嗜热链球菌JMCC0030、其分离纯化方法及应用与流程

嗜热链球菌jmcc0030、其分离纯化方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株、筛选方法及应用,具体地说是一种嗜热链球菌jmcc0030、其筛选方法及应用。


背景技术：

2.嗜热链球菌是目前工业生产中应用最广泛的发酵菌种之一，其在乳制品中的开发和利用一直备受国内外乳品行业高度重视。嗜热链球菌作为食品工业生产中的关键菌种，被认为是“公认安全性(gras)”成分，不仅可用于制备许多发酵乳制品(如酸奶、奶酪)，还可通过其自身具备的功能活性(如产生胞外多糖、细菌素等)，作为潜在有益菌制备功能产品。然而，目前我国乳品企业的发酵剂、菌株仍呈现出依赖进口的局面，且菌株开发技术也与国外乳企存在一定差距。因此，筛选、分离并获得具有独立知识产权的优良发酵菌种成为国内乳品企业亟待解决的问题。
3.申请号为106120675的中国台湾发明专利申请公开了一种嗜热链球菌tci633菌株及其代谢产物于预防及/或治疗骨质疏松症之应用。其中，公开了嗜热链球菌tci1633 以及包含该菌种的食品利用通过抑制蚀骨细胞的活性及其分化，从而达到预防或治疗骨质疏松症的目的。但是引起骨质疏松症的因素还包括体内激素失衡，导致钙及其他营养元素吸收缓慢，从而无法及时补充在代谢过程中流失的营养物质，进而引起的骨质疏松。同时，抑制细胞向蚀骨细胞分化并没有指向性，其中也可能会抑制细胞向其他有益细胞分化，从而引起其他症状。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中存在的以上不足，本发明旨在提供一种嗜热链球菌jmcc0030、其分离纯化方法及应用，以达到改善体内激素水平，促进营养物质吸收，从而提高骨
5.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种嗜热链球菌jmcc0030，该菌菌株已保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为cgmcc no.19075，拉丁文名称为streptococcus thermophilus。
7.作为本发明的限定，所述嗜热链球菌jmcc0030是从新疆传统发酵样品中分离筛选出来的；
8.作为本发明的另一种限定，所述嗜热链球菌jmcc0030的16srdna序列如下：
9.aaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgg gaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagccta caatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaaccattg tagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttattac cggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctcgttgcgggacttaa cccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatgtaccgaagtaactttctat ctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctcc accgcttgtgcg
ggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgctta atgcgttagctgcggcactgaatcccggaaaggatccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactacc agggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcg ccaccggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactca agtttgacagtttccaaagcgaactatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgc tcgctttacgcccaataaatccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagc cgtccctttctggtaagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagag ctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattcc ctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggct atgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtagtggaac aattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtttccaatagttat cccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaagaagagcaagctcctct cttcagcgttctact；
10.作为本发明的第二种限定，所述嗜热链球菌jmcc0030的phes基因序列如下：
11.gaacccggatacctgactctcagcacttgtgggtgaaccataccagcaccaaggatctcaatccaacct gtattcttgcatacgttacatcctttaccaccacacttgaagcatgacacgtcaacctcaacggaaggttcag tgaatgggaagtaagaaggacgcaaacggattcgacgttctgcaccaaacattttttgaataatcatctcaag cgttcccttcagatcacccattgagatgtttttaccaacgaccaaaccttcgatttggtgaaactggtggctg tgagtcgcatcatcggtatcacgacggaaaacacgtcctggtgagatcatcttaagaggacctttagaaaaat catgtttatcaagtgtacgagcttggacaggacttgtatgagtgcgaagcaagatttcttcggtaatgtagaa agtatcttgcatatcacgaggctggatgggtct；
12.本发明还提供了嗜热链球菌jmcc0030的一种分离纯化方法，按照以下步骤顺序进行：
13.①
采集样品
14.取新疆传统发酵样品，加入生理盐水中充分混匀，得到样品a；
15.其中，所述发酵样品与所述生理盐水的体积比为1:9；
16.②
样品富集
17.取样品a，加入至mrs液体培养基中，35～40℃培养62～82h，得到培养液b；
18.其中，所述样品a与mrs液体培养基的体积比为1:10～100；
19.③
菌株分离筛选
20.取培养液b，用浓度为0.9％的无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，分别为梯度稀释10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5倍，依次得到菌悬液c1～c5；
21.取mrs固体培养基，融化后，依次倒入五个灭菌后的培养皿中，待冷却、完全凝固后，得培养基d1～d5，分别吸取各浓度梯度的菌悬液c1～c5各0.1ml，一一对应涂布到培养基d1～d5上，倒置平板，置35～40℃环境下厌氧培养62～82h，观察菌落生长情况；
22.待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落e；
23.④
菌株纯化
24.挑取选中的单菌落e，将菌落培养物划线接种到mrs固体培养基上进行第一次培养，35～40℃有氧环境培养62～82h，得单菌落f；
25.将单菌落f继续划线接种到mrs固体培养基上进行第二次培养，35～40℃有氧环境培养62～82h，得单菌落g；
26.再将单菌落g继续划线接种到mrs固体培养基上进行第三次培养，35～40℃有氧环境培养62～82h，得纯培养物h，即为所述嗜热链球菌jmcc0030菌株；
27.⑤
菌株保存
28.将纯培养物h与无菌的质量分数为50％甘油按1：1比例混合，置于菌种保存管内，混匀后于
‑
80～
‑
70℃保存，同时接种mrs固体培养基试管斜面用于临时保存。
29.作为上述分离纯化方法的限定，所述mrs液体培养基，以重量份数计，配制成它的有效成分的原料包括：酪蛋白胨10份、牛肉膏10份、酵母膏5份、葡萄糖20份、乙酸钠5份、柠檬酸二胺2份、吐温
‑
80 1份、k2hpo
4 2份、mgso4·
7h2o 0.2份、mnso4·
7h2o 0.05份、蒸馏水1000份；
30.作为上述分离纯化方法进一步限定，所述mrs固体培养基为每1000份所述mrs 液体培养基中添加15份琼脂；
31.本发明还提供了嗜热链球菌jmcc0030的一种应用，所述菌株用于与保加利亚乳杆菌jmcc0018复配后制备发酵乳；
32.其中，所述保加利亚乳杆菌jmcc0018已保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为cgmcc no.14425。
33.由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果是：
34.(1)本发明所提供的嗜热链球菌jmcc0030与在先申请文件201711359762.0公开的高产乙醛保加利亚乳杆菌jmcc0018复配后制备发酵乳，以提高乙醛产量，保持了jmcc0018的增香功能，同时提高发酵乳粘度，所制备的发酵乳香气好、粘度高；
35.(2)本发明所提供的嗜热链球菌jmcc0030在发酵过程中，能够产生较高浓度的有益活性物质短链脂肪酸(scfas，指的是碳原子数小于6的有机脂肪酸，其中主要包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等)。scfas的作用可不仅仅局限于酸化肠道，它们还参与胃肠生理、免疫功能和宿主代谢，甚至参与中枢神经系统的发育和稳态，对于机体健康发挥着重要的作用；
36.(3)本发明所提供的嗜热链球菌jmcc0030被摄入进体内后，会对体内的雌二醇 (e2)进行干预，使得e2水平升高，e2的增加可促进肠钙吸收，并减少尿钙排泄，进而提高骨密度；
37.综上所述，本发明提供的嗜热链球菌jmcc0030与保加利亚乳杆菌jmcc0018复配后，发酵制备的发酵乳香气好、粘度高，同时能够改善骨质疏松症。
38.本发明适用于细菌菌株的分离纯化及应用，尤其适用于嗜热链球菌jmcc0030的分离纯化及应用。
具体实施方式
39.以下结合本发明的优选实施例进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和理解本发明，并不用于限定本发明。
40.实施例1嗜热链球菌jmcc0030
41.本实施例为一种嗜热链球菌jmcc0030，该菌是从新疆传统发酵品中分离筛选出来的，并保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1
号院3号，保藏号为cgmcc no.19075。
42.其16srdna序列如下：
43.aaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaac gtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaat ccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaaccattgtagc acgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttattaccggc agtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctcgttgcgggacttaaccca acatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatgtaccgaagtaactttctatctct agaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccg cttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgc gttagctgcggcactgaatcccggaaaggatccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccaggg tatctaatcctgttcgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccac cggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactcaagtt tgacagtttccaaagcgaactatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgc tttacgcccaataaatccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtc cctttctggtaagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagcttt acgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattccctac tgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctatgt atcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtagtggaacaatt gcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtttccaatagttatcccc cgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaagaagagcaagctcctctcttc agcgttctact。
44.其phes基因序列如下：
45.gaacccggatacctgactctcagcacttgtgggtgaaccataccagcaccaaggatctcaatccaacctgtat tcttgcatacgttacatcctttaccaccacacttgaagcatgacacgtcaacctcaacggaaggttcagtgaa tgggaagtaagaaggacgcaaacggattcgacgttctgcaccaaacattttttgaataatcatctcaagcgtt cccttcagatcacccattgagatgtttttaccaacgaccaaaccttcgatttggtgaaactggtggctgtgag tcgcatcatcggtatcacgacggaaaacacgtcctggtgagatcatcttaagaggacctttagaaaaatcatg tttatcaagtgtacgagcttggacaggacttgtatgagtgcgaagcaagatttcttcggtaatgtagaaagta tcttgcatatcacgaggctggatgggtct。
46.实施例2一种嗜热链球菌jmcc0030的分离纯化方法
47.本实施例为一种嗜热链球菌jmcc0030的分离纯化方法，该分离纯化方法按照以下步骤顺序进行：
48.①
样品采集
49.取25ml新疆传统发酵品(取自新疆喀什地区，牧民制作的传统发酵乳制品)，加至225ml生理盐水中，充分混匀，得到样品a；
50.②
样品富集
51.取2ml样品a，加入100mlmrs液体培养基中，37℃培养72h，得到培养液b；
52.③
菌株分离筛选
53.取1ml培养液b，用浓度为0.9％的无菌生理盐水10倍梯度稀释，分别为梯度稀释
10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5倍，得到菌悬液c1～c5；
54.取mrs固体培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，得培养基 d1～d5，分别吸取各浓度梯度的菌悬液c1～c5各0.1ml涂布到不同培养基d1～d5上，倒置平板，置37℃环境下厌氧培养72h，观察菌落生长情况；
55.待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征，挑选出相应的单菌落 e；
56.④
菌株纯化
57.挑取选中的单菌落e，将菌落培养物划线接种到mrs固体培养基上进行第一次培养，第一次培养的条件是37℃有氧环境培养72h，得单菌落f；
58.然后，再将单菌落f继续划线接种到mrs固体培养基上进行第二次培养，第二次培养的条件是37℃有氧环境培养72h，得单菌落g；
59.再将单菌落g继续划线接种到mrs固体培养基上进行第三次培养，第三次培养的条件是37℃有氧环境培养72h，得纯培养物h；
60.⑤
菌株保存
61.将纯培养物h与无菌的质量分数为50％甘油各取800μl，置于菌种保存管内，混匀后在
‑
70℃保存，同时接种mrs固体培养基试管斜面用于临时保存；
62.本实例中，mrs液体培养基是取10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、20g葡萄糖、5g乙酸钠、2g柠檬酸二胺、1g吐温
‑
80、2gk2hpo4、0.2gmgso4·
7h2o、 0.05gmnso4·
7h2o及1000ml蒸馏水充分溶解后制得；
63.其中，mrs固体培养基是取1000mlmrs液体培养基加入15g琼脂融化混匀后，凝固而成。
64.实施例3～6嗜热链球菌jmcc0030的分离纯化方法
65.实施例3～6分别提供一种嗜热链球菌jmcc0030的分离纯化方法，与实施例2的方法基本相同，不同之处在于分离纯化过程的技术参数不同，具体参数如表1所示：
66.表1实施例3
‑
6分离纯化过程及参数
[0067][0068][0069]
其中，其他参数均与实施例2相同。
[0070]
实施例7嗜热链球菌jmcc0030的细菌学基本特征
[0071]
本实施例为嗜热链球菌jmcc0030的细菌学基本特征，具体如表2所示：
[0072]
表2嗜热链球菌jmcc0030的基本特征
[0073]
实验项目结果实验项目结果革兰氏染色阳性细胞形态球状氧化酶
‑
接触酶
‑
[0074]
实施例8嗜热链球菌jmcc0030的糖发酵特性
[0075]
本实施例为嗜热链球菌jmcc0030的糖发酵特性。其糖发酵特性的实验方法为：挑取嗜热链球菌jmcc0030的单菌落接种至灭菌的液体mrs培养基内，37℃培养24h，所得菌悬液分别接种至不同的糖发酵管(具体糖发酵管内含物见表3)中，37℃培养48h，观察颜色变化。其糖发酵特性的鉴定结果如表3所示：
[0076]
表3嗜热链球菌jmcc0030糖发酵特性的鉴定结果
[0077][0078]
[0079]
注：“+”表示发酵利用；
“‑”
表示不发酵利用。
[0080]
实施例9嗜热链球菌jmcc0030的分子生物学鉴定
[0081]
取嗜热链球菌jmcc0030进行分子生物学鉴定，通过dna提取、pcr扩增、16srdna 测序，于ncbi网站blast最终确定为嗜热链球菌。
[0082]
其16srdna测序结果如下：
[0083]
aaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgg gaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagccta caatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaaccattg tagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttattac cggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctcgttgcgggacttaa cccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatgtaccgaagtaactttctat ctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctcc accgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgctta atgcgttagctgcggcactgaatcccggaaaggatccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactacc agggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcg ccaccggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactca agtttgacagtttccaaagcgaactatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgc tcgctttacgcccaataaatccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagc cgtccctttctggtaagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagag ctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattcc ctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggct atgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtagtggaac aattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtttccaatagttat cccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaagaagagcaagctcctct cttcagcgttctact。
[0084]
其phes基因序列如下：
[0085]
gaacccggatacctgactctcagcacttgtgggtgaaccataccagcaccaaggatctcaatccaacctgtat tcttgcatacgttacatcctttaccaccacacttgaagcatgacacgtcaacctcaacggaaggttcagtgaa tgggaagtaagaaggacgcaaacggattcgacgttctgcaccaaacattttttgaataatcatctcaagcgtt cccttcagatcacccattgagatgtttttaccaacgaccaaaccttcgatttggtgaaactggtggctgtgag tcgcatcatcggtatcacgacggaaaacacgtcctggtgagatcatcttaagaggacctttagaaaaatcatg tttatcaagtgtacgagcttggacaggacttgtatgagtgcgaagcaagatttcttcggtaatgtagaaagta tcttgcatatcacgaggctggatgggtct。
[0086]
实施例10嗜热链球菌jmcc0030的复配发酵特性对比实验
[0087]
本发明基于前期对高产乙醛的保加利亚乳杆菌jmcc0018菌种的发酵特性研究，提供了一种由保加利亚乳杆菌jmcc0018及嗜热链球菌jmcc0030复配成的发酵剂，并利用该发酵剂进行发酵制得乳制品，具体发酵过程按照以下步骤进行：
[0088]
一、菌株活化
[0089]
保加利亚乳杆菌jmcc0018、嗜热链球菌jmcc0030分别按照以下步骤进行活化：
[0090]
1)取10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、20g葡萄糖、5g乙酸钠、2g柠檬酸二胺、1g
吐温
‑
80、k2hpo4：2g、0.2g mgso4·
7h2o、0.05g mnso4·
7h2o、15g琼脂和1000ml蒸馏水充分溶解混匀后，调节ph至6.8，得液体mrs培养基。
[0091]
取保加利亚乳杆菌jmcc0018和嗜热链球菌jmcc0030分别接种至液体mrs培养基 (保加利亚乳杆菌jmcc0018接种至一个液体mrs培养基，嗜热链球菌jmcc0030接种至另一个液体mrs培养基)，37℃培养48h，为相应的第一代；
[0092]
2)取相应的第一代1ml，加入9ml脱脂奶中，培养16h，作为相应的第二代；
[0093]
3)取相应的第二代1ml，加入9ml脱脂奶中，培养16h，作为第三代，得相应的活化后菌种；
[0094]
二、菌粉制备
[0095]
保加利亚乳杆菌jmcc0018、嗜热链球菌jmcc0030菌粉均按照以下步骤制备：
[0096]
1)将相应的活化后菌种放入发37℃发酵罐内发酵10小时；
[0097]
2)发酵液4℃低温冷却1h后，通过管式离心机进行低温(4℃)菌体分离，并加入冻干保护剂进行乳化，得到相应的乳化液；
[0098]
3)将相应的乳化液放入真空冷冻干燥机内
‑
40℃冻干，通过金属探针检测水分活度至水活度＜0.2(常规作法)，得到相应的冻干菌体；
[0099]
4)将相应的冻干菌体放入粉碎机内进行粉碎，再过40目筛，最终制得相应的单菌株菌粉，其中菌株活菌数均≥2
×
10
10
cfu/g；
[0100]
三、复配
[0101]
分别取保加利亚乳杆菌jmcc0018菌粉和嗜热链球菌jmcc0030菌粉，按照活菌数量比1：1000进行复配，得发酵剂。
[0102]
四、发酵
[0103]
取鲜牛奶80kg、白砂糖10kg、低聚果糖10kg，调配均匀后，于60℃、15mpa下均质，95℃杀菌300s后，降温至37℃，加入10g发酵剂，37℃发酵至ph为4.2时，停止发酵，搅拌均匀后即得发酵乳i，对发酵样品进行感官品评，品评结果为顺滑，粘度、酸度适中，香气充裕。说明嗜热链球菌jmcc0030发酵特性优良，可与高产乙酸的保加利亚乳杆菌jmcc0018复配制作发酵剂应用于制备发酵乳制品。
[0104]
分别单独利用保加利亚乳杆菌jmcc0018菌粉和嗜热链球菌jmcc0030菌粉，依上述
③
发酵步骤制备发酵乳ii和发酵乳iii，对比结果如表4所示。
[0105]
表4：菌种复配发酵特性对比表
[0106] 口感粘度酸度香气发酵乳i顺滑适中适中浓郁发酵乳ii轻涩较差较弱一般发酵乳iii干涩粘稠强烈稀薄
[0107]
实施例11嗜热链球菌jmcc0030菌种复配发酵乳乙醛测定
[0108]
使用液相色谱仪对实施例10中的发酵乳i和发酵乳ii在保藏期间产生的乙醛含量进行检测，每7天检测一次，具体实验结果如表5所示(单位：μg/ml)，实验数据采用graphpad prism 5软件进行统计学分析，实验数据以平均值
±
标准差表示，两组间比较采用单因素方差t
‑
test分析，p<0.05为具有极显著差异，下同。
[0109]
表5发酵乳保藏期间乙醛量变化(单位：μg/ml)
[0110]
保藏时间0d7d14d21d发酵乳i0.19
±
0.0610.92
±
0.1723.79
±
0.24
a
25.56
±
0.33
a
发酵乳ii0.22
±
0.099.78
±
0.2120.52
±
0.1921.34
±
0.27
[0111]
注：a，与发酵乳ii相比，p<0.05；d，表示发酵天数。
[0112]
实验结果显示发酵乳i自保藏的第14天起乙醛量显著高于发酵乳ii，表明嗜热链球菌jmcc0030与保加利亚乳杆菌jmcc0018复配后发酵所得的发酵乳，其乙醛产生情况体现出显著提高，即在添加高产乙醛的保加利亚乳杆菌jmcc0018菌种基础上嗜热链球菌jmcc0030制作发酵剂，可提高其发酵产物的乙醛含量。
[0113]
实施例12嗜热链球菌jmcc0030菌种复配发酵乳粘度测定
[0114]
采用dv2tlvtj0型粘度计在温度为25℃，转速为60r/min及作用时间为1min的条件下，分别对实施例10中的发酵乳i和发酵乳ii进行检测，每7天检测一次，实验结果如表6所示(单位：cp)。
[0115]
表6发酵乳保藏期间粘度变化(单位：cp)
[0116]
保藏时间0d7d14d21d发酵乳i1029
±
41084
±2a
1149
±6a
1237
±2a
发酵乳ii1026
±
31039
±
71058
±
41083
±4[0117]
注：a，与发酵乳ii相比，p<0.05；d，表示发酵天数。
[0118]
实验结果显示自第7天起，发酵乳i的粘度显著高于发酵乳ii，且一直持续至第21天，表明添加嗜热链球菌jmcc0030后可显著提高发酵乳的粘度。
[0119]
实施例11～12表明本发明提供的嗜热链球菌jmcc0030菌种与先前已鉴定的高产乙醛的保加利亚乳杆菌jmccoo18复配后，所制发酵乳的乙醛含量无显著变化，但其粘度得到显著提升，从而提高发酵乳的口感与质构。
[0120]
实施例13嗜热链球菌jmcc0030菌种复配发酵乳中scfas含量测定
[0121]
利用气相色谱方法分析嗜热链球菌jmcc0030菌种复配发酵乳中scfas含量，具体步骤如下：
[0122]
①
调整色谱条件
[0123]
设置进样口温度为270℃，检测器温度为280℃，进样量为1μl，载气流速为1 ml/min。设置温度程序：50℃，10min，后升温至230℃，9min。
[0124]
②
样品及标准品预处理
[0125]
发酵乳i及发酵乳ii各取10ml，分别置于15ml离心管中， 进行离心，取4ml所得上清液于新的离心管中，分别加入2滴酚酞试 剂，利用koh调整液体颜色至浅粉色，三蒸水定容至5ml后，混匀并 离心，即得对应的样品x及样品y。
[0126]
取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸标准品按1：400质量比分别溶解，依上述步骤调整标准液至浅粉色状态。利用所得溶液进行7个等级的质量浓度的梯度稀释，使其质量浓度分别达到2000mg/l、1000mg/l、500mg/l、200mg/l、100mg/l、50mg/l、 20mg/l。
[0127]
③
衍生化
[0128]
取上述样品x、y及所有标准样品0.5ml至进样瓶中，分别依次加入2ml磷酸盐缓冲溶液、2ml衍生化试剂、1ml丙酮，100℃水浴40min后冷却至室温，即得相应的衍生后样品及标准品。按1：1体积利用正己烷萃取衍生后的样品，所得萃取液进行气相色谱分析，分析结
果如表7所示。
[0129]
表7发酵乳加标回收率及本底值
[0130][0131][0132]
加标量表示所加入标准品的浓度，本底值表示试样测定值，加标结果表示加标试样测定值，加标回收率的计算方法为：
[0133]
加标回收率＝(加标结果均值
‑
本底值)/加标量
×
100％
[0134]
分析表7可知，样品x的甲酸、乙酸、丙酸及丁酸浓度均高于样品y，表明发酵乳i中的scfas含量更高。
[0135]
实施例14嗜热链球菌jmcc0030菌种改善骨质疏松的特性
[0136]
取得实施例1中提供的嗜热链球菌jmcc0030菌种，使用sd大鼠去卵巢骨质疏松试验，获得了该菌种改善骨质疏松的特性。具体试验步骤如下：
[0137]
清洁级雌性sd大鼠共30只，体质量120g
±
10g，购自河北医科大学实验动物中心，生产许可证号：scxk(冀)2013
‑
1003。所有大鼠同室分笼饲养，每笼5只，普通基础饲料喂养，自由进水，昼夜光照变化周期为12h光照12h黑暗。环境温度控制(23
±
2)℃，相对湿度55％～65％。
[0138]
将30只大鼠随机分为3组：空白对照组、模型组、jmcc0030干预组。除空白对照组外，其余两组大鼠均摘除卵巢建立雌激素缺乏的骨质疏松模型。建模成功后，对各组大鼠进行经口灌胃处理，其中空白对照组与模型组依1ml/100g
·
bw灌胃蒸馏水，每日一次，共6周；jmcc0030干预组依1ml/100g
·
bw灌胃jmcc0030悬液(活菌数为 106cfu/ml)，每日新鲜配置，每日一次，共6周。
[0139]
干预结束后所有大鼠禁食不禁水12h后，眼球取血，离心，所得得血清经elisa 方法分析大鼠血清中的雌二醇(e2)含量，具体数据如表8所示。处理大鼠后取左侧股骨，进行骨密度测定，测定结果如表9所示。
[0140]
表8嗜热链球菌jmcc0030对大鼠血清中e2的影响
[0141]
组别e2(pg/ml)空白对照组237.39
±
5.82
模型组179.13
±
9.74
*
jmcc0030干预组196.79
±
11.34
#
[0142]
注：*表示与空白对照组相比，p<0.05；#表示与模型组相比，p<0.05。
[0143]
表9嗜热链球菌jmcc0030对大鼠股骨密度的影响(mg/cm2)
[0144]
组别股骨近端股骨远端股骨整体空白对照组54.23
±
0.7256.11
±
2.9355.59
±
1.44模型组48.21
±
5.21
*
41.30
±
2.85
*
47.91
±
4.37
*
jmcc0030干预组51.17
±
1.87
#
49.73
±
4.45
#
50.87
±
1.20
#
[0145]
注：同表8。
[0146]
由表8、9可看出，模型组的近端股骨、远端股骨及股骨整体骨密度均显著低于空白对照组，表示去卵巢骨质疏松模型建立成功。经jmcc0030干预后，上述指标均显著提升，表明jmcc0030可以提高血液中e2浓度，使得干预组的e2浓度接近空白对照组，从而提高干预组的骨密度，改善雌激素缺乏引起的骨质疏松症，即可表明本发明提供的嗜热链球菌jmcc0030菌种具有改善骨质疏松的特性。
[0147]
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。