一种有机溶剂浸提法提取葡萄籽中单宁的条件优化方法与流程

一种有机溶剂浸提法提取葡萄籽中单宁的条件优化方法
[0001]
本申请为2015年12月21日提交中国专利局、申请号为cn201510959651.8、发明名称为“一种葡萄籽中单宁的提取方法”的中国专利申请的分案申请，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
[0002]
本发明涉及单宁提取技术领域，尤其涉及一种有机溶剂浸提法提取葡萄籽中单宁的条件优化方法。


背景技术：

[0003]
葡萄(grapes)，是葡萄科(vitaceae)葡萄属(vitis)的落叶藤本植物。果实可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒等产品，随着葡萄产品的生产量越来越大，使得加工过程中产生的废弃物如葡萄皮、葡萄籽、葡萄废渣等亟待进行综合利用。
[0004]
有关研究表明葡萄废弃物中含有丰富的葡萄籽油、蛋白质、单宁、白藜芦醇等物质，其蛋白质含量高、氨基酸种类非常齐全、矿物质丰富，对满足人体的需要都是非常重要的，并且这些物质在药品、保健品、化妆品等行业也被广泛应用，所以如何将这些葡萄籽废弃物加以综合开发利用，变废为宝意义深远。如果处理得当，既可以减轻给环境带来的污染，又可以创造出巨大的经济效益，从而可以达到双赢的效果。
[0005]
单宁是广泛存在于许多植物中的水溶性多酚类物质，它是一种极强的体内活性功能因子，许多研究表明，由于其自身的多酚羟基结构，单宁具有较强的抗氧化能力和较好的药理活性，现已广泛应用于食品、保健品、皮革生产、印染工业、药品和化妆品等领域。但是由于单宁的结构复杂，人工合成较难，现今国内外主要从天然植物如五倍子中提取，而且因为天然资源有限，导致了国内外市场单宁的价格非常昂贵。另外，我国葡萄的产量和种植面积都居于世界首位，葡萄在榨汁和酿酒过程中，会产生大量的副产物，如葡萄籽、葡萄皮等，葡萄籽中单宁物质含量及其丰富，并且一些特有单宁还具有预防心血管疾病的功效。目前，在国内从葡萄籽中提取单宁具有很大的开发潜力，但国内对单宁提取的研究较少。因此探究从葡萄籽中提取单宁的优化工艺有非常重要的实际意义。
[0006]
本申请应用响应面分析法对葡萄籽中单宁的提取工艺进行优化研究，采用多元二次回归方程作为函数估计的工具，结合数学和统计学建立等高线和曲面模型，使得葡萄籽中单宁的提取率达到最高，为葡萄籽的综合开发利用提供了一定的科学依据。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种有机溶剂浸提法提取葡萄籽中单宁的条件优化方法，本申请考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对葡萄籽中单宁提取率的影响，通过单因素实验和响应面优化实验的结果分析，得出最佳的葡萄籽中单宁提取条件为：乙醇的体积分数为51.70％，提取时间为3.08h，提取温度为61.87℃，此条件下单宁的提取率高达6.36％。
[0008]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0009]
本发明提供了一种有机溶剂浸提法提取葡萄籽中单宁的条件优化方法，包括如下步骤：
[0010]
1)研究料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对葡萄籽中单宁提取率的影响：
[0011]
提取剂乙醇的体积分数对单宁提取率的影响：
[0012]
取21个三角瓶，分为7组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中分别加入30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇30ml，用保鲜膜封口后放于60℃的恒温水浴锅中浸提3h；取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min；从每个样品液中吸取1ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5mlf-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml；摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值；
[0013]
不同料液比对单宁提取率的影响：
[0014]
取21个三角瓶，分为7组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中加入50％的乙醇20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml，用保鲜膜封口后放于60℃的恒温水浴锅中浸提3h；取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min；从每个样品液中吸取2ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5mlf-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml；摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值；
[0015]
不同提取温度对单宁提取率的影响：
[0016]
取21个三角瓶，分为7组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中分别加入50％的乙醇30ml，用保鲜膜封口后分别放于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中浸提3h。取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min。从提取温度为60℃的样品液中吸取1ml上清液，其余的每组都吸取2ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5mlf-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml；摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值；
[0017]
不同提取时间对单宁提取率的影响：
[0018]
取15个三角瓶，分为5组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中分别加入50％的乙醇30ml，用保鲜膜封口后放于60℃的恒温水浴锅中分别浸提1h、2h、3h、4h、5h；取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min；从每个样品液中吸取2ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5ml f-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml；摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值；
[0019]
2)通过单因素实验和响应面优化实验的结果分析，得出最佳的葡萄籽中单宁提取条件：
[0020]
根据box-behnken中心组的实验设计原理，综合单因素对单宁提取率影响的实验结果，选取料液比、提取时间和提取温度3个因素的3个较优水平，在单因素试验基础上采用3因素3水平的响应面分析法进行实验设计，得出数学模型，分析各因素之间的相互作用，以及各因素与响应值之间的关系；
[0021]
3)在单因素实验的基础上，应用design-expert.8.05b软件，采用box-behnken design建立数学模型，以选取乙醇体积分数x1、提取时间x2、提取温度x3三个因素为考察对象，以单宁提取率y的平均值为响应值，采用三因素三水平的响应面进行实验设计；
[0022]
4)将步骤3)所得实验结果回归拟合后，得到吸光值对乙醇体积分数、提取次数和提取时间的多元二次回归方程：
[0023]
y＝6.1+0.27x1+0.17x2+0.32x3-0.083x1x2+0.071x1x3+0.086x2x3-0.83x12-1.05x22-0.91x32；式中：y-单宁提取率；x1-乙醇体积分数；x2-浸提时间；x3-浸提温度；
[0024]
5)根据响应面法运算所得的回归方程求解寻求其最大值点：
[0025]
y＝6.1+0.27x1+0.17x2+0.32x3-0.083x1x2+0.071x1x3+0.086x2x3-0.83x12-1.05x22-0.91x32；
[0026]
当x1＝0.185、x2＝0.088、x3＝0.203时y值最大，即由此得到最佳的工艺条件为：乙醇的体积分数为51.70％，提取时间为3.08h，提取温度为61.87℃，在此条件下，单宁的提取率高达6.36％。
[0027]
本发明具有以下积极的技术效果：
[0028]
本申请提供了一种有机溶剂浸提法提取葡萄籽中单宁的条件优化方法，考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对葡萄籽中单宁提取率的影响，通过单因素实验和响应面优化实验的结果分析，得出最佳的葡萄籽中单宁提取条件为：乙醇的体积分数为51.70％，提取时间为3.08h，提取温度为61.87，此条件下单宁的提取率高达6.36％。
附图说明
[0029]
图1是提取剂乙醇的体积分数对单宁提取率的影响；
[0030]
图2是不同料液比对单宁提取率的影响；
[0031]
图3是不同提取温度对单宁提取率的影响；
[0032]
图4是不同提取时间对单宁提取率的影响；
[0033]
图5是乙醇的体积分数和提取时间交互作用对单宁提取率的影响(等高线图)；
[0034]
图6是乙醇的体积分数和提取时间交互作用对单宁提取率的影响(响应面3d图)；
[0035]
图7是乙醇的体积分数和提取温度交互作用对单宁提取率的影响(等高线图)；
[0036]
图8是乙醇的体积分数和提取温度交互作用对单宁提取率的影响(3d曲面图)；
[0037]
图9是提取时间和提取温度对单宁提取率的影响(等高线图)；
[0038]
图10是提取时间和提取温度对单宁提取率的影响(3d曲面图)。
具体实施方式
[0039]
下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中标示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。
[0040]
本申请提供了一种有机溶剂浸提法提取葡萄籽中单宁的条件优化方法，
[0041]
1)研究料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对葡萄籽中单宁提取率的影响：
[0042]
提取剂乙醇的体积分数对单宁提取率的影响：
[0043]
取21个三角瓶，分为7组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中分别加入30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇30ml，用保鲜膜封口后放于60℃的恒温水浴锅中浸提3h。取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min。从每个样品液中吸取1ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5mlf-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml。摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值。
[0044]
不同料液比对单宁提取率的影响：
[0045]
取21个三角瓶，分为7组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中加入50％的乙醇20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml，用保鲜膜封口后放于60℃的恒温水浴锅中浸提3h。取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min。从每个样品液中吸取2ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5mlf-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml。摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值。
[0046]
不同提取温度对单宁提取率的影响：
[0047]
取21个三角瓶，分为7组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中分别加入50％的乙醇30ml，用保鲜膜封口后分别放于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中浸提3h。取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min。从提取温度为60℃的样品液中吸取1ml上清液，其余的每组都吸取2ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5mlf-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml。摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值。
[0048]
不同提取时间对单宁提取率的影响：
[0049]
取15个三角瓶，分为5组，每组3个平行，向其中加入1g预处理后的原料，向每组三角瓶中分别加入50％的乙醇30ml，用保鲜膜封口后放于60℃的恒温水浴锅中分别浸提1h、2h、3h、4h、5h。取出后用布氏漏斗真空抽滤，将滤液移入离心管中，3000r/min离心30min。从每个样品液中吸取2ml上清液，置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中，加2.5ml f-d试剂，再加5ml饱和碳酸钠溶液，加水稀释至50ml。摇匀使其充分混合，并于30min后在650nm处测其吸光值。
[0050]
2)通过单因素实验和响应面优化实验的结果分析，得出最佳的葡萄籽中单宁提取条件：
[0051]
根据box-behnken中心组和的实验设计原理，综合单因素对单宁提取率影响的实验结果，选取料液比、提取时间和提取温度3个因素的3个较优水平，在单因素试验基础上采用3因素3水平的响应面分析法进行实验设计，得出数学模型，分析各因素之间的相互作用，以及各因素与响应值之间的关系。实验因素及水平见表1。
[0052]
表1单宁提取工艺响应面实验因素及水平
[0053][0054][0055]
如图1所示，以乙醇水溶液为提取剂，设置乙醇与水的不同比例对葡萄籽的单宁进行提取，比较吸光值的大小。根据绘制的标准曲线查找所测得的吸光值对应的单宁浓度，计算出单宁含量及提取率；由图1可知，乙醇的体积分数在50％左右时对单宁的溶解能力最强，比例升高或下降时提取率有所下降，这与单宁的复杂结构和乙醇的理化性质有关。有相关研究表明，加少许的水比纯乙醇溶液对单宁的提取量要高，即可以促进结合态单宁的溶解，又可以减少单宁在长时间保温提取过程中的降解和变质。
[0056]
如图2所示，取1g原料对应加入不同体积的乙醇水溶液，设置不同的料液比对葡萄籽的单宁进行提取，计算不同料液比的单宁提取率。根据绘制的标准曲线计算所测得的吸光值对应的单宁浓度，并计算出单宁含量及提取率；由图2可明显看出，单宁的提取率随着提取剂体积的增加而增加，在料液比为1:60左右时达到最大值，之后随着提取剂体积增加单宁的提取率变化不大，基本趋于平缓。由于过大的料液比不仅会造成资源浪费，而且还给抽滤、离心、干燥等后续工作带来更大的难度。所以选择1:60作为提取单宁的最佳料液比。
[0057]
如图3所示，根据单宁提取的适宜温度范围设定7个梯度水平进行葡萄籽中单宁提取率的比较，计算不同提取温度下单宁的提取率。根据绘制的标准曲线计算所测得的吸光值对应的单宁浓度，并计算出单宁含量及提取率，由图3可明显看出，随着提取温度的增加，葡萄籽中单宁提取率也有所增加，60℃时单宁的提取率最高，当温度继续增高时单宁的提取率逐渐降低。这是由于温度较低时，温度的增高能促进单宁在乙醇水溶液中的溶解，使得提取的单宁含量逐渐增加。但是在过高温度下单宁易发生降解、缩合、氧化等化学反应，导致单宁提取率下降。
[0058]
如图4所示，根据相关资料中单宁提取的适宜时间范围设定5个水平进行葡萄籽中单宁提取率的比较，比较不同提取时间下样液的吸光值，再根据绘制的标准曲线查找所测得的吸光值对应的单宁浓度，计算出单宁含量及提取率，由图4可明显看出，单宁的提取率随浸提时间的增加而增加，浸提3小时左右单宁提取率达最大值，加长浸提时间单宁的提取率会有所降低。据有关资料显示，长时间的恒温浸提使单宁的提取率有些许下降，可能是由于单宁复合物变性所致。
[0059]
3)在单因素实验的基础上，应用design-expert.8.05b软件，采用box-behnken design建立数学模型，以选取乙醇体积分数x1、提取时间x2、提取温度x3三个因素为考察对
象，以单宁提取率y的平均值为响应值，采用三因素三水平的响应面进行实验设计，由box-behnkendesign设计方案所得的试验结果见表2。
[0060]
表2响应面优化实验设计及响应值
[0061][0062][0063]
4)将上述实验结果回归拟合后，得到吸光值对乙醇体积分数、提取次数和提取时间的多元二次回归方程：
[0064]
y＝6.1+0.27x1+0.17x2+0.32x3-0.083x1x2+0.071x1x3+0.086x2x3-0.83x12-1.05x22-0.91x32
[0065]
式中：y-单宁提取率；
[0066]
x1-乙醇体积分数；
[0067]
x2-浸提时间；
[0068]
x3-浸提温度。
[0069]
为了检验回归方程的可靠性，进行方差分析，分析结果见表3。
[0070]
表3方差分析表
[0071][0072]
注：“*”为显著(p<0.05)，“**”为高度显著(p<0.01)。
[0073]
由表3可以看出失拟项p＝0.5647>0.05，表明失拟不显著；回归模型的p<0.01，表明模型高度显著；模型的校正决定系数(相关系数)r2adj为0.9597，说明这个模型能反映95.97％响应值的变化。以上三点均表明了该模型的拟合程度很好，因此该回归模型可用于分析实验数据并较准确地预测最佳提取条件。
[0074]
一次项的f值大小反映了各因素对响应值的影响程度情况，f值越大表明该因素对响应值的影响程度越大。由表3可看出，各因素对单宁提取率的影响程度次序为：浸提温度>乙醇体积分数>浸提时间。
[0075]
如图5-10所示，响应面等高线图和3d图可以直观地反映各因素对单宁提取率的影响，以及乙醇的体积分数、浸提时间和浸提温度三因素之间的相互作用，能够更准确地找出最佳工艺参数。所以，在回归模型方差分析结果的基础上，利用软件design-expert8.05b做提取时间、提取温度、乙醇体积分数对葡萄籽中单宁提取率影响的响应面和等高线图，结果如图7～图9所示。
[0076]
图5-10中的等高线图和3d曲面图直观地反映了各因素之间的交互作用对单宁提取率的影响，即在其中一个因素固定时另外两个因素交互作用对单宁提取率影响，而且可以找出最佳工艺参数。
[0077]
等高线的形状可反映出有无交互作用以及交互作用的强弱，椭圆形表示两因素有交互作用，而圆形则与之相反，而且等高线的疏密程度与交互作用的显著性有关。此外，3d图曲面图的倾斜度也可以确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡，说明两
者交互作用越显著。本申请的3个等高线图呈椭圆形，且等高线的疏密程度相似，3d曲面图倾斜度接近一致，表明各因素的交互作用对单宁提取率有影响，但各组交互实验对单宁提取率的影响力相差不大。
[0078]
5)最佳工艺条件的优化与验证：
[0079]
(1)最佳参数的优化
[0080]
根据响应面法运算所得的回归方程求解寻求其最大值点。
[0081]
y＝6.1+0.27x1+0.17x2+0.32x3-0.083x1x2+0.071x1x3+0.086x2x3-0.83x12-1.05x22-0.91x32；
[0082]
当x1＝0.185、x2＝0.088、x3＝0.203时y值最大，即由此得到最佳的工艺条件为乙醇的体积分数为51.70％，提取时间为3.08h，提取温度为61.87℃，在此条件下，单宁的提取率高达6.36％。
[0083]
(2)最佳条件的验证
[0084]
采用得出的最佳工艺条件进行验证试验。以三次平行试验的平均值作为实验结果，得到的单宁提取率为6.35％与理论值相差0.01％，相对误差为0.16％，实际测定值与理论预测值基本相符，因此采用响应面法得到的提取条件参数可靠，具有实用价值。
[0085]
综上所述，本文通过有机溶剂浸提法对葡萄籽中单宁提取工艺的条件进行优化探究，考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度对葡萄籽中单宁提取率的影响，通过单因素实验和响应面优化实验的结果分析，得出最佳的葡萄籽中单宁提取条件为：乙醇的体积分数为51.70％，提取时间为3.08h，提取温度为61.87，此条件下单宁的提取率高达6.36％。
[0086]
上面所述只是为了说明本发明，应该理解为本发明并不局限于以上实施例，符合本发明思想的各种变通形式均在本发明的保护范围之内。