具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物及其制备方法，多糖硫酸化修饰产物中硫酸基含量为24.79％，多糖含量为52.10％，多糖由摩尔比为0.45:18.96:1.0:0.53的甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成。本发明通过大量实验优选提取分离工艺，采用水提醇沉法得到粗多糖，再脱蛋白，然后采用DEAE?52纤维素树脂进行纯化，制得纯度高的黄蜀葵茎叶多糖，再采用氨基磺酸法修饰得到黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物。本发明充分利用废弃的黄蜀葵茎叶资源，变废为宝，得到可提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物，可实现中药资源的可持续化应用，具有很好的经济价值和生态环境保护意义。
【专利说明】
具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物及其制 备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种植物多糖，具体涉及一种具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖硫 酸化修饰产物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 中药资源是保障国民健康、发展民族医药的坚实基础。近年来中药及天然药用生 物资源的生产面积已超过2.40 X 106hm2，药材产量可达5.40 X 106t，而废弃的植物根系以及 地上茎叶的生物量高达I. I X IO7~1.6 X 107t，是药材产量2~3倍，造成了严重的资源浪费 和环境污染。因此，在中药资源产业化过程中提高药用生物资源的利用价值、尤其是提升其 药用价值，对于中医药产业的健康发展以及发展资源节约型、环境友好型的经济具有重大 意义。
[0003] 黄蜀葵(Abelmoschus manihot L.Medic)为锦葵科秋葵属植物，始载于《嘉祐本 草》，《本草纲目》中记载："其花气味甘、寒、滑、无毒，主治小便淋及催生，治诸恶疮脓水久不 瘥者，作末敷之即愈，为疮家要药"等。其根、茎、叶均具有一定的药用价值。黄蜀葵花为主要 用药部位，在采收过程中其茎叶部分多被丢弃或是焚烧，造成了黄蜀葵茎叶资源的极大浪 费以及环境的污染。
[0004] 多糖是一类结构复杂的高分子物质，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗辐射 和增强免疫等多种生物学功效。但一般情况下，天然提取的多糖生物活性较弱。在天然多糖 分子中引入某种离子基团并且具有恰当的取代度时，不仅能够显著改善多糖在水中的溶解 度，而且可以使多糖的链构象发生改变，从而使其具有某种特定的结构而提高生物活性。多 糖的硫酸酯化修饰即是将多糖分子的羟基末端、羧基末端或者氨基末端用硫酸基团取代， 可导致原有多糖的生物活性发生明显改变。
[0005] 目前，国内外对黄蜀葵茎叶多糖的研究主要集中在理化性质以及单糖的分析，对 其活性的研究较少。因此，应用硫酸化修饰技术改变黄蜀葵茎叶多糖的结构、改善其理化性 质，获得真正具有活性的多糖，对黄蜀葵茎叶资源的高效利用以及生态环境的保护意义重 大。
【发明内容】
[0006] 发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，以黄蜀葵茎叶废弃物为原 料，通过优选方法制备得到黄蜀葵茎叶粗多糖，然后采用硫酸酯化修饰，得到具有提高免疫 活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物。本发明另一个目的是提供黄蜀葵茎叶多糖硫酸化 修饰产物的制备方法和其应用。本发明充分利用废弃的黄蜀葵茎叶资源，变废为宝，高免疫 活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物，可实现中药资源的可持续化应用，具有很好的经 济价值和生态环境的保护意义。
[0007] 技术方案:为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] 一种黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物，黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物中硫酸基 含量为24.79%，多糖含量为52.10%，多糖由摩尔比为0.45:18.96:1.0:0.53的甘露糖、葡 萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成。
[0009] 作为优选方案，黄蜀葵茎叶多糖及黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的分子量分别 为760·24kDa和236·75kDa。
[0010] 作为优选方案，以上所述的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的制备方法，包括以 下步骤：
[0011] (1)取黄蜀葵茎叶乙醇提取后的药渣，加入药渣重量1 〇~30倍体积的水，回流提取 2~3次，每次1~2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩;Sevag法除蛋白，离心，取上清液，加入无 水乙醇，醇沉过夜，抽滤，取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干，得黄蜀葵茎叶粗 多糖；
[0012] (2)黄蜀葵茎叶粗多糖的分级
[0013] 称取步骤（1)制备得到的黄蜀葵茎叶粗多糖，加蒸馏水溶解，加样于DEAE-52层析 柱中，用0.0、0.1、0.3、0.5mo 1/L NaCl溶液梯度洗脱，并采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，分 别收集不同的洗脱峰，减压浓缩，透析，最后将透析液真空冷冻干燥，获得黄蜀葵茎叶多糖；
[0014] (3)黄蜀葵茎叶多糖的硫酸化修饰
[0015] 取步骤(2)制备得到的黄蜀葵茎叶多糖，采用氨基磺酸法进行修饰:准确称取黄蜀 葵茎叶多糖，在室温条件下搅拌溶于二甲基甲酰胺中，加入氨基磺酸，于80~90°C搅拌反 应。反应结束后，冰水浴冷却至室温，用NaOH调节pH至中性，透析，取透析液，浓缩，冻干，得 黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物。
[0016] 作为优选方案，以上所述的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的制备方法，步骤(3) 准确称取黄蜀葵茎叶多糖40mg，在室温条件下搅拌30min，溶于15mL二甲基甲酰胺中，加入 120mg氨基磺酸，于80 °C搅拌反应3h，反应结束后，冰水浴冷却至室温，用NaOH调节pH至中 性，透析3天，取透析液，浓缩，冻干，得黄蜀葵莖叶多糖硫酸化修饰产物。
[0017] 本发明通过实验研究表明，经过硫酸化修饰得到的的黄蜀葵茎叶多糖产物具有显 著的促进脾淋巴细胞增殖的作用，可用于制备提高免疫力的药物或保健品。
[0018] 本发明所述的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物在制备提高免疫力的药物或保健 品中的应用，可将黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊 剂、颗粒剂或微囊剂型的药物。
[0019] 本发明在制成片剂时，在黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物中添加载体乳糖或玉米 淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
[0020] 在制成胶囊剂时，将黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物和载体乳糖或玉米淀粉混合 均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
[0021 ]本发明在制成颗粒剂时，把黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物和稀释剂乳糖或玉米 淀粉混合均勾，整粒，干燥，制成颗粒剂。
[0022] 有益效果:本发明提供的具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物和 现有技术相比具有有点：
[0023] 1、本发明通过大量实验优选提取分离工艺，首先采用水提醇沉法得到粗多糖，再 脱除蛋白，然后采用DEAE-52纤维素树脂进行纯化，制得纯度高的黄蜀葵茎叶多糖，然后再 采用氨基磺酸法进行修饰，纯化，得到黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物。本发明充分利用废 弃的黄蜀葵茎叶资源，变废为宝，制备得到可提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰 产物，可实现中药资源的可持续化应用，具有很好的经济价值和生态环境的保护意义。
[0024] 2、本发明经过体外小鼠脾淋巴细胞的增殖活性试验表明，黄蜀葵茎叶多糖并无明 显的免疫调节活性，但是经硫酸化修饰后，在25~200yg/mL剂量范围内表现出显著的免疫 调节活性，取得了非常好的预料不到的技术效果。
【附图说明】
[0025] 图1为黄蜀葵茎叶粗多糖的红外光谱图。
[0026] 图2为黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的红外光谱图。
[0027] 图3为黄蜀葵茎叶多糖及其硫酸化修饰产物的脾细胞增殖活性柱状图。
【具体实施方式】
[0028]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0029] 实施例1
[0030] 黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的制备方法，包括以下步骤：
[0031] (1)黄蜀葵茎叶粗多糖的制备
[0032] 取黄蜀葵茎叶经乙醇回流提取后的干燥药渣100g，加入药渣重量30倍体积量的 水，100 °C水浴回流提取3次，每次Ih。过滤，合并滤液，减压浓缩。Sevag法除蛋白，离心 (4000r/min，IOmin)，取上清液，加入四倍体积的无水乙醇，醇沉过夜，抽滤，沉淀依次用无 水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次，50°C烘干，即得黄蜀葵茎叶粗多糖。
[0033] (2)黄蜀葵茎叶粗多糖的分级
[0034]称取步骤(1)制备得到的黄蜀葵茎叶粗多糖3g，加适量蒸馏水溶解，配制质量浓度 为30mg/ml的多糖溶液，加样于DEAE-52层析柱中。用0 ·0、0 · 1、0 · 3、0 · 5mol/L NaCl溶液梯度 洗脱，流速1.0mL/min(10min/管），采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，分别收集不同的洗脱 峰，减压浓缩，透析，最后将透析液真空冷冻干燥，获得黄蜀葵茎叶粗多糖（多糖含量达 99%)〇
[0035] (3)黄蜀葵茎叶多糖的硫酸化修饰
[0036] 取步骤(2)制备得到的黄蜀葵茎叶粗多糖，采用氨基磺酸法进行修饰。准确称取黄 蜀葵莖叶粗多糖40mg，在室温条件下搅拌30min溶于15mL DMF中。加入120mg氨基磺酸，于80 °(：搅拌反应3h。反应结束后，冰水浴冷却至室温，用NaOH调节pH至中性，透析3天，浓缩，冻 干，得黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物。
[0037] 实施例2黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物总糖含量与取代度的测定
[0038] 1、以D-无水葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定硫酸化修饰前后黄蜀葵茎叶 粗多糖的总糖含量；WK 2SO4为标准品，采用氯化钡-明胶比浊法测定硫酸根含量，按照下式 计算取代度(DS)。 Γ ? 1.62 XS % 0039] D、= -- -~- 32-1.02X5%
[0040] 式中：S%为硫元素含量
[0041] 2、单糖组成分析
[0042] 采用三氟乙酸水解、PMP衍生多糖样品，以混合单糖为标准品，采用高效液相色谱 法根据出峰时间确定单糖的组成，根据峰面积绘制各单糖的标准曲线测定样品的单糖含 量。
[0043] 3、红外光谱分析
[0044]取经过干燥的黄蜀葵茎叶粗多糖和黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物样品各Img， 与100~200mg经干燥的溴化钾粉末于玛瑙研钵研磨均匀，分别压成薄片，分别在红外光谱 仪上测定4000~400CHT 1的红外光谱。
[0045] 4、小鼠脾淋巴细胞增殖试验
[0046] 无菌取脾，制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为6 X IO6个/mL，于96孔板接 种IOOyL/孔，再分别加入培养液(空白对照）、IOyg/mL ConA(刀豆球蛋白A，阳性对照），不同 浓度的黄蜀葵茎叶粗多糖和不同浓度的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物样品溶液各?〇〇μ L/孔，每个浓度均设4个复孔，混合均匀后置于37 °C、5 % CO2培养24h。培养结束前4h，每孔加 入MTT(5mg/mL) IOyL，于上述条件中继续培养4h，离心弃上清，加入IOOyL DMSO，充分震荡后 用酶标仪测定波长570nm的吸光值。
[0047]淋巴细胞增殖指数=样品组吸光值/空白对照组吸光值 [0048] 5、实验结果
[0049] 5.1总糖以及取代度的测定分析结果，如表1所示：
[0050] 表1黄蜀葵茎叶粗多糖和黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的总糖含量与取代度的 测定
[0052]如表1所示，黄蜀葵茎叶粗多糖的总糖含量为99.76%，不含硫酸基，修饰后的硫酸 基含量为24.79%，总糖含量为52.10%，主要是被大量的硫酸基取代，黄蜀葵茎叶多糖硫酸 化修饰产物的硫酸基取代度为0.57，糖链上已连上硫酸基。
[0053] 5.2单糖组成分析结果如表2所示：
[0054]表2黄蜀葵茎叶粗多糖及其硫酸化修饰产物的单糖组成摩尔比
[0056]黄蜀葵茎叶粗多糖及其硫酸化修饰产物的单糖组成的摩尔比如表2所示，黄蜀葵 茎叶粗多糖由甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成，其中葡萄糖的比例最高，其它三 种糖的比例较低。硫酸化修饰后，其葡萄糖的含量有所下降，主要是部分糖链被硫酸基取 代。黄蜀葵茎叶多糖和黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的分子量分别为760.24kDa和 236.75kDa。在修饰过程中，黄蜀葵茎叶多糖发生了部分降解。
[0057] 5.3红外光谱分析
[0058]如图1和图2所示，黄蜀葵茎叶粗多糖在3400CHT1左右的吸收峰为O-H键的伸缩振 动，2900cm-1左右的吸收峰为C-H键的伸缩振动，为糖类特征吸收。黄蜀葵茎叶多糖硫酸化 修饰产物除了保留黄蜀葵茎叶粗多糖的主体特征吸收外，其在1251cm- 1处出现的明显的不 对称S = 0伸缩振动的吸收峰，以及在820CHT1处的C-O-S的拉伸振动吸收峰，表明糖链上已经 引入了硫酸基团，硫酸化修饰成功。
[0059] 5.4脾细胞增殖活性分析
[0060]黄蜀葵茎叶粗多糖及其硫酸化修饰产物的脾细胞增殖活性实验结果如图3所示。 图中a表示与对照组相比，增强作用差异显著(p<0.05);图中b表示与对照组相比，增强作 用差异极显著(P<〇.01);图中c表示与对照组相比，增强作用差异极其显著(p<0.001);图 中e表示与SLAMP-a组相比，增强作用差异极显著(p<0.01);图中f表示与SLAMP-a组相比， 增强作用极其差异显著(P<〇.001)。
[0061 ] 对照组的增殖指数为0.998，阳性组为1.744。
[0062]由图3可知，与对照组相比，黄蜀葵茎叶粗多糖在25~200yg/mL浓度范围内不能刺 激脾淋巴细胞的增殖，而黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物具有显著的促进脾淋巴细胞增殖 的作用。黄蜀葵茎叶粗多糖在lOOμg/ml剂量时具有最强的增殖作用，增殖指数为1.472,在 25μg/ml时增殖指数最低，为1.267，而修饰前的最高刺激指数仅为1.079，取得了非常好的 技术效果。
[0063]以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的 人了解本
【发明内容】
并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实 质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物，其特征在于，黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产 物中硫酸基含量为24.79%，多糖含量为52.10%，多糖由摩尔比为0.45:18.96:1.0:0.53的 甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成。2. 权利要求1所述的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 取黄蜀葵茎叶乙醇提取后的药渣，加入药渣重量10~30倍体积的水，回流提取2~3 次，每次1~2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩;Sevag法除蛋白，离心，取上清液，加入无水乙 醇，醇沉过夜，抽滤，取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干，得黄蜀葵茎叶粗多糖； (2) 黄蜀葵茎叶粗多糖的分级 称取步骤（1)制备得到的黄蜀葵茎叶粗多糖，加蒸馏水溶解，加样于DEAE-52层析柱中， 用0.0、0.1、0.3、0.5mo 1/L NaCl溶液梯度洗脱，并采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，分别收 集不同的洗脱峰，减压浓缩，透析，最后将透析液真空冷冻干燥，获得黄蜀葵茎叶多糖； (3) 黄蜀葵茎叶多糖的硫酸化修饰 取步骤(2)制备得到的黄蜀葵茎叶多糖，采用氨基磺酸法进行修饰:准确称取黄蜀葵茎 叶多糖，在室温条件下搅拌溶于二甲基甲酰胺中，加入氨基磺酸，于80~90°C搅拌反应。反 应结束后，冰水浴冷却至室温，用NaOH调节pH至中性，透析，取透析液，浓缩，冻干，得黄蜀葵 茎叶多糖硫酸化修饰产物。3. 根据权利要求2所述的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物的制备方法，其特征在于，步 骤(3)准确称取黄蜀葵茎叶多糖40mg，在室温条件下搅拌30min，溶于15mL二甲基甲酰胺中， 加入120mg氨基磺酸，于80 °C搅拌反应3h，反应结束后，冰水浴冷却至室温，用NaOH调节pH至 中性，透析3天，取透析液，浓缩，冻干，得黄蜀葵莖叶多糖硫酸化修饰产物。4. 权利要求1所述的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物在制备提高免疫力的药物或保健 品中的应用。5. 根据权利要求4所述的黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物在制备提高免疫力的药物或 保健品中的应用，其特征在于，把黄蜀葵茎叶多糖硫酸化修饰产物和药学上可接受的载体 制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或微囊剂型的药物。
【文档编号】A61K31/737GK105859907SQ201610409994
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】江曙, 潘欣欣, 段金廒, 朱悦, 钱大玮, 严辉
【申请人】南京中医药大学