专利名称：一种高通量快速筛选抗生素产生菌的方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高通量快速筛选抗生素产生菌的新方法，另外还涉及应用在这种方法中 的新装置。
技术背景青霉素等抗生素的发现及其在临床上的应用对控制人类感染性疾病发挥了巨大的作用。 但随着抗生素的广泛使用，特别是抗生素的滥用，各种耐药性病原体相继出现，而且出现的 速度越来越快。例如医院常见的感染菌耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)，能大幅增加感染性疾病 的死亡率，又例如出现了能抵抗甲氧西林、四环素、万古霉素等多种抗生素的超级细菌。这 些细菌的出现极大地威胁着人类健康和生活质量。虽然合理服用抗生素可以降低耐药病原微生物的出现速度，但由于各种抗药性会在菌株 间积累和转移，最终还是会出现如MRSA类的耐药菌。因此，加大力度开发出新的抗生素药物 是最有效的途径。自然界存在着不计其数的微生物种类，这个异常丰富的微生物资源是药物 开发的宝藏。利用细菌拮抗作用来筛选对病原菌有抑制作用的菌株，然后对其代谢产物进行 分离，从而得到抑制病原菌的有效活性成分，是开发新抗生素的传统路线，也是最有效的方 法之一，其中青霉素就是这样被发现的。目前，筛选不同微生物菌株之间有拮抗作用的方法主要有琼脂块法，滤纸片法，比浊法， 生长速率法和管碟法。琼脂块法就是将待筛选菌株于合适的培养基平板中培养一定的时间后， 用打孔器将待筛选菌琼脂块转移到事先涂有指示菌的平板上，根据指示菌的生长特性培养一 段时间，观测抑菌圈的大小。滤纸片法就是将经过高温灭菌的滤纸浸入由待筛选菌株的发酵 液或其发酵液的提取物配制成的测试液中，沥干溶剂后平贴于涂有指示菌的平板上，培养一定时间后与对照组比较测定抑菌圈的大小，以确定是否有拮抗作用。比浊法是将待筛选菌株 的发酵液或其发酵液的提取物配制成测试液，将一定量测试液加入指示菌的液体培养基中， 培养一定时间后测定培养液浊度值的大小，并与对照组进行比较以确定是否有拮抗作用。生 长速率法是将待筛选菌株的发酵液或者发酵液的提取物制成测试液，加入适合指示菌生长的 固体培养平板中，然后将含有指示菌的琼脂块置于此平板中，培养一定时间后观测菌落的大 小，并与对照组比较，确定是否有抑菌作用。管碟法是将待筛选菌株的发酵液或者发酵液的 提取物制成测试液。将无菌不锈钢小杯置于事先涂有指示菌的平板中，并向杯中加入一定量 测试液，培养一定时间后，与对照组比较，确定是否有抑菌作用。总体来说，上述方法都需要先纯化待筛选菌，无法实现菌株的分离和筛选同步进行。除 了琼脂块法外，其它方法都需要对待筛选菌进行液体发酵，不仅操作繁琐，耗时较长，液体
发酵的条件较难控制，而且有些待筛选菌株的液体发酵条件并不适合抗生素的产生。琼脂块 法方法虽然步骤相对简单，但筛选拮抗菌时，需要将待筛选菌的琼脂块从培养的平板上转移 到指示菌平板上，而且一次只能筛选少数几个待筛选菌，大批量筛选操作时，含待筛选菌的 琼脂块的转移不方便，需要的材料多，费时又费力。 发明内容本发明的目的在于开发出一种能快速并高通量筛选抗生素产生菌的新方法，另一 目的是开 发出应用于该方法中的新装置。我们设计出一种新装置，具有上下两层培养皿，层间用半透过性微孔膜隔开，通过将待 筛选菌和指示菌分别置于其中一层，从而观察指示菌是否出现抑菌圈，这种方法能快速并高 通量地筛选出与指示菌拮抗的菌株，从而实现了本发明的目的。本发明用于筛选抗生素产生菌的装置，其特征是具有上层和下层培养皿，层间用半透过 性微孔膜隔开。本发明装置最好还具有一个上盖和一个下盖，以便操作和避免污染，当然也可以不具有 盖，需要时可盖上无菌薄膜或薄板等。所述装置的上或下层培养皿可以是1个或者1个以上， 所述培养皿可以为不同的形状和大小，只要适合待筛选菌和指示菌培养都可采用。图l示意 的装置由带有上、下盖的1个上层培养皿和1个下层培养皿构成，上层培养皿底部有小孔与 下层相通，其间固定有半透过性微孔膜隔开；图2 4示意的装置上、下层都有多个同样数目 的培养皿，上层培养皿是一个上为方形和下为倒圆梯形的组合，下层培养皿是上大下小的倒 梯形，上层每个培养皿底部都有小孔与下层相通；图5 7示意的装置上层有多个培养皿，是 一个上为方形和下为倒圆梯形的组合，下层培养皿为1个带边缘的平板，上层每个培养皿底 部都有小孔与下层相通，其间固定有半透过性微孔膜隔开。上述各附图中所示的本发明装置 上、下层结构可以互换。下层的培养皿除上述的形状也可以是倒圆梯形、圆柱形或其它形状。 当然在各层培养皿为多个又使用同一种培养基的情况下，培养皿的进口处最好为方形，只要 使相邻的培养皿间有一个如冰箱中的冰格那样的豁口 ，就能快捷地在所有培养皿中加入培养 基。考虑到使用时，按操作习惯， 一般把待筛选菌置于上层培养皿，所以装置的上层的培养 皿最好为上大下小的形状，这样有利于细菌分泌的代谢产物浓缩，便于抑菌圈的观察，而且 当下层倒入45-5(TC的培养基时，不会把上层的固体培养基融化，使之能保持原有形状。上、 下两层各培养皿相通的孔径最好为2 8 mm。整个装置包括上下盖可以用塑料或其他便于加工和便于灭菌的材料制造。 本发明所用的半透过性膜的材质可以是纤维素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏 氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚 合物等容易灭菌的材质，其孔径大小以在上述培养皿中倒入液态培养基不漏为宜， 一般为 0. 2 3um ，可购自市场。
本发明的筛选抗生素产生菌的方法，其特征是先在所述的装置其中一层培养皿中加入含 琼脂10 15 g/L的无菌液态的待筛选菌培养基，待其凝固后，接种待筛选菌进行培养足够时 间后，在另一层培养皿中接种指示菌，然后将分处两层由半透过性微孔膜隔开的待筛选菌和 指示菌共同培养，观察指示菌培养基中是否出现抑菌圈。根据上述的本发明装置上、下层结构，所述的待筛选菌和指示菌可以分别置于其中的一 层，但因为待筛选菌需先培养，按操作习惯， 一般把待筛选菌置于上层培养皿。所述的指示菌指示菌培养过夜后接种到45 50 'C无菌液态的指示菌培养基(含琼脂10 15g/L)中，菌浓度达102 106 cfu/mL，在待筛选菌培养5 7天时，再加入另一层培养皿中， 或在所述的待筛选菌培养基凝固后，在另一层培养皿中加入其中含琼脂10 15 g/L的45 50 'C无菌液态的指示菌培养基，待其凝固，在待筛选菌培养基上接种待筛选菌，培养5 7天时， 再在所述的指示菌培养基上用无菌棉球均匀接种指示菌。所述指示菌、待筛选菌的培养可以 采用现有的方法。指示菌的培养方法配制适合指示菌生长的无菌培养基，其中琼脂10 15 g/L，然后在45 50 'C接入经活化、过夜培养(一般为16小时)的指示菌；所述待筛选菌的 培养，采用适合待筛选菌生长的无菌液态培养基，在适合待筛选菌生长的温度和湿度下进行， 培养时间与待筛选菌的生长特点有关，放线菌(分r印toy^c") —般为5 7天也可以更长； 所述的待筛选菌和指示菌共同培养一般在适合指示菌的温度和湿度下进行，培养时间一般为 与指示菌的生长特点有关，大肠杆菌一般为24小时左右。所述的指示菌可以是大肠杆菌(&c力erc/^'a 、枯草芽孢杆菌(fe"""s 、 金黄色葡萄球菌(5YapAr7oc。cci751 a"reiAS)、铜绿假单胞菌(尸se^y。7z 。朋51 ar柳'"osa)、结 核杆菌(Cb/777e/jacte/7'"历tt/力arc7o〃57'51)等人类致病细菌，或酵母菌(5"acc/ aro/ 7/ces cereWsiae)、念珠菌(ifo/7i7ia)等真核生物，以及其他适合平板培养和观察的菌株等。所述的待筛选菌可以是从环境中分离得到的天然菌株包括放线菌(5Yr印to/^c")、粘细 菌(#/;ra6acteria)、假单胞菌(/^e"c/OT0/7as)，芽孢杆菌(6ac/7J"s)等原核生物，或青霉 菌(尸e/^'ci77i"历)、念珠菌(i/o/7j7i'a)、酵母菌(5^cc力aro/ 7/ces)等真核生物，人工构建文 库中的克隆菌，或者陆地或海洋环境样品的混合菌液。所述的指示菌种可向广东省微生物研 究所菌种保藏中心购买；所述的指示菌的平板培养可以采用常规的培养基，如果采用显色培 养基，抑菌圈将更明显，有助于观察和分辨；所述的抑菌圈可裸眼观测或利用抗生素效价测 量仪测定，如观察有抑菌圈出现，与其相对应的待筛选菌就有拮抗活性。本发明方法能简单、快速而且高通量地筛选出与指示菌拮抗的菌株，而且能够利用环境样品中的菌体混合液(如海绵的浸提液)直接筛选拮抗菌株，有目的地分离菌株，实现分离和筛选一次完成，筛选出的有拮抗作用的菌株与采用目前的方法得到的菌株一致。本发明还能大大减少菌株分离的工作量，提高筛选效率，加快抗生素开发的速度，而且可以大量节省试剂和降低人工成本。根据需要，本发明的筛选装置还可与机械手臂联用，实现高通量筛选
的自动化。
图l:上、下层各具有一个培养皿的装置示意图，其中l表示上盖，2表示上层培养皿，3表示半透过性微孔膜，4表示下层培养皿，5表示下盖。图2:上、下层各具有96个培养皿的装置(上盖己打开)的正面示意图，其中l表示半透 过性微孔膜。图3:上、下层各具有96个培养皿的装置的剖面示意图，其中l表示上盖，2表示下盖，3 表示半透过性微孔膜，4表示上层培养皿，5表示下层培养皿。图4:上、下层各具有96个培养皿的装置(下盖已打开)的背面示意图，其中l表示半透 过性微孔膜。图5:上层具有96个培养皿和下层具有1个培养皿的装置(上盖已打开)正面示意图，其 中l表示半透过性微孔膜。图6:上层具有96个培养皿和下层具有1个培养皿的装置的剖面示意图，其中l表示上盖， 2表示下盖，3表示半透过性微孔膜，4表示上层培养皿，5表示下层培养皿。图7:上层具有96个培养皿和下层具有1个培养皿的装置的背面示意图，其中l表示半透过 性微孔膜。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例中使用的菌种购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。大肠杆菌(^"力erc力j's c。力')GIM1.115,枯草芽孢杆菌(few'77"s s"6"7A) GIM1.181，金黄色葡萄球菌 (5"tap/ y7ococct/s a"_reiAS) GIM1. 178，酉良酒酵母(5"acc/ arcwyces cefeia'siae) GIM2. 86。实施例中的培养基2216E、 ISP4、高氏1号、YED参照培养基手册配置(Atlas RM， Park L C (2000) Handbook of Microbiological Media, CRC Press, Inc., Corporate Blvd. ， N. W.， Boca Raton, Florida 33431)。实施例1:从海绵浸出液中，在分离菌株的同时筛选出与枯草芽孢杆菌有拮抗作用的菌株采用附图2 4所示的装置，每个装置上、下层面积各为120mmX80mm，上层每个培养皿 底部都有直径约4 mm的小孔与下层培养皿相通，其间固定有半透过性微孔膜。打开装置的上盖，在上层96个培养皿中加入无菌的含琼脂15 g/L的改良的2216E液体 培养基，待凝固后4 'C保存备用；将1 g新鲜海绵在10 mL灭菌海水中破碎成小片段，充分混匀后静置5 min取上清，将 上清10倍稀释，依次形成4个梯度，然后取各梯度稀释液100 ii L分别均匀涂抹于上述的上 层培养基上，置于28 'C恒温箱培养7天； 配制LB培养基(其成分为酵母提取粉5 g/L，氯化钠10g/L，细菌蛋白胨10g/L,琼脂IO g/L，培养温度35 37 。C， pH6.8 7.2)，高压灭菌，冷却至约50 。C时加入过夜培养的枯草 芽孢杆菌，摇匀，菌体浓度保持在103 106cfu/mL，打开下盖，倒入上述装置的下层(先把 装置倒置，打开下盖，在上述从南海海绵样品分离纯化的菌株培养7天时倒入)，厚度为O. 5 cm， 静置凝固后，放入28 'C培养箱中过夜；在下层培养基上共发现2个抑菌圈，其中一个抑菌圈对应的孔中只有一个单菌落；将此 单菌落转移至新鲜的2216E固体培养基中继代培养，初步鉴定为念珠菌(ifow7&)。实施例2:从海绵中分离筛选出与金黄色葡萄球菌具有拮抗作用的菌株用2216E培养基从南海海绵样品分离纯化出300多株菌株。采用4个与实施例1相同的装置。打开上盖，在装置的上层培养皿中加入无菌的琼脂IO g/L 的2216E固体培养基，待凝固后盖上上盖，倒置；打开下盖，倒入灭菌后的约50 'C LB液体培 养基(琼脂15g/L，其它条件同实施例l)，待其凝固后盖上下盖，把装置正置；在上层的每 个培养皿中，接种不同的分离菌株，可接入约5 yL菌液或用接种环挑取单个菌落；然后置于 28'C恒温箱中，上盖朝上正置培养14天；取出装置打开下盖，在下层的培养基上用无菌棉球 均匀涂抹金黄色葡萄球菌菌液，晾干后37'C培养过夜，裸眼随时观测抑菌圈的出现；共发现 28个抑菌圈，并查找对应的待筛选菌；经初步鉴定，此28个菌株包括放线菌(5Yrepto/z7/ces)， 假单胞菌(/^e"ob w/7as)，青霉菌(尸e/7icW72'咖)，酵母菌(fecc力ar咖7ces)和芽孢杆菌采用琼脂块法也同样筛选出28个与金黄色葡萄球菌有拮抗作用的菌株，而且两种方法筛 选出的菌株一致。实施例3:从土壤中分离筛选出与酵母菌有拮抗作用的菌株用ISP4培养基从神农架自然保护区收集到的土壤样品中，分离纯化出80多株菌株； 采用一个附图5 7所示的装置，该装置上、下层面积各为120mmX80mm，上层由96个的 培养皿组成，下层为l个带边缘的平板培养皿，上层96个培养皿底部都有直径约6mm的小孔与 下层相通，紧贴各孔固定有半透过性微孔膜，下层盖子用合金材料制成，尺寸为130 mmX90 mmX 10 mm。打开上盖，在装置上层96个培养皿中加入无菌的改良的ISP4培养基(琼脂IO g/L)后接 种。每个培养皿接种不同的分离菌株，可接入约5uL菌液或用接种环挑取单个菌落，将上述 接种后的装置盖上上盖，于28'C恒温箱培养15天。配制YED培养基(琼脂10g/L)，高压灭菌，冷却至50'C时加入过夜培养的酿酒酵母菌， 摇匀，菌体浓度保持在104CFU/mL，倒入上述装置的下层，厚度为0.5cm。静置凝固后，放入 3(TC培养箱中过夜。利用抗生素效价测量仪测定下层指示菌培养基中出现的抑菌圈，共发现 7个与酿酒酵母菌有拮抗作用的菌株；此7个菌株初步鉴定包括放线菌(5Yre/^o/ y^es)，假单
胞菌(Pseudomonas);采用琼脂块法，也同样筛选出7个与酿酒酵母菌有拮抗作用的菌株，而且两种方法筛选出 的菌株一致。实施例4:从文库中筛选出与大肠杆菌有拮抗作用的克隆用穿梭载体pOJ446 ( Bierman M et al. Gene， 1992， 116(1) :43-49.)构建了海绵的 宏基因组文库。将此文库质粒转移到链霉菌中，得到了400个克隆。 采用实施例1所示的装置5个。打开装置上盖，在各装置上层96个培养皿中加入无菌高氏固体1号培养基(琼脂IO g/L) 厚度为0.5cm左右，将400个克隆分别接种到各培养皿中，将接种后的装置盖上上盖，置于28 'C恒温箱培养7天。配制LB培养基(琼脂15 g/L，其它条件同实施例l),高压灭菌，冷却至50 。C时，加入 5-溴-4-氯-3-吲哚-e-D-半乳糖苷(其终浓度为0.05 mg/mL)和大肠杆菌(培养基中菌体浓度 为10、fu/mL)，摇匀，倒入装置的下层(先把装置倒置，打开下盖，在上述从南海海绵样品 分离纯化的菌株培养5天时倒入)，厚度为0.5 cm。静置凝固后，放入37 'C培养箱中过夜， 裸眼观测下层指示菌培养基中出现的抑菌圈，共发现l个与大肠杆菌有拮抗作用的菌株。采用琼脂块法，也同样筛选出l个与大肠杆菌有拮抗作用的菌株，而且两种方法筛选出的 菌株一致。
权利要求
1.一种用于筛选抗生素产生菌的装置，其特征是具有上层和下层培养皿，层间用半透过性微孔膜隔开。
2. 根据权利要求l所述的一种用于筛选抗生素产生菌的装置，其特征是所述的上层或下 层培养皿可以是1个或者1个以上。
3. 根据权利要求2所述的一种用于筛选抗生素产生菌的装置，其特征是上层的培养皿为 上大下小的形状。
4. 根据权利要求3所述的一种用于筛选抗生素产生菌的装置，其特征是所述上层的培养 皿形状是上为方形和下为倒圆梯形。
5. 根据权利要求1或2或3或4所述的一种用于筛选抗生素产生菌的装置，其特征是还 具有一个上盖和一个下盖。
6. 根据权利要求5所述的一种用于筛选抗生素产生菌的装置，其特征是所述的半透过性 微孔膜的孔径为0.2 3um。
7. —种用权利要求1 6所述任一装置筛选抗生素产生菌的方法，其特征是在所述的装 置其中一层培养皿中加入含琼脂10 15g/L的无菌液态的待筛选菌培养基，待其凝固后，接 种待筛选菌进行培养足够时间后，在另一层培养皿中接种指示菌，然后将分处两层由半透过 性微孔膜隔开的待筛选菌和指示菌共同培养，观察指示菌培养基中是否出现抑菌圈。
8. 根据权利要求7所述装置筛选产抗生素菌株的方法，其特征是所述的指示菌培养过夜 后接种到45 50 。C无菌液态含琼脂10 15 g/L的指示菌培养基中，菌浓度达102 106 cfu/mL，在待筛选菌培养5 7天时，再加入另一层培养皿中，或在所述的待筛选菌培养基凝 固后，在另一层培养皿中加入其中含琼脂10 15 g/L的45 50 "C无菌液态的指示菌培养基， 待其凝固，在待筛选菌培养基上接种待筛选菌，培养5 7天时，再在所述的指示菌培养基上 用无菌棉球均匀接种指示菌。
9. 根据权利要求7或8所述筛选抗生素产生菌的方法，其特征是所述的待筛选菌是从环 境中分离得到的天然菌株包括原核生物，真核生物或人工构建文库中的克隆菌；所述指示菌 是人类致病细菌或真核生物。
10. 根据权利要求9所述筛选抗生素产生菌的方法，其特征是所述的待筛选菌原核生物 是放线菌(5Yr印to迈/ces)、粘细菌(ify;ro力acz^ria)或假单胞菌(/^euob/z o朋s)，所述的待 筛选菌真核生物是青霉菌(尸e/w'^7力'，)、念珠菌(i/w^7ia)或酵母菌(5scc力a/^ /ce5)， 所述的指示菌人类致病细菌是大肠杆菌(&c力erc力ia ""')、枯草芽孢杆菌(5sw7^as 励"7A)、金黄葡萄球菌(5"t邵力/kocc〃s awre〃s)、铜绿假单胞菌尸se油/77。朋s ar柳V osa) 或结核杆菌(6b/y/7e/^cter^y/T7 t"6erc化i/w's)所述的指示菌真核生物是酿酒酵母菌(5"acc/ ara77/ces cereKis^'se)或念珠菌(#o"Ws)。
全文摘要
本发明涉及一种筛选抗生素产生菌的方法及其装置，其特征是用于筛选抗生素产生菌的装置具有上层和下层培养皿，层间用半透过性微孔膜隔开，先在该装置其中一层培养皿中加入含琼脂10～15g/L的无菌液态的待筛选菌培养基，待其凝固，接种待筛选菌进行培养足够时间后，在另一层培养皿中接种指示菌，然后将分处两层由半透过性微孔膜隔开的待筛选菌和指示菌共同培养，观察指示菌培养基中是否出现抑菌圈。本发明方法能简单、快速而且高通量地筛选出与指示菌拮抗的菌株，而且能够利用环境样品中的菌体混合液(如海绵的浸提液)直接筛选拮抗菌株，实现分离和筛选一次完成，大大减少菌株分离的工作量，提高筛选效率，并大量节省试剂和降低人工成本。
文档编号C12M1/34GK101148641SQ20071002960
公开日2008年3月26日 申请日期2007年8月6日 优先权日2007年8月6日
发明者姜淑梅, 戴世鲲, 翔 李, 欧阳永长, 岭 秦, 谢练武 申请人:中国科学院南海海洋研究所