm；
[0058]
流动相：a为0.1％甲酸-水；b为甲醇。a：b为9:1；
[0059]
流速：0.3ml/min；
[0060]
柱温：30℃；
[0061]
进样量：5μl；
[0062]
洗脱时间：10min。
[0063]
5.5质谱条件
[0064]
离子源：电喷雾
[0065]
离子化模式：正离子模式
[0066]
干燥气温度：350℃
[0067]
干燥气流速：10l/min
[0068]
雾化器压力为45psi
[0069]
毛细管电压为4kv。
[0070]
5.6方法灵敏度试验
[0071]
将方法1.3中的四环素标准液用10％的三氯乙酸稀释成浓度为0.1ng/μl、0.5ng/μl、1.0ng/μl、5.0ng/μl系列的标准四环素溶液，采用超高效液相色谱-质谱(三重串联四级杆)联用系统进行检测，一个样品的检测时间约10分钟。测得该四个浓度四环素含量的准确度分别为98.96％，97.90％,101.31％，99.97％，显示了良好的测量准确度。将0.1ng/μl标准液继续稀释2倍、5倍时，此时测出的数值便出现不稳定的情况，与真实值发生较大的偏差，因此，此方法中四环素的最低检测限为100ng/ml。
[0072]
实施例6方法回收率试验
[0073]
实施例6的步骤6.1-6.5同实施例1中步骤5.1-5.5。
[0074]
6.6方法回收率
[0075]
6.6.1以四环素阴性的血清100微升，作为空白样品，取方法1.3中的四环素标准液1微升加入到血清样品中，混匀，然后加入10％的三氯乙酸和4.9％的edta-na2溶液850μl和50μl，(使加入的四环素终浓度为500ng/ml，即稀释1000倍)。以上混合液旋涡混匀30s，静置30分钟，12000g，4℃离心15分钟，取上清进行超高效液相色谱-质谱(三重串联四级杆)联用系统进行检测，一个样品的检测时间约10分钟。
[0076]
6.6.2将方法2.6.1中的10％三氯乙酸和4.9％edta-na2的加入体积调整为800μl和100μl，其余不变。
[0077]
测得四环素加标回收率分别为82.3％-92.3％及87.7％-97.7％。方法回收率可以满足检测的需要。
[0078]
实施例7效果验证
[0079]
实施例7的步骤7.1-7.5同实施例1中步骤5.1-5.5。
[0080]
7.6样品前处理
[0081]
用移液器准确量取普通牛血清样品和去除四环素的牛血清样品各100μl，先后加入10％的三氯乙酸和4.9％的edta-na2分别为800μl和100μl，旋涡混匀30s，转速12000rpm，4℃离心15分钟，取上清进行超高效液相色谱-质谱(三重串联四级杆)联用系统进行检测，一个样品的检测时间约10分钟。试验的阳性对照为含50μg/ml的四环素标准溶液，阴性对照为不含血清的三氯乙酸-edta-na2溶液。
[0082]
质谱检测结果显示，阳性对照样品检测出明显的四环素特征峰，同时在普通牛血清样品中检测出四环素特征峰，阴性对照及去除四环素的血清样品均未检测四环素特征峰。
[0083]
鉴于无四环素的牛血清目前主要应用于四环素报告系统的相关研究中，本发明，主要检测的是以四环素为代表的抗生素。因活性炭的物理吸附作用是非选择性的，活性炭以其发达的孔隙结构，对溶液中的有机小分子(比如四环素类抗生素、内毒素、激素等)都有较强的吸附作用，本发明包括但不限于仅对血清中四环素的吸附去除，使用本发明提供的方法去除血清中四环素类抗生素、内毒素、激素等有机小分子也在保护范围内。
[0084]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优良特点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。