重组vpac1受体特异激动剂rvpac1-a及其表达方法与应用的制作方法

专利名称：：重组vpac1受体特异激动剂rvpac1-a及其表达方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种重组VPAC1受体特异激动剂RVPAC1-A及其表达方法与应用。技术背景VPAC1受体属于G蛋白偶联受体家族，是7次跨膜蛋白，是PACAP和VIP共同受体，它对VIP和PACAP具有同样的亲和力，VPAC1受体在机体内分别广泛在中枢及周围神经系统，肾上腺，胰腺，睾丸，卵巢，肠道，血管等多个内分泌、消化、循环及生殖等系统、器官与组织均有分布，而且介导多种重要的生物学功能。例如KojimaM等通过急性胰腺炎实验发现，VPAC1特异激动剂能够明显地降低血清淀粉酶，IL-6，TNF，并且呈剂量依赖型降低，能够减轻急性胰腺炎胰腺炎的症状，而VPAC2特异激动剂则起相反的作用。而MRNicol等发现，VIP刺激H295人类肾上腺皮质癌细胞后能促进肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素分泌，且呈剂量依赖型分泌。用VPAC1特异激动剂刺激H295的效果与VIP相似，而VPAC2特异激动剂的作用却不明显。用VIP刺激H295人类肾上腺皮质癌细胞后，real-timePCR检测到VPAC1受体转录本的量是PAC1受体的IOOO倍，因此他们推断VIP刺激H295细胞分泌肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素是通过VPAC1受体介导的。Tamalcawa等发现应用链脉佐菌素(50mg/kg)制备糖尿病大鼠，胰腺的PACAP免疫活性物质增加30%在其他组织中，只有下丘脑中PACAP免疫活性物质增加10%。逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)分析发现在链脉佐菌素诱导的糖尿病大鼠的胰腺组织中，VPAC1-R的mRNA相对于其他两种受体的mRNA显著增加，表明PACAP和VPAC1-R可能与了糖尿病高血糖的病理生理过程有关。另有研究发现VPAC1受体与T细胞感染HIV-1病毒的效率有关。综上可见，VPAC1受体具有调节免疫，能量代谢，内分泌等多种重要的生物学功能。VPAC1受体特异激动剂在VPAC1受体研究及应用方面具有巨大的价值。目前有多条已报道的VPAC1受体特异激动剂①[K15，R16，L27]VIP(l-7)/GRF(8-27)由VIP和GRF为基础突变而来，主要与VPAC1结合，PHILIPPEGOURLET等人通过研究证明此短肽对小鼠和人的VPAC1受体都具有非常高的亲和力，而对PAC1及VPAC2受体的亲和力非常低，是最为经典的VPAC1受体特异激动剂。②[Alall，22，28]VIP由VIP的ll，22，28位氮基酸突变而来，PascalNicole等[56]人证实，[Alall，22,28]VIP对VPAC1受体的亲和力高于其对VPAC2受体的亲和力1000倍以上。③[R(16)〗誦PACAP(l-27)由PACAP27第16位氨基酸突变为R获得，依赖VPAC1的穿膜区起作用。[L(22)]-VIP由VIP第22位氨基酸突变获得，依赖VPACl的N端膜外区起作用。此外已报导的VPACl受体特异激动剂还有[Tyr9,Dipl8]VIP(l-28);VIP(4—28);VPACl的特异拮抗剂[Acetyl-Hisl,D-Phe2，Lysl5,Argl6]VIP(3國7)GRF(8-27)-NH2。以上所有多肽均采用化学合成，目前没有应用生物工程技术和原理，实现以上任何多肽高效制备的方法的报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种重组VPACl受体激动剂RVPACl-A。本发明的另一个目的是提供上述重组VPACl受体激动剂RVPACl-A的表达方法。本发明的进一步目的是提供上述重组VPACl受体激动剂RVPACl-A的应用。根据RVPACl-A的氨基酸序列，设计在原核表达的基因，采用基因工程的原理和技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽的高效制备。具体包括如下步骤(1)设计并合成RVPACl-A基因序列，如SEQIDNO:l所示。采用3条引物两步法合成RVPACl-A基因引物Fl和F2进行链延伸反应；然后以其产物为模板，以F1和F3为引物，进行PCR;所述引物Fl-3的核苷酸序列如下所示Fl:丽NNNN丽GCTCTTCTAACCATAGCGATGCGGTGTTTACCAACAGCTATCGTAAAF2:CAGCAGTTTACGCGCGCTCAGACGTTTCAGCACTTTACGATAGCTGTTGGTAAAF3:NNNNNNNNCTGCAGTCATTACAGAATATCTTGTAACAGTTTACGCGCGCTCAG其中，N代表保护碱基，GCTCTTCTAAC为S甲I酶切位点，CTGCAG为尸"I酶切位点(2)用Sfl/I和尸M进行酶切，将RVPAC1-A基因隆到质粒pTWINl的和PWI位点间，构建重组质粒pTWIN-RVPACl-A;(3)两个重组质粒转化表达宿主菌co/z'StrainER2566，构建表达工程菌pTWIN-RVPACl-A-ER;(4)诱导剂IPTG诱导由几丁质结合域(Chitinbindingdomain,CBD)、蛋白内含肽和目的多肽组成的"三元"融合蛋白的表达；(5)融合蛋白经几丁质柱纯化，改变pH值(从8.5到7.0)和温度(从4'C到25")诱导蛋白内含肽的C端切割，释放目的多肽；(6)超滤除去大蛋白，透析除盐，对目的多肽进行纯化。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果我们首次发现在3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中VPAC1受体特异高表达，显示了VPAC1受体与糖、脂代谢密切相关。之后利用高脂高糖喂养KM小鼠制备营养型肥胖模型，在模型制备过程及制备后注射VPAC1受体激动剂RVPAC1-A，发现无论在肥胖过程还是肥胖形成后，RVPAC1-A均能有效地降低肥胖小鼠的体重，体内脂肪的积存，降低血糖和血脂，增加机体的糖耐受的能力；显示重7组的VPAC1受体激动剂RVPAC1-A具有抑制和治疗肥胖及肥胖相关疾病的功能。在细胞水平上的深入研究发现..RVPAC1-A不仅有效促进前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，而且促进原代的脂肪细胞的脂解作用。而已有研究显示VPACl介导肾上腺皮质激素的分泌；因此作为VPACl受体激动剂RVPAC1-A可能是通过调节相关激素分泌间接地，以及直接作用能量相关细胞或组织，从多个层次发挥其整体的降脂减肥的生物学功能的。本发明利用了基因工程的技术，采用具有可诱导切割功能的蛋白内含肽(intdn)实现了重组的VPACl特异激动剂的高效制备。利用此工艺，lg发酵产物可获得2mg的重组多肽，与化学合成相比，效率高，成本低。图1为RVPACl-A的制备示意图；图2为RVPACl-A基因的合成示意图；图3为pTWIN-RVPACl-A质粒的构建示意图；图4为pTWIN-RVPACl-A质粒的测序鉴定图；图5为SDS-PAGE检测融合蛋白的表达及RVPACl-A的制备；图6为RVPACl-A飞行质谱检测结果；图7为高脂高糖喂养过程用RVPACl-AVPACl对小鼠体重的影响；图8为高脂高糖喂养过程用药，各组小鼠脂肪湿重比较；图9为高脂高糖喂养过程用RVPACl-AVPACl对小鼠生化指标的影响；图10为肥胖小鼠模型成型后用RVPACl-A对小鼠体重的影响；图11为RVPAC1-A治疗肥胖实验各组小鼠平均体重增长率比较；图12为RVPAC1-A治疗肥胖实验各组小鼠脂肪湿重比较；图13为RVPAC1-A治疗肥胖实验各组小鼠生化指标的比较；图14为RVPAC1-A抑制肥胖实验组小鼠的糖耐受曲线图；图15为RVPAC1-A治疗肥胖实验组小鼠的糖耐受曲线图；图16为Westenblot检测脂肪细胞分化前后VPAC1受体表达情况；图17为不同浓度的RVPAC1-A对原代脂肪细胞的降脂作用。其中，图5中，1，Marker;2，未诱导表达；3，IPTG诱导表达；4，上样流出液；5、6，洗柱流出液；7，切割buffer流出液；8，目的多肽收集液；9，SDS洗柱流出液。具体实施方式实施例1重组VPAC1受体特异激动剂RVPAC1-A的制备l.RVPACl-A基因的制备具体见图1，按大肠杆菌的密码偏好性设计编码RVPAC1-A的基因；设计3条引物，采用两步法获得RVPAC1-A的基因(如图2):①链延伸反应引物F1(0.1A/uL)5uLl，F2(0.1A/uL)5yL，10XTaKaRaLABuffer(含有4mMMgCl2),10tiL，dNTP16yL，H2063tiL，94°C，10min;降至55°C，力口TaKaRaLATaq酶1uL，保温5min;72°C,5min;所得为延伸反应液。②PCR反应弓i物Fl(0.01A/PL)luL，F3(0.01A/pl)lnL，延伸反应液1uL，dNTP10ixL，10XTaKaRaExBuffer10uL，TaKaRaExTaq酶1yL，H2076uL，94°C，4min;94°C，45sec、55°C，45sec、72°C，60sec,35个循环；72°C，10min;获得产物经进一步纯化，为RVPACl-A基因。Fl:NNNNNN顧GCTCTTCTAACCATAGCGATGCGGTGTTTACCAACAGCTATCGTAAAF2:AAAF3:NNNNNNNNCTGCAGTCATTACAGAATATCTTGTAACAGTTTACGCGCGCTCAG其中，N代表保护碱基，GCTCTTCTAAC为^pl酶切位点，CTGCAG为酶切位点。2.用S"/I和Pwl进行酶切，将RVPAC1-A基因克隆到质粒pTWINl的^/I和/^I位点间，构建重组质粒pTWIN-RVPACl-A，构建图如图3，测序鉴定图如图4。3.重组质粒pTWIN-RVPACl-A转化表达宿主菌E.co//StrainER2566，构建表达工程菌pTWIN-RVPACl-A-ER;挑取单克隆于5mL含50昭/mL卡那霉素的LB培养基，摇菌培养过夜，以1:20接于1L含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37。C摇菌至OD6。。为0.5-0.8，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，30。C诱导4h。离心收集菌体，重悬于60mL的溶液A(20mMTris.HCl,500mMNaCl，lmMEDTA，pH8.5)，然后超声破碎，20,000g离心30min，收集上清。取10mL几丁质珠装填2.5X10cm层析柱，不少于10倍体积的溶液A(20mMTris-HCl，0.5MNaCl,1mMEDTA,pH8.5)洗柱；以0.5mL/min的流速上破碎上清；大于10倍体积的溶液A以1mL/min洗去杂蛋白，30mL溶液B(20mMTris-HCl，0.5MNaCl,1mMEDTA,pH7.0)快速过柱，使溶液均匀分布并浸泡柱内填料，取填料浸泡液测pH值，看是否达到pH7.0。25。C诱导蛋白肽切割24h。溶液B洗脱目的多肽，收集一个柱体积的洗脱液。SDS-PAGE鉴定目的多肽。采用滤过分子量为10kD的超滤管滤除大分子蛋白杂蛋白。RVPAC1-A制备过程的SDS-PAGE检测如图5。重组RVPAC1-A经过飞行质谱检测，分子量为3174.7，与理论值相符(图6)。实施例2重组多肽RVPAC1-A抑制肥胖的功能清洁级(SPF级)KM雄性小鼠，由广东省实验动物中心提供，鼠龄为35天左右，体重25士3g，许可证号为SCXK(粤)2003—0002，粤鉴证字2006A018。OneTouchUltra血糖自动分析仪(美国JOHNSON公司)；肥胖饲料(配方普通饲料55%,猪油12%，蔗糖5%,全脂奶粉10%，花生5%,黄豆粉5%,蛋黄粉5%，麻油1%，食盐2%，鱼肝油少量)由广东省实验动物中心加工制成。将正常KM雄性小鼠按体重随机分为4组空白对照组，肥胖对照组，RVPAC1-A低剂量组，RVPAC1-A高剂量组，每组十只，除空白对照组喂食普通词料外，其余各组喂食肥胖饲料，自由饮水。低剂量组按5nmol/kgd的剂量腹腔注射VPAC1特异激动剂，高剂量组按50nmol/kg.d的剂量腹腔注射VPAC1特异激动剂，肥胖对照组注射相同体积的溶媒(生理盐水)。35d后各组小鼠称重，眼眶取血(实验前空腹24小时)，离心分离血清，小鼠脱臼后解剖，取腹部(睾丸及肾周围)脂肪称湿重并计算脂肪系数，血清送广东药学院附属第一医院测定血糖，甘油三酯，总胆固醇，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白。结果显示(见表l，图7):实验35天后，肥胖对照组的小鼠体重高于空白对照组的小鼠(pO.05);低剂量组小鼠体重明显低于肥胖对照组(p<0.01),但和空白对照组没有明显差别(p〉0.05);高剂量组小鼠体重明显低于肥胖对照组(p<0.01)和空白对照组(p〈0.01)，并且高剂量组小鼠体重也低于低剂量组(pO.Ol)。结果表明，VPAC1特异激动剂能够有效缓解小鼠的体重增长(图7)，降低小鼠的体重增长率，且呈现剂量依赖性。实验过程中发现肥胖对照组小鼠的体形偏胖，而低剂量组的小鼠体形消瘦。对体内脂肪检测发现(表2，图8):肥胖对照组小鼠的脂肪湿重明显高于空白对照组(pO.Ol)，低剂量组小鼠的脂肪湿重低于肥胖对照组(pO.Ol)，但与空白对照组没有明显差别(p>0.05)。高剂量组的脂肪湿重明显低于肥胖对照组(pO.Ol)，也低于空白对照组(0.01<p<0.05)，高剂量组的脂肪湿重明显低于低剂量组(pO.Ol)。对血液中各项生化指标的检测结果(表3，图9)，高剂量组小鼠的空腹血糖浓度比空白对照组、肥胖对照组、低剂量组均低(p<0.01);肥胖对照组小鼠的血清胆固醇浓度高于空白对照组(pO.01);高、低剂量组小鼠的血清胆固醇均低于肥胖对照组(p<0.01)，高、低剂量组之间的血清胆固醇浓度没有明显差别(p>0.05)。肥胖对照组小鼠的甘油三酯浓度高于空白对照组，但不显著(p〉0.05)。高、低剂量组小鼠的血清甘油三酯浓度均低于肥胖对照组(p<0.01)。肥胖对照组小鼠的血清低密度脂蛋白浓度高于空白对照组(p<0.05)，低剂量组的小鼠的血清低密度脂蛋白浓度低于肥胖对照组(p<0.05)，高剂量组低剂量组的小鼠的血清低密度脂蛋白浓度明显低于肥胖对照组(p<0.01)。表l.高脂高糖喂养过程用RVPAC1-A对小鼠体重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注*p<0.05vs空白对照组；**p<0.01vs肥胖对照组；表2.高脂高糖喂养过程用RVPAC1-A对小鼠脂肪湿重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注**P<0.01VS肥胖对照组；ApO.01vS空白对照组:表3.咼月旨咼)瞎喂养过程用RVPAC1-A对小鼠生化指标的影响单1立mmol/L<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>高剂量组2.91±0.96**4.41±1.09**0.73±0.12**1.08±0.58**注ApO.OlVS空白对照组；*P<0.05VS肥胖对照组；**p<0.01VS肥胖对照实施例3重组多肽RVPAC1-A治疗肥胖的功能检测将KM正常雄性小鼠按体重随空白对照组和肥胖组，空白对照组喂食普通饲料，其余全部喂食肥胖词料，自由饮水。开始喂食前测量体重，35天后测量体重。将成模的肥胖动物按体重随机分为肥胖对照组，低剂量组，高剂量组，继续给予肥胖饲料，低剂量组按5nmol/kg.d的剂量腹腔注射VPAC1特异激动剂，高剂量组按50nmol/kg.d的剂量腹腔注射VPAC1特异激动剂，肥胖对照组注射相同体积的溶媒(生理盐水)。30d后各组小鼠称重，眼眶取血(实验前空腹24小时)，离心分离血清，小鼠脱臼后解剖，取腹部(睾丸及肾周围)脂肪称湿重并计算脂肪系数，血清送广东药学院附属第一医院测定血糖，甘油三酯，总胆固醇，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白。肥胖小鼠造模实验结果见表4，实验开始时，空白对照组小鼠体重和肥胖对照组没有明显差别(p〉0.05)。实验35天后肥胖组小鼠体重明显高于空白对照组(pO.Ol)，肥胖组小鼠的平均体重比空白对照组高10%以上。表4.肥胖組.小鼠与空白对照组小鼠体重比较组别鼠数(只)初体重终体重空白对照组1025.24±1.8737.51±1.81肥胖组5024.32±1.5541.46±3.71**注**p<0.01vs空白对照组造模成功后用重组多肽RVPAC1-A，低剂量组小鼠的平均体重低于肥胖对照组，但统计学意义上不显著，高剂量组小鼠体重明显低于肥胖对照组(p<0.05)，高剂量组小鼠平均体重低于低剂量组小鼠，但统计学意义上也不显著。对各组小鼠的体重增长率分析表明，VPAC1特异激动剂能够有效治疗小鼠的肥胖症状，降低小鼠的体重增长率(表5，图IO，图ll)。表5.肥胖小鼠模型成型后用RVPAC1-A对小鼠体重的影响组别鼠数(只)初体重终体重空白对照组1037.51±1.8142.07±1.62肥胖对照组1041.66±4.0847.58土3.93A低剂量组1041.65±4.3445.46士4.75高剂量组1041.08±2.9442.97±2,66*注△p<0.01vs空白对照组*p<0.05vs肥胖对照组对体内脂肪重量测定发现肥胖对照组小鼠的脂肪湿重高于空白对照组小鼠(p<0.05)，低剂量组小鼠的脂肪湿重低于肥胖对照组(p<0.05)，高剂量组的脂肪湿重明显低于肥胖对照组(p<0.01)(表6，图12)。表6肥胖小鼠模型成型后用RVPAC1-A对小鼠脂肪湿重的影响组别鼠数(只)脂肪湿重空白对照100.707±0.317<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注ApO.01vS空白对照组；*P<0.05VS肥胖对照组；**p<0.01VS肥胖对照对血液各项生化指标的检测结果(表7，图13)发现肥胖对照组小鼠的血糖浓度明显高于空白对照组小鼠(p<0.01)，高、低剂量组小鼠的血糖浓度均明显低于肥胖对照组(p<0.01)。肥胖对照组小鼠的血清胆固醇浓度与空白对照组小鼠没有明显差别(p〉0.05);低剂量组小鼠的血清胆固醇浓度稍低于肥胖对照组，但是统计学意义不显著，高剂量组小鼠的血清胆固醇浓度低于肥胖对照组小鼠(p<0.05)。肥胖对照组小鼠的平均甘油三酯浓度高于空白对照组，但统计学意义上不显著(p〉0.05)。高、低剂量组小鼠的平均血清甘油三酯浓度均低于肥胖对照组，但统计学意义上不显著(p>0.05)。肥胖对照组小鼠的血清低密度脂蛋白浓度高于空白对照组，但统计学意义上不显著(p〉0.05)，低剂量组的小鼠的血清低密度脂蛋白浓度低于肥胖对照组，但统计学意义上不显著(p>0.05)，高剂量组低剂量组的小鼠的血清低密度脂蛋白浓度明显低于肥胖对照组(p<0.01)。表7.肥胖小鼠模型成型后用RVPAC1-A对对小鼠生化指标的影响单位:mmol/L<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>p〈0.01vs空白对照组；*p<0.05vs肥胖对照组；**pO.Olvs肥胖对照实施例4重组多肽RVPAC1-A提高肥胖小鼠糖耐受的功能检测在高脂高糖喂养小鼠制备肥胖模型过程中及肥胖模型成型后，分别用重组VPAC1特异激动剂RVPAC1-A以5nmol/kg的低剂量及50nmol/kg的高剂量腹腔注射实验KM小鼠，溶媒作为空白对照，连续注射15天，空腹12小时，检测当天不注射样品及对照，只直接以葡萄糖(10mmol/kg)作腹腔注射，注射前及注射15min、30min、60min后，尾部采血测定小鼠血糖。1)在抑制肥胖实验组中，小鼠连续注射RVPAC1-A15天后的血糖耐受性的测定结果见表8，图14。结果显示与空白对照组相比，高、低剂量的RVPAC1-A均有具有显著协助机体降低血糖的功能(pO.Ol)。表8.RVPAC1-A抑制肥胖实验组小鼠糖耐受检测<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>根据ManamiTsutsumi等人的计算方法AUC(theglucoseareaunderthecurve)=(PGO+PG60)/2+PG15+PG30，PGO，PG15，PG30，PG60分别是注射前，注射15min，30min，60min后的小鼠血糖浓度，对theintraperitonealglucosetolerancetest(IPGTT)的实验结果，按公式AUC=(PGO+PG60)/2+PG15+PG30计算每只老鼠的"theglucoseareaunderthecurve(AUC)"，得出(表9):低剂量组小鼠AUC低于对照组(p<0.05)，高剂量组小鼠AUC显著低于对照组(pO.Ol)，且高剂量组与低剂量组之间也有显著差异(pO.Ol)。表9.RVPAC1-A抑3則肥胖实验组小鼠的IPGTT实验的AUC值比^咬<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注*p<0.05vscontrolgroup;**p<0.01vscontrolgroup;2)在治疗肥胖实验组中，小鼠连续注射RVPAC1-A15天后的血糖耐受性的测定结果见表10，图15。结果显示与空白对照组相比，高、低剂量的VPAC1特异激动剂具有协助机体降低血糖的功能(p<0.05)。表10.RVPAC1-A治疗肥胖实验组的小鼠糖耐受的检测<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>按公式AUC=(PGO+PG60)/2+PG15+PG30计算每只老鼠的"theglucoseareaunderthecurve(AUC)"，得出以下结果(表ll)，低剂量组小鼠AUC低于对照组(p<0.05)，高剂量组小鼠AUC显著低于对照组(p<0.01)，且高剂量组与低剂量组之间也有显著差异(pO.Ol)。表11.RVPAC1-A治疗肥胖实验组的小鼠的IPGTT实验AUC值比较<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注*p<0，05vscontrolgroup;**p<0.01vscontrolgroup;实施例5重组多肽RVPAC1-A诱导脂肪细胞分化及促进脂解的功能检测(1)VPAC1受体在脂肪细胞的表达检测根据3T3-L1前脂肪细胞培养和诱导分化方案，用完全培养液(DMEM+10%胎牛血清)，在37T孵箱(5%(:02，95%空气)中培养细胞，每2天换液1次待细胞生长至完全融合后2天(第0天)开始诱导分化具体步骤为:将培养液换成含0.5mmol/LMIX，lfimol/L地塞米松和5mg/L胰岛素的完全培养液；48h后，撤去MIX和地塞米松，使完全培养液中只含有5mg/L胰岛素；以后每2天换液1次，至第9天撤去胰岛素，使用不含有任何诱导剂的完全培养基;至第10天，95%以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞，用油红O染色法对脂肪细胞进行鉴定。同时用完全培养液(DMEM+10%胎牛血清+青、链霉素100U/ml)，在37^孵箱(5%0)2,95%空气)中培养3丁3丄1前脂肪细胞，每两天换液1次，培养时间和诱导分化时间相同。2000rpm离心收集3T3-L1前脂肪细胞及3T3-L1脂肪细胞，westenblot检测3T3-L1前脂肪细胞及3T3-L1脂肪细胞中VAPC1受体的表达量。结果显示VPAC1受体在诱导分化成脂肪细胞后表达量明显提高(图16)，揭示VPAC1与脂肪细胞分化及代谢密切相关。(2)促进脂肪细胞分化实验小鼠前脂肪细胞3T3-L1在分化培养基(含l|iM地塞米松，5pg/ml胰岛素和0.5mMIBMX)的条件下会分化为脂肪细胞。由于脂肪细胞分化完全后含有大量的油，可以采用油红染色的方法检测油量的多少，并以此作为脂肪细胞分化程度的标志。根据公式计算R二OD样品一ODo/OD对照一ODo，OD对照为正常分化组的油红OD值，ODo为未分化组的油红OD值，如果R〉1说明样品对脂肪分化有促进作用，如果R<1说明样品对脂肪分化有抑制作用。在正常诱导方案的基础上，分别加入10nM，1000nMRVPAC1-A，用油红O染色检测分化情况，结果显示(表12)，10nM和1000nMVPAC1特异激动剂能促进前脂肪细胞的分化(p<0.01)，但10nM和1000nM两个浓度之间没有显著差异(p<0.05)。表12.不同浓度的VPACl特异激动剂促进前脂肪细胞分化的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(3)降脂实验取KM小鼠附睾的脂肪垫，去除其它组织，特别是血管和纤维样组织，用PBS清洗干净，然后用胶原酶消化，37。C培养lh，过滤，离心(500rpm)得脂肪细胞。用生理盐水重悬细胞，分别加入RVPAC1-A至终浓度为lnM/l()6个细胞，10nM/l()6个细胞,100nM/106个细胞，1000函/106个细胞。37。C孵育30min，150rpm。然后置冰上20min，用甘油检测试剂盒测定甘油含量。结果显示(表13，图17)，1M的RVPAC1-A跟对照组相比没有明显的降脂作用，10nM、100nM、1000nM的RVPAC1-A特异激动剂都有明显的促进原代脂肪细胞降脂的作用(pO.Ol)，但10nM、100nM、1000nM的RVPAC1-A特异激动剂各组之间的降脂作用没有明显.区别(p>0.05)。表13.不同浓度的RVPAC1-A处理原代脂肪细胞后释放的甘油量<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>〈110〉<120>〈130><腸〈170〉〈210〉<211〉<212〉<213〉Untitled.ST25.txtSEQUENCELISTING暨南大学重组VPAC1受体特异激动剂RVPAC1-A及其表达方法与应用Patentlnversion3.2181DNA人工序列〈220><221>CDS<222>(1)..(81)〈400〉1C3t3gCg3tHisSerAsp1gcggtgtttaccaacagetatAlaValPheThrAsnSerTyr510cgtaaagtgctgaaacgtArgLysValLeuLysArg1548ctgagegcgcgtaaactgttacaagatattctgLeuSerAlaArgLysL.euLeuGinAsplieLeu202581<210〉2〈211〉27<212〉PRT<213>人工序列<咖>2HisSerAspAlaValPheThrAsnSerTyrArgLysValLeuLysArg151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGinAsplieLeu2025<210><211>〈212〉<213〉DNA引物<400〉3Fl:NN鹏丽NGCTCTTCTAACCATAGCGATGCGGTGTTTACCAACAGCTATCGTAAAF2:CAGCAGTTTACGCGCGCTCAGACGTTTCAGCACTTTACGATAGCTGTTGGTAAAF3:顺ffl丽NNCTGCAGTCATTACAGAATATCTTGTAACAGTTTACGCGCGCTCAG权利要求1.重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2.编码权利要求1所述重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A的核苷酸序列，如SEQIDNO:l所示。3.—种权利要求1所述重组VPAC1受体特异激动剂RVPAC1-A的表达方法，其特征在于包括如下步骤(1)设计并合成RVPAC1-A的基因；(2)将RVPAC1-A基因克隆到质粒pTWINl的和尸M位点间，构建重组质粒pTWINl-RVPACl-A;(3)重组质粒转化表达宿主菌Eco/z'StrainER2566，构建表达工程菌pTWINl-RVPACl-A-ER;(4)用诱导剂IPTG诱导由几丁质结合域、蛋白内含肽和目的多肽组成的"三元"融合蛋白的表达；(5)融合蛋白经几丁质柱纯化，改变温度及pH值诱导蛋白内含肽的C端切割，释放重组目的多肽。4.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于步骤(1)所述的RVPAC1-A基因如SEQIDNO:l所示。5.权利要求1所述重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A在制备治疗VPAC1受体相关疾病药物中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述VPAC1受体相关疾病为肥胖、免疫失调、内分泌调节、脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、记忆损伤、痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纤维化、与生物钟睡眠及痛觉相关的疾病、动脉硬化、糖尿病、胃肠功能紊乱、肌萎縮症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭或脱发。全文摘要本发明公开了一种重组VPAC1受体特异激动剂RVPAC1-A及其表达方法与应用。本发明的重组多肽RVPAC1-A是新型的重组的VPAC1受体的特异激动剂，鉴于VPAC1作为PACAP和VIP共同的受体，在中枢神经系统、周围神经系统，消化系统，肾上腺，胰腺及生殖系统等多个系统广泛分布，介导多种重要的生物学功能；因此VPAC1受体激动剂RVPAC1-A在VPAC1受体密切相关的疾病的诊断和治疗方面具有巨大的应用潜力。本发明还首次发现利用该重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A有效抑制及治疗营养性肥胖及其相关疾病，显示其具有预防与治疗肥胖的作用；此生物学功能的发现具有巨大的应用价值。利用本发明的表达方法的制备重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A与化学合成的方法相比，具有效率高、成本低的特点，应用前景广阔。文档编号C12N1/21GK101125883SQ20071002928公开日2008年2月20日申请日期2007年7月20日优先权日2007年7月20日发明者余榕捷,岸洪申请人:暨南大学