一种质粒提取试剂盒及提取方法与流程

[0001]
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种质粒提取试剂盒及提取方法。


背景技术：

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质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，细菌质粒是重组dna技术的最常用载体之一。因为其自我复制能力和携带的遗传信息在重组dna操作中对基因工程研究及其下游的应用是非常实用和极具价值的。传统的大量质粒提取的试剂盒或试剂会存在污染，一是细菌基因组dna污染；二是在提取过程中需要加入氯仿-异丙醇，提取的细菌质粒会存在有机试剂的污染。目前，国际和国内的一些试剂公司开发的质粒提取试剂盒用回收柱来回收质粒dna，但是，难以在保证质粒dna的产量的同时保证质粒dna的质量及纯度，导致目前大部分的质粒提取试剂盒提取的质粒具有浓度低及纯度不够等缺点。所以，需要开发一种既能够提高质粒的产量，又能够保证质粒纯度的质粒大量提取试剂盒。


技术实现要素：

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发明目的：本发明提出了一种质粒大量提取试剂盒，通过将离心柱的优点与经典的强碱-sds裂解细菌细胞法结合起来使质粒dna样品在离心力下流过柱子时，结合到纯化柱上，在一定条件下又能在dna充分洗脱的同时将质粒内毒素去除，从而实现质粒的快速提取及纯化，整个过程无需酚氯仿抽提，可以获得高纯度质粒dna，可满足真核细胞转染的使用。
[0004]
为实现上述目的，本发明提供了一种质粒提取试剂盒，包括s i缓冲液、s ii缓冲液、s iii缓冲液、ps清洗液、洗脱缓冲液、te缓冲液以及离心柱，其中，s i缓冲液用于重悬菌体，提供缓冲环境；s ii缓冲液用于裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔,释放细胞内的质粒；s iii缓冲液中和s ii缓冲液碱性，使质粒复性；ps清洗液用于去除蛋白和内毒素；洗脱缓冲液用于清洗质粒dna；te缓冲液用于溶解质粒dna；
[0005]
具体地，si缓冲液为1m tris-hcl，0.5m edta和1m葡萄糖，ph＝8.0；
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s ii缓冲液为2m naoh和10％sds；
[0007]
s iii缓冲液为3m乙酸钾、2-3m盐酸胍和2m乙酸，ph＝3.6-4.2；
[0008]
所述离心柱为小孔径硅胶膜吸附柱，在使用前使用ph＝6.4的pbs缓冲液对硅胶膜吸附柱进行酸化处理。
[0009]
优选地，所述ps清洗液组分如下：5-10％tritonx-114的异丙醇溶液。
[0010]
所述洗脱缓冲液组分如下：75％乙醇。
[0011]
所述te缓冲液，组分如下：100mm tris和10mm edta，ph 8.0。
[0012]
优选地，所述离心柱为杭州莱枫生物科技有限公司的118000 c8 dna纯化柱。
[0013]
本发明进一步提出了利用上述试剂盒大量提取质粒的方法，包括如下步骤：
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(1)菌液收集：接种新鲜的单个菌落到lb培养基，加入抗生素，37℃震荡培养14-16小时；收集菌液，离心，吸除上清；
kit)提取质粒pgl3-promoter；lane3:本试剂盒提取质粒pcdna3.1(+)；lane4:对照质粒大提试剂盒(ezgene
tm endofree plasmid maxiprep kit，biomiga)提取质粒 pcdna3.1(+)；lane 5:marker；
[0023]
图2为不同的试剂盒提取的质粒用于细胞转染图，其中，a图为本试剂盒提取的 pcdna3.1(+)(含egfp荧光标记)用于细胞转染后24h的荧光图；b图为对照试剂盒(ck)提取的pcdna3.1(+)(含egfp荧光标记)用于细胞转染后24h的荧光图；
具体实施方式
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下面通过具体的实施例详细说明本发明。
[0025]
实施例1分别携带pcdna3.1(+)和pgl3-promoter质粒的dh5α大肠杆菌的培养。
[0026]
从-80摄氏度冰箱中取出菌种或者挑单克隆菌斑，分别将携带pcdna3.1(+)和pgl3-promoter质粒的dh5α大肠杆菌接种于1ml培养基试管中，37度振荡培养8小时，转速为200rpm，8小时后将1ml培养菌液转入25ml培养基，37度振荡过夜培养(15小时左右)，转速为200rpm。过夜培养的菌液，5000rpm(3800
×
g)，离心5分钟，弃去培养基，保留沉淀。
[0027]
实施例2质粒提取。
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将10ml s i缓冲液加入菌体沉淀中，将菌体充分悬浮。所述s i缓冲液组分如下： 1m tris-hcl，0.5m edta和1m葡萄糖，ph＝8.0。
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加10ml s ii缓冲液到已悬浮好的菌液中，缓慢混合均匀(不能剧烈震荡)，进行裂解，操作时间不能超过5分钟(防止基因组污染)，所述s ii缓冲液组分如下：2m naoh 和10％sds。
[0030]
再向裂解体系中加入14ml s iii缓冲液，缓慢混合均匀(不能剧烈震荡)，出现片状沉淀。3000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到新的离心管中，得到上清液。s iii缓冲液组分如下：3m乙酸钾、2-3m盐酸胍和2m乙酸。
[0031]
向离心管中加入18ml ps清洗液，温和翻转数次使溶液混匀，将混合溶液转到新型硅胶膜吸附柱中。ps清洗液组分如下：5-10％tritonx-114的异丙醇溶液；吸附柱为可在洗脱dna的同时去除内毒素的新型硅胶模吸附柱，吸附柱来源于杭州莱枫生物科技有限公司(118000 c8 dna纯化柱)，经ph＝6.4的pbs缓冲液对硅胶膜吸附柱进行酸化处理。
[0032]
向离心吸附柱中加入5ml 洗脱液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，3000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤一次；将离心吸附柱放回高速离心机中，13000rpm离心2-5分钟，缓慢倒掉上清，室温放置2-5min，待乙醇挥发完全。其中洗脱液缓冲液组分如下：75％的乙醇溶液。
[0033]
实施例3质粒浓度及纯度测定。
[0034]
将吸附柱放入一个新的离心管中，使用0.5ml ddh2o(或者te)溶解沉淀，即得到质粒溶液。使用超微量分光光度计测a260，定量a260/a280的比值一般在1.8～2.0 之间。使用琼脂糖电泳检测质粒纯度。所述te缓冲液组分如下：100mm tris和10mmedta(ph 8.0)。经检测，本试剂盒提取的pcdna3.1(+)和pgl3-promotor的质粒浓度分别为700ng/ul和540ng/ul高于对照试剂盒的560ng/ul和350ng/ul；a260/a280的值均在1.8-20.0之间。
[0035]
实施例4.质粒内毒素测定
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质粒内毒素的测定使用内毒素检测鲎试剂盒(试管定量显色基质法，厦门鲎试剂
生物科技股份有限公司，内含显色基质溶液、偶氮化试剂1、偶氮化试剂2和偶氮化试剂3)进行检测，检测方法如下：
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内毒素标准曲线绘制：取内毒素工作品1支，以1.0eu/ml的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.1,0.25,0.5,1.0eu/ml的浓度梯度。
[0038]
取无热原试管，加入100ml细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液及质粒供试品。
[0039]
再加入100ml鲎试剂溶液，混匀，37℃温育20分钟。
[0040]
温育结束，加入100ml显色基质溶液，混匀，37℃温育30分钟。温育结束，加入500ml偶氮化试剂1溶液，混匀；
[0041]
加入500ml偶氮化试剂2溶液，混匀；加入500ml偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm波长处读取吸光度值。通过标准曲线读取质粒内毒素含量值。
[0042]
实施例5.真核细胞hek-293t细胞转染
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转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养，待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；
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向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液(载体质粒10μg)，与相应体积的 opti-mem混合均匀，调整总体积为0.5ml，在室温下温育5分钟。
[0045]
取50μl转染试剂lipofectamine 3000(thermo fisher scientific)与450μl opti-mem 混合，在室温下温育5分钟。
[0046]
把稀释后的dna与稀释后的转染试剂混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。混合后，在室温下温育10分钟。
[0047]
将上述转染混合物滴加到293t细胞培养液中，摇匀，于37℃,5％co2细胞培养箱中培养。培养6～8h后倒去含有转染混和物的培养基，每盘细胞更换10ml的 10％fbs完全培养基，37℃、5％co2培养箱内继续培养。
[0048]
转染后24h，用荧光显微镜观察含标签荧光(egfp)细胞的数量判定转染效率。其中，为不同的试剂盒提取的质粒用于细胞转染图，其中，a图为本试剂盒提取的pcdna3.1 (+)(含egfp荧光标记)用于细胞转染后24h的荧光图；b图为对照试剂盒(ck) 提取的pcdna3.1(+)(含egfp荧光标记)用于细胞转染后24h的荧光图。
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表1.质粒结果总量表
[0050][0051]
表2.质粒内毒素含量测定表
[0052][0053]
本发明的质粒提取试剂盒将离心柱的优点与经典的强碱-sds裂解细菌细胞法结合起来，利用特制的纯化柱简化了结合、洗涤和洗脱步骤，适用于不同细菌质粒的大量提取；纯化质粒为高纯度级别，达到转细胞级要求，每个质粒纯化柱的质粒dna最大结合能力达到0.5mg以上；适合于酶切、pcr、测序、转化、体外转录及细胞转染等要求。与经典质粒提取方法相比较，本试剂盒具有以下特点：质量可靠，提取所得的质粒纯度好，回收率高；操作简便，在1h内即可从样品中提取到所需质粒；使用安全，这是一个完全没有机溶剂污染的操作过程。