经修饰的宿主细胞的建立方法与流程

本申请是国际申请号pct/jp2013/077629，国际申请日2013年10月10日，中国申请号201380052944.7，发明名称为“经修饰的宿主细胞的建立方法”的专利申请的分案申请。

【技术领域】

本发明涉及使用培养动物细胞的重组蛋白质的制造，更具体而言涉及建立如可有效制造目的蛋白质的宿主细胞的技术。

背景技术：

使用基因重组技术生产作为医药有用的蛋白质时，使用动物细胞，则由于原核细胞实现不了的复杂的翻译后修饰或折叠变得可能，从而动物细胞作为用于重组蛋白质生产的宿主细胞而多用。

近年、抗体或生理活性蛋白质等的多种生物药品辈出，但在动物细胞中有效生产重组蛋白质的技术与生物药品的低成本化连系，约束向患者的稳定的供给。

从而，期望生产效率更高的蛋白质的制造方法。

知通过向宿主细胞，除目的蛋白质的基因之外，导入其他结构基因而使以高的表达量表达，从而使目的蛋白质的生产效率升高的技术。

例如，公开有包括培养高表达作为膜输送蛋白质的牛磺酸转运子(taut)基因、并且导入编码希望得到的蛋白质的dna的细胞的蛋白质的制造方法(专利文献1：wo2007/119774、专利文献2：wo2009/051109)。

另外公开有，通过使用导入作为牛磺酸合成途径的酶的半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)基因的细胞来增加希望得到的蛋白质的生产量(专利文献3：wo2008/114673)。

另外公开有，通过使用导入丙氨酸氨基转移酶(alt)基因的细胞而使希望得到的蛋白质的生产量增加(专利文献4：w02009/020144)。丙氨酸氨基转移酶是使从丙氨酸生成谷氨酸的酶，也被知为人肝细胞中含的酶gtp(谷氨酰胺-丙酮酸转氨酶)。

另外公开有，通过使用导入有碳酸氢根转运子功能的阴离子交换剂(ae)的基因的细胞而使希望得到的蛋白质的生产量增加(专利文献5：wo2009/054433)。

再公开有，csad和taut的共表达、alt和taut的共表达、碳酸氢根转运子和csad、或者碳酸氢根转运子和alt的共表达结果，更加增加希望得到的蛋白质的生产量(专利文献3-5)。

但是，本发明人，从至今的研究发现，向宿主细胞导入2种外来基因时，即使是名自单独导入则可建立该基因稳定地表达的细胞株的情况，也有无法建立使所述2种外来基因一同稳定地高表达的细胞株的情况。此时，与至少一方的所述外来基因相同的基因或对应基因的在宿主细胞的表达量用qpcr在检测限界以下时，导致无法建立使2种基因一同稳定地高表达的细胞株。特别是，有相同的功能的蛋白质的基因或与相同的代谢系统反应相关的酶的基因、例如，使2种膜输送蛋白质一同高表达的宿主细胞或使2种酶一同高表达的宿主细胞的建立是不可能的。另外，glycart公司的2种糖链关联酶基因在宿主细胞中表达，但再使高表达的宿主细胞来源的抗体产生细胞由于酶基因表达不稳定，见到抗体的无岩藻糖基含量脱离期待的范围的事例。

如此，使不同的2种以上的基因高表达伴随多个困难。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：wo2007/119774

专利文献2：wo2009/051109

专利文献3：wo2008/114673

专利文献4：wo2009/020144

专利文献5：wo2009/054433

技术实现要素：

【发明要解决的技术课题】

本发明提供在重组蛋白质生产中使用的宿主细胞中，用于使表达困难的基因稳定地高表达的新颖的技术。另外，也提供建立倍增时间短、稳定增殖的细胞株的技术。

【解决课题的技术方案】

本发明人的研究组以前发现了，作为不编码蛋白质的核酸序列，通过在宿主细胞内作为rna表达，控制nfkbia(核因子κb抑制剂α、或者i-κb(抑制剂-κb))的表达，有使重组抗体等的蛋白质的产生能力升高的功能的特定的核酸序列(pct/jp2012/058577(wo2012/137683))。本发明人将有那样的功能的rna或dna或它们的序列总称而命名为apes(抗体产生增强序列)(根据情况，也称为ppes(多肽产生增强序列))。

apes被认为是，经nfkbia(或者i-κb)的表达抑制而活化nf-κ(κ)b的功能性核酸。另外，作为有这样的功能的核酸，也知kshvmirna-k1等(lei，xiufenetal.，nat.cell.biol.，12(2)，p193-199，2010)。

这次，本发明人发现了apes的新的用途。

即，本发明人发现，apes使(1)在通常的细胞中使表达困难的特定的基因高表达的细胞的构建，或(2)在通常的细胞中建立困难的使不同的2种以上的基因稳定地高表达的细胞的构建成为可能，具有使导入基因稳定地高表达的功能。

从而，本申请提供通过将apes基因导入宿主细胞，使表达困难的外来基因或表达不稳定的外来基因在所述细胞内稳定地高表达的方法。

另外，本申请提供，通过向宿主细胞导入apes基因，建立倍增时间快，稳定增殖的细胞的方法。

apes基因是编码抑制nfkbia的表达的非编码rna(不翻译成蛋白质的rna)的dna。

本申请发明的要点如下。

(1)建立可使2个以上的外来基因稳定地表达的用于重组蛋白质生产的细胞株的方法，其包括：向细胞导入抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因，使该基因表达。

(2)(1)的方法，其中2个以上的外来基因编码同时稳定地表达困难的蛋白质。

(3)(2)的方法，其特征在于，同时稳定地表达困难的蛋白质均属于有类似的功能的蛋白质。

(4)(3)的方法，其中有类似的功能的蛋白质是转运子或代谢酶。

(5)(1)～(4)的方法，其中向细胞导入2种以上的转运子(taut和ae1)的基因。

(6)(1)～(4)的方法，其中向细胞导入2种以上的代谢酶(丙酮酸代谢途径的酶、alt1和pc)的基因。

(7)(1)～(4)的方法，其中向细胞导入taut及2种代谢酶的基因。

(8)构建倍增时间快的细胞的方法，其包括：向细胞导入含抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因的dna构建物，使该非编码rna在细胞内表达。

(9)细胞，其中向细胞导入抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因，使该基因表达，并且，使2个以上的外来基因稳定地表达。

(10)(1)～(8)的方法或者(9)的细胞，其中抑制nfkbia的表达的非编码rna是含可由碱基对形成结合于nfkbia的mrna的一部分的19～25碱基长的连续的序列的至30个碱基长的低分子rna。

(11)(1)～(8)的方法、或者(9)的细胞，其中抑制nfkbia的表达的非编码rna是含可由碱基对形成结合于nfkbia的mrna的一部分的19～25碱基长的连续的序列的至561碱基长的mrna型非编码rna。

(12)(1)～(8)的方法、或者(9)的细胞，其中抑制nfkbia的表达的非编码rna是含可由碱基对形成结合于nfkbia的mrna的一部分的19～25碱基长的连续的序列的561～1579碱基长的mrna型非编码rna。

(13)(10)～(12)的方法或细胞，其中19～25个碱基长的连续的序列是seqidno：2所示的碱基序列中的任意的部分序列或其互补序列。

(14)(1)～(8)的方法、或者(9)的细胞，其中抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因是有seqidno：1～16及29之任一个的碱基序列。

(15)(1)～(8)的方法、或者(9)的细胞，其中抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因是有以下的碱基序列或其互补序列的dna：

(a)可由碱基对形成结合于seqidno：1～16及29之任一个的碱基序列的序列；

(b)与seqidno：1～16及29之任一个的碱基序列除1或数碱基外相同的碱基序列；

(c)含seqidno：1～16及29之任一个的碱基序列的，nfkbia基因的3’侧非翻译区域的部分序列；

(d)与上述(c)的序列除1或数碱基外相同的碱基序列。

(16)(1)～(8)的方法或(9)的细胞，其中向细胞再导入有希望得到的蛋白质的基因。

(17)(16)的方法或细胞，其中希望得到的蛋白质是抗体。

(18)上述(1)所述的建立可使2个以上的外来基因稳定地表达的用于重组蛋白质生产的细胞株的方法，其包括：

向细胞导入第1外来基因及抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因，使这些基因表达，及

向细胞导入与第1外来基因同时稳定地表达困难的第2外来基因，

其中

第1和第2外来基因是编码蛋白质的基因，

建立表达抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因、及编码蛋白质的第1和第2外来基因的重组蛋白质生产用的细胞株。

(19)上述(1)所述的可建立使2个以上的外来基因稳定地表达的用于重组蛋白质生产的细胞株的方法，其包括：

向细胞导入第1外来基因及抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因，使这些基因表达，

向细胞导入第2外来基因，及

向细胞导入与第2外来基因同时稳定地表达困难的第3外来基因，其中

第1、第2、及第3外来基因是编码蛋白质的基因，

建立表达抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因、及编码蛋白质的第1、第2、第3外来基因的重组蛋白质生产用的细胞株。

(20)(18)或(19)所述的方法，其中第1外来基因是taut(牛磺酸转运子)基因。

(21)(18)～(20)之任一项所述的方法，其中向细胞再导入希望得到的蛋白质的基因，建立所述希望得到的蛋白质的生产用的宿主细胞株。

【发明效果】

由本发明可在宿主细胞中使各种的外来基因稳定地高表达。从而，利用本发明，可将在通常的细胞中表达困难的多肽制造成药品。另外，提高表达困难的抗原蛋白质的表达量，对那样的抗原的抗体的开发变得容易。另外，由本发明可构建使多个基因稳定地高表达的细胞，从而重组多个有用基因的，用于产生重组蛋白质的宿主细胞的制作变得可能。

另外，由本发明的别的实施方式，可建立倍增时间快、稳定增殖的细胞。从而，在使用培养动物细胞的重组蛋白质的生产中，将那样的细胞作为宿主利用，则可有效生产目的蛋白质。

【附图说明】

【图1】图1示鉴定的ai462015转录产物的在序列及小鼠基因组的位置。(参考例1)

【图2】图2示在cho-dg44细胞中使mab1(抗il-6受体抗体)高表达的产生抗体的细胞的继代培养第3天的ai462015转录产物的表达强度。(参考例2)

【图3】图3示在cho-dxb11s细胞中使mab2(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体)高表达的产生抗体的细胞的继代培养第3天的ai462015转录产物的表达强度。(参考例2)

【图4】图4示在mab2(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体)产生细胞的il罐流加培养第3天的ai462015转录产物的表达强度。(参考例2)

【图5】图5示在产生mab2的细胞的il罐的流加培养后期第13天的ai462015转录产物的表达强度之上调。(参考例2)

【图6】图6示在mab1(抗il-6受体抗体)产生潜力低的细胞的1l罐流加培养第3天的ai462015转录产物的表达强度。(参考例2)

【图7】图7是转录产物ai462015(437p)之一部分序列434bp的表达质粒。(参考例3)

【图8】图8是转录产物ai462015(437p)之一部分序列165bp的表达质粒。(参考例3)

【图9】图9是作为对照仅使潮霉素抗性基因表达的质粒。(参考例3)

【图10】图10示由转录产物ai462015(437p)的一部分序列的强表达而增加mab1产生量。(参考例3)

【图11】图11示在抗体高产生细胞的转录产物ai462015的强表达和nfkbia表达抑制。(参考例4)

【图12】图12示nfkbia表达定量中使用的探针组。(参考例4)

【图13】图13示在抗体高产生细胞的nfkbia表达抑制的定量结果。(参考例4)

【图14】图14示小鼠mcmvie2启动子上(seqidno：23)的8个的nfkb结合部位(加下划线部)。(参考例4)

【图15】图15是表达microrna的解析法的概略。(参考例5)

【图16】图16示在抗体高产生细胞中高表达的microrna来源的pcr产物。(参考例5)

【图17】图17是在表达phyg-taut的细胞中使转录产物ai642048(437p)的一部分序列165bp共表达的质粒ppur-apes165及使alt1共表达的ppur-alt1。(参考例6)

【图18】图18是示由apes强表达的细胞高增殖、抗体高产生效果的摇床流加培养的结果。(参考例6)

【图19】图19是示由apes强表达的细胞高增殖、抗体高产生效果的l-jar流加培养的结果。(参考例6)

【图20】图20示apes165强表达宿主候选细胞(9株)的apes表达量和活细胞密度的相关。(参考例6)

【图21】图21示由转录产物ai462015(437p)的一部分序列apes165的更部分序列的强表达而mab1产生量增加。(参考例7)

【图22】图22示在图21中有抗体高产生效果的apes165的再部分序列含nfkbia互补序列。(参考例7)

【图23】图23示ai462015是小鼠nfkbiamrna的互补链。(参考例1)

【图24】图24示在cho-k1细胞基因组中存在ai462015的相同序列。(参考例1)

【图25】图25(a)示自ai462015的一部分序列(5′末端第7-第91)跨种保守。(参考例1)图25(b)示自ai462015的一部分序列(5′末端第7-第91)跨种保守。(参考例1)

图25(c)示自ai462015的一部分序列(5′末端7-第91)跨种保守。(参考例1)图25(d)示自ai462015的一部分序列(5′末端7-第91)跨种保守。(参考例1)

图25(e)示自ai462015的一部分序列(5′末端7-第91)跨种保守。(参考例1)

【图26】dxb11/taut/apes(dtp)细胞的建立。(实施例1)

【图27】示仓鼠taut、人alt1、及nfkbia的mrna表达水平。(实施例1)

【图28】dxb11/taut/apes/ae1(dtpe)细胞的建立。(实施例1)

【图29】dxb11/taut/apes/alt1/pc(dtplc)细胞的建立。(实施例1)。

【图30】向dxb11/taut/alt1(dtl)细胞导入表达人pc的质粒pneo-pc，但dxb11/taut/alt1/pc(dtlc)未建立。(实施例1)

【图31】dxb11(dhfr-)及dt宿主的倍增时间。(实施例2)

【图32】由各种的基因的强制表达的经修饰的宿主的制作。(实施例2)

【图33】经修饰的宿主的倍增时间。(实施例2)

【实施方式】

以下，对本发明的实施方式更详细地进行说明。

【(1)apes(抗体产生增强序列)】

apes是使作为nf-κb的抑制蛋白质的i-κb失活的核酸分子，更具体而言，是抑制作为i-κb的控制亚基的i-κbα(nfkbia)的基因表达的核酸分子。那样的核酸分子的本体是抑制nfkbia的表达的非编码rna，但apes是非编码rna自体、或者编码其rna的dna或它们的序列的总称。

或者，apes是含可由碱基对形成结合于作为人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的nfkbia的基因的dna或mrna，抑制nfkbia的表达的碱基序列的核酸分子。那样的核酸分子被认为可与nfkbia基因dna或mrna结合而抑制其表达。apes是例如，对nfkbia的mrna的rna干涉的分子。

或者，apes可为含可由碱基对形成结合于人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的nfkbia的基因dna或mrna的序列的，双链rna(dsrna)、或者作为短的dsrna的sirna、或者解离为单链的sirna、或者shrna、反义dna或rna、microrna(mirna)或mrna型非编码rna。

或者，apes是在序列的一部分中含由人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的nfkbia基因dna或mrna的互补序列组成的碱基序列、或者那样的互补序列的碱基序列，是含可抑制nfkbia的表达的碱基序列的核酸分子。

或者，apes是人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的nfkbia基因dna或mrna的部分序列或那样的部分序列的互补序列，是含可抑制nfkbia的表达的碱基序列的核酸分子。

例如，apes可为由含与作为目标的nfkbiamrna的一部分相同或互补的序列的序列组成的寡核苷酸。作为那样的寡核苷酸的例，可举出与nfkbiamrna互补链的19～25个碱基相当的序列、或者与所述序列除一个碱基外具有相同序列、并且有抑制nfkbia的表达的效果的低分子rna。其中，低分子rna是指小非编码rna(snrna)，在snrna中包括mirna。

或者，apes也可为长链的mrna型非编码rna，例如由含可由碱基对形成结合于nfkbia的基因dna或mrna的序列的长度至561个核苷酸长(561mer)的序列组成，并且可有抑制nfkbia的表达的效果。或者，apes再也可为长链(数百～数十万核苷酸)的mrna型非编码rna。例如，apes可为200-10万核苷酸长、或者，300～30万核苷酸长的核酸分子或序列。apes也可为含与nfkbia的mrna的一部分互补的序列(例如上述的snrna序列)的，561～1579碱基长、或者500～1000碱基长的mrna型非编码rna。

可由碱基对形成结合的序列不限于完全地对合(即100％互补)，在对功能无障碍的范围内也容许不对合碱基的存在。或者，由apes的形态宁可优选部分互补性。从而，例如，与含nfkbia的非翻译区域的基因dna或mrna至少70％、更优选为80％、再优选为90％、最优选为95％相同的序列或其互补序列也包括在“可由碱基对形成结合的序列”中。例如，包含在与561聚体或500聚体的mrna型非编码rna至少90％相同的序列中，是含由碱基的插入、缺失、或者点突变的1～50个(或者561聚体的情况是1～56个)的错配碱基的变异序列，伴随其在宿主细胞中的表达，抗体等的重组多肽的产生能力增大，或者，有抑制nfkbia的表达的功能。从而认为，有例如如70％以上的相同性一样的，某程度的序列类似性的，与宿主细胞不同的生物种来源的nfkbia直系同原物(异种间相同基因)来源的序列也可作为apes利用。

或者，可由碱基对形成结合的序列是指包含可在如细胞内一样的条件下与nfkbia的mrna结合的序列。那样的序列，例如，包括作为高度严格的条件，在本领域技术人员公知的条件下杂交，并且有希望得到的功能的序列。高度严格的条件之一例是，使多核苷酸和其他多核苷酸在含6×sspe或ssc、50％甲酰胺、5×denhardt试剂、0.5％sds、100μg/ml片段化的变性鲑鱼精子dna的杂交缓冲液中，于42℃的杂交温度温育12～16小时(其中一方的多核苷酸也可附着于如膜一样的固体表面)，接着，使用含1×ssc、0.5％sds的清洗缓冲液，于42℃以上的最适温度清洗数次。对于其他具体的条件，请参照sambrook等“molecularcloning：alaboratorymanual第3版”coldspringharborlaboratorypr；及，ausubel等“分子生物学实验流程”丸善等多种本领域技术人员公知的实验手册。

apes的别的一实施方式是含是与人、小鼠、大鼠或仓鼠来源的nfkbia的mrna3’侧非翻译区域的部分序列相同或互补的序列，且可抑制nfkbia的表达的碱基序列的核酸分子。

如在后述的参考例中说明，本发明人发现了在培养cho细胞中与抗体产生能力相关而表达量变高的mrna型非编码rna。此rna被鉴定为小鼠基因组中的由437个碱基组成的公知序列(图1、genbankaccessionid：ai462015、seqidno：1)的转录产物。ai462015的在序列及小鼠基因组上的位置示于图1。作为ai462015的转录产物的437碱基与小鼠nfkbiamrna3’侧非翻译区域(513碱基)的互补链相当(图23)。再者，本发明人发现，通过向宿主细胞导入有ai462015来源的一部分的序列的核酸分子而使表达，可使希望得到的多肽的生产量增加。

上述的ai462015来源的序列或其一部分的序列不仅在小鼠、仓鼠等的啮齿类，在人中也保守，在其他哺乳动物或鱼类、昆虫等的动物中也被认为是保守性高的序列。从而，对应于ai462015来源的序列或其一部分的序列的各种动物细胞的来源的nfkbiamrna3’侧非翻译区域的部分序列或其互补序列也可作为本发明的apes的序列使用。

apes之一的具体例是在小鼠ai462015来源的一部分的序列、或者那样的部分序列中有1～数个的碱基取代、缺损或附加的序列。特别是，可举出由自5’侧第4g～第168c的碱基序列组成的165个碱基的dna序列(seqidno：2、apes165)、或者其互补(反义)dna序列或含自这些dna转录的rna序列的序列、或者此序列中的任意的长度的部分序列。或者，可举出由自5’侧第4g至3’末端的t的碱基序列组成的434碱基的dna序列(seqidno：3、apes434)、或者其互补(反义)dna序列或含自这些dna转录的rna序列的序列、或者来源于此序列的任意的长度的部分序列。在含对应于小鼠ai462015的序列的人、仓鼠、大鼠等的哺乳类来源的序列的序列或它们的部分序列、或者那样的部分序列中也包括1～数个的碱基被取代、缺损或附加的碱基序列。

在一实施方式中，apes有ai462015中的5’侧第4～第133碱基序列(seqidno：4、apes130)或此序列来源的一部分的序列。例如，可举出5’侧第4～第68(seqidno：5、apes4-68)、或者第69～第133(seqidno：6、apes69-133)的dna序列或其互补dna序列或自这些dna转录的序列。

在一实施方式中，apes有ai462015中的5’侧第40～第9152碱基(seqidno：7)的序列、或者该52个碱基在任意的位置被切断的一部分序列来源的序列。例如，可举出前半部分(apes40-68的29碱基、或者apes40-63的24碱基、或者apes40-61的22碱基)或后半部分(apes69-91的23碱基)的dna序列或其互补dna序列(各自与seqidno：8～11相当)或自这些dna转录的序列。

上述的52碱基是除一碱基外与大鼠nfkbia基因的3’侧非翻译区域的互补链相同序列。另外，其5’侧的24碱基(apes40-63、seqidno：9)是与人nfkbia基因的3’侧非翻译区域相同序列。另外，5’侧的22碱基(apes40-61、seqidno：10：aagtaccaaaataattaccaac)是与跨大鼠、恒河猴、狗、马等种的nfkbiamrna的3’侧非翻译区域的互补链相同序列。通过使与nfkbia基因的3’侧非翻译区域互补的一部分的序列在宿主细胞中表达来期待rnai效果。例如，有与上述52碱基中的19～25碱基互补的序列的rna有通过作为microrna(mirna)作用于nfkbia的mrna的非翻译区域而抑制翻译的可能性。

或者，apes有ai462015中的5’侧第7～第9185碱基(seqidno：29)的序列、或者该85碱基在任意的位置被切断的一部分序列来源的序列。有与上述85碱基中的19～25碱基互补的序列的rna有通过作为microrna(mirna)作用于nfkbia的mrna的非翻译区域而抑制翻译的可能性。

在一实施方式中，apes有用21个碱基的sirna检索发现的序列。例如是含与ai462015中的第84～第104(seqidno：12、apes84-104)、第99～第119(seqidno：13、apes99-119)、第101～第121(seqidno：14、apes101-121)的dna序列互补的序列的mirna序列。上述的apes69～133中的第71～第112序列(seqidno：16)在genechip上被定量，实际上是高表达的区域，认为apes84-104作为mirna发挥功能的可能性高。

在别之一实施方式中，apes也可为抑制nfkbia的表达的公知的非编码rna。作为那样的核酸分子的例，可举出kshv(卡波西肉瘤伴随病毒)mirna-k1(序列信息参照xcaietal.，procnatlacadsciusa.2005april12；102(15)：5570-5575等)。

另外，基于apes的结构的或功能的特征，从化学合成或生物源新单离有作为apes的活性的核酸分子是可能的。apes的结构特征是含与作为目标的nfkbiamrna的一部分互补的序列的核酸分子。核酸分子的形态可为任何形态，不管是dna、dna的转录产物、mrna、edna，或是外来体rna，或是化学合成单链rna，或是化学合成双链rna等。功能的特征是伴随其在宿主细胞中的表达，抗体等的重组多肽的产生能力增大，或者，nfkbia的表达被抑制。

在从生物源单离apes时，可为任何生物来源，不特别限定。具体而言，可举出人、黑猩猩等的灵长类、小鼠、大鼠、仓鼠等的啮齿类、牛、猪、山羊、等的家畜类、鸡等的鸟类、斑马鱼等的鱼类、苍蝇等的昆虫类、线虫类等的动物来源的apes，优选为与人、啮齿类或宿主细胞相同的种来源的apes，例如，在使apes强表达的细胞是中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)时，优选为人、小鼠或仓鼠来源的apes。

这样的核酸分子可由本领域技术人员公知的方法制备。例如，由高产生抗体等的重组多肽的培养细胞制备总rna，基于本发明的核酸序列(例如seqidno：2的apes165)合成寡核苷酸，将其作为引物使用而进行pcr反应，也可通过使有作为apes的特征的cdna扩增而制备。另外，由高产生抗体等的重组多肽的培养细胞制备低分子rna后，制作cdna库，基于克隆的cdna的碱基序列，可得到含与nfkbiamrna互补的部分序列的低分子rna。cdna库也可在制备microrna(mirna)等的低分子rna后，例如由sambrook，j.etal.，molecularcloning、coldspringharborlaboratorypress(1989)所述的方法构建。

另外，通过确定得到的cdna的碱基序列，通过将得到的cdna作为探针筛选基因组dna库，可单离apes被表达的基因组dna。

具体而言，如以下一样即可。首先，从有表达本发明的apes的可能性的细胞、组织等，单离总rna。mrna的单离由公知的方法、例如，胍超离心法(chirgwin，j.m.etal.，biochemistry(1979)18，5294-5299)、agpc法(chomczynski，p.及sacchi，n.，anal.biochem.(1987)162，156-159)等制备总rna之后，使用rneasymini试剂盒(qiagen)等再纯化总rna。

从得到的总rna使用逆转录酶合成cdna。cdna的合成也可使用superscript^tmii逆转录酶(invitrogen)等进行。另外，使用引物等，使用5′-amplifinderrace试剂盒(clontech制)及根据聚合酶链式反应(polymerasechainreaction；pcr)的5′-race法(frohman，m.a.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1988)85，8998-9002；belyavsky，a.etal.，nucleicacidsres.(1989)17，2919-2932)，可进行cdna的合成及扩增。

从得到的pcr产物制备作为目的的dna片段，与载体dna连结。再者，由此制作重组载体，向大肠杆菌等导入，选择集落而制备希望得到的重组载体。作为目的的dna的碱基序列可由公知的方法、例如，二脱氧核苷酸链终止法确认。

另外，得到的dna可由市售的试剂盒或公知的方法修饰。作为修饰，例如，可举出由定点诱变法的一碱基变异导入等。如此修饰的序列，只要有apes活性，也可包括在本发明的范围内。其中，“有apes活性的”是指通过在宿主细胞内表达而有抑制nfkbia(i-κbα)的表达的功能。

在本说明书中中，将有apes活性的核酸分子称为本发明的核酸分子。

【(2)apes的向宿主细胞的导入及表达】

本发明包括向宿主细胞导入含apes、即，抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因，再使apes表达，优选为使apes强表达。

强表达apes是指与原来的细胞比较apes的表达量增加。原来的细胞不特别限定，但例如可举出cho细胞等制造重组蛋白质时作为宿主使用的细胞。作为具体例，随后述的参考例进行说明，在使用affymetrix公司的寡核苷酸阵列(affymetrixmouse430_2)的genechip实验中，抗体基因导入前的原来的细胞是ai462015的信号值是2000以下的细胞，与这相比apes的表达量增加是指，例如，ai462015的信号值成2倍以上。

导入有apes基因、强表达apes的细胞在细胞内含内源性或外来的apes。作为强表达apes的细胞，例如，可举出人为地导入apes的细胞。

人为地导入apes的细胞可由本领域技术人员公知的方法制作，例如，可通过将编码apes的dna序列整合入载体，将该载体转化到细胞来制作。

再者，在本说明书中，由基因活化技术(参照例如，国际公开第wo94/12650号单行本)活化内源性apes，结果，强表达apes的细胞也包含在人为地导入apes的细胞中。

内源性apes的典型例是作为在宿主细胞的基因组上编码的dna序列的apes。另外，在本发明中，不根据基因活化技术，也可利用例如，抗体基因导入后，由任何要因内源性apes的转录被活化，强表达的细胞。

【(3)表达载体】

表达载体对于在宿主细胞中使apes强表达，及对于使转运子或代谢酶等的外来的多肽表达有用。另外，作为药品的有效成分或抗原有用的外来的多肽的表达也使用表达载体。

作为本发明中可使用的表达载体，例如，可举出哺乳动物来源的表达载体(例如，pcdna3(invitrogen公司制)或，pegf-bos(nucleicacids.res.1990，18(17)，p5322)、pef、pcdm8)、昆虫细胞来源的表达载体(例如“bac-to-bac表达杆状病毒的系统统”(gibcobrl公司制)、pbacpak8)、植物来源的表达载体(例如pmh1、pmh2)、动物病毒来源的表达载体(例如，phsv、pmv、padexlcw)、反转录病毒来源的表达载体(例如，pzipneo)、酵母来源的表达载体(例如，“pichia表达试剂盒”(invitrogen公司制)、pnv11、sp-q01)、枯草芽孢杆菌来源的表达载体(例如，ppl608、pkth50)等。

用于使外来的多肽表达的表达载体含可推进编码该多肽的dna及所述dna的表达的表达控制序列。同样地，用于使apes表达的表达载体含可推进编码apes的dna及所述dna的表达的表达控制序列。也可构建为由单个载体使一种以上的多肽及apes表达。使用基因活化技术，例如活化如作为宿主基因组的一部分的apes或多肽基因时，也可导入促进那样的宿主细胞来源的dna的表达的表达控制序列。

作为表达控制序列的例，有适当的启动子、增强子、转录终止子、含编码蛋白质的基因中的起始密码子(即atg)的kozak序列、内含子用的剪接信号、聚乙酰化部位、及终止密码子等，载体的构建可由本领域技术人员适宜进行。

表达控制序列优选含在使用的动物细胞中可使基因的转录量增大的启动子/增强子区域。与编码希望得到的多肽的基因的表达相关的启动子/增强子区域可含nf-κb结合序列，也可不含。

在以cho细胞、cos细胞、nih3t3细胞等的在哺乳动物细胞的表达作为目的时，优选具有对于在细胞内表达必要的启动子、例如sv40启动子(mulligan等，nature(1979)277，108)、mmlv-ltr启动子、ef1α启动子(mizushima等，nucleicacidsres.(1990)18，5322)、cmv启动子等。另外，再优选有用于挑选向细胞的转化的基因(例如，如可由药剂(新霉素、g418等)判别的药剂抗性基因)。作为有这样的特性的载体，例如，可举出pmam、pdr2、pbk-rsv、pbk-cmv、poprsv、pop13等。

再者，使基因稳定地表达，并且，在以在细胞内的基因的拷贝数的扩增作为目的时，可举出向缺损核酸合成途径的cho细胞导入有与其互补的dhfr基因的载体(例如，pchoi等)，由甲氨蝶呤(mtx)扩增的方法，另外，在以基因的瞬时的表达作为目的时，可举出使用在染色体上具有表达sv40t抗原的基因的cos细胞，用具有sv40的复制起点的载体(pcd等)转化的方法。作为复制起始点，另外，也可使用多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(bpv)等的来源的复制起始点。再者，为了在宿主细胞系统中基因拷贝数扩增，作为表达载体可含选择标志物，氨基糖苷转移酶(aph)基因、胸腺嘧啶激酶(tk)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。

【(4)宿主细胞】

在本发明中使用的宿主细胞不特别限定，可为动物细胞、植物细胞、酵母等的真核细胞、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等的原核细胞等何的细胞，优选为昆虫、鱼、两栖类、爬行类、哺乳类来源的动物细胞，特别优选为是哺乳动物细胞。作为哺乳动物细胞的来源，可举出人、黑猩猩等的灵长类、小鼠、大鼠、仓鼠等的啮齿类、其他，优选为人、啮齿类。作为再本发明的细胞，优选通常在多肽的表达中常使用的，cho细胞、cos细胞、3t3细胞、骨髓瘤细胞、bhk细胞、hela细胞、vero细胞等的哺乳动物培养细胞。

在以作为药品或抗原有用的多肽的大量表达作为目的时，特别优选为cho细胞。作为cho细胞，特别是，可适宜地使用作为缺损dhfr基因的cho细胞的dhfr-cho(proc.natl.acad.sci.usa(1980)77，4216-4220)或chok-1(proc.natl.acad.sci.usa(1968)60，1275)。

作为上述的cho细胞，特别优选为dg44株、dxb-11株、k-1、cho-s，特别优选为dg44株及dxb-11株。

宿主细胞，例如，可作为用于药品或如抗原一样的希望得到的多肽的制造的产生系统使用。那样的细胞可为可产生希望得到的多肽的天然的细胞，也可为导入编码希望得到的多肽的dna的细胞，但优选为导入编码希望得到的多肽的dna的转化细胞。

导入编码希望得到的多肽的dna的转化细胞之一例是被转染至少含编码希望得到的多肽的dna的表达载体的宿主细胞。

再者，在本发明中，“导入dna(或者基因)的”细胞，除了被转染外来性dna的细胞之外、也包含由基因活化技术(参照例如，国际公开第wo94/12650号单行本)内源性dna被活化，结果，对应于所述dna的蛋白质的表达或所述dna的转录开始或增加的细胞。

使用人为地导入apes的细胞制造希望得到的多肽时，apes和编码希望得到的多肽的基因的导入的顺序不特别限制，可在导入apes之后，导入编码希望得到的多肽的基因，也可在导入编码希望得到的多肽的基因之后，导入apes。另外、也可同时导入apes和编码希望得到的多肽的基因。

使用载体时，apes及编码希望得到的多肽的基因的导入可由单个载体同时导入，也可使用多个载体分别导入。

【(5)外来基因】

在本发明中，通过向宿主细胞预先导入apes而使强表达，可将表达困难的外来基因或表达不稳定的外来基因在细胞内稳定地高表达。

将宿主细胞用于希望得到的多肽的制造时，除了作为制造的目的的希望得到的多肽的基因之外，可导入其以外的外来基因，在细胞内稳定地高表达。

优选通过在导入有编码希望得到的多肽的dna的转化细胞内表达外来基因，希望得到的多肽的生产量增加。作为那样的外来基因，可举出编码牛磺酸转运子(taut)、半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、阴离子交换剂(ae)、丙酮酸羧化酶(pc)、x-盒结合蛋白(xbp-1)等的dna。

在本发明中，通过向宿主细胞预先导入apes而使强表达，可向所述宿主细胞导入希望得到的蛋白质的基因以外的多个外来基因而稳定地表达。通过在宿主细胞中，除了希望得到的多肽的基因之外，优选表达其以外的特定的2个以上的外来基因，希望得到的多肽的生产量增加。结果，建立对于重组蛋白质生产适宜的细胞株变得可能。

那样的2个以上的外来基因可为编码同时稳定地表达困难的蛋白质的基因。即，通过向宿主细胞预先导入apes而使强表达，使希望得到的多肽的基因以外的同时稳定地表达困难的2个以上的外来基因同时稳定地表达变得可能。从而，“同时稳定地表达困难”是指，在宿主细胞中未导入apes的状态下，无同时稳定地表达的，编码2个以上的蛋白质的外来基因的组合。

其中，“同时稳定地表达困难的2个以上的外来基因”是指，向未导入apes的动物细胞、优选导入希望得到的蛋白质的基因之前的宿主细胞各自单独导入，则可建立其外来基因稳定地表达的细胞株，但在进行导入2个以上这些外来基因的处理之后，进行由药剂等的挑选处理，也得不到同时表达所述编码2个以上的蛋白质的外来基因的细胞的基因。此时，与至少一方的所述外来基因相同的基因或对应基因的，所述外来基因导入前的宿主细胞中的表达量优选用qpcr在检测限界以下。

另外，本发明的细胞即使是可导入编码2个以上的蛋白质的外来基因的，用于产生希望得到的蛋白质的宿主细胞，在导入希望得到的蛋白质的基因之后，至少2次、由mtx等的药剂处理进行用于希望得到的蛋白质的基因扩增的挑选处理时，所述挑选处理前的所述编码2个以上的蛋白质的外来基因之中至少1个基因的表达量不足50％、优选为30％以下，再优选为10％以下，最优选为表达消失之时，在本发明中将这样的基因称为“同时稳定地表达困难的2个以上的外来基因”。

另外，作为别的侧面，“同时稳定地表达困难的2个以上的外来基因”是指，导入编码2个以上的蛋白质的外来基因，挑选未导入apes的细胞之时的，与所述外来基因的表达量相比，对所述细胞进行至少15世代继代培养之后，所述编码2个以上的蛋白质的外来基因之中至少1个基因的表达量不足50％、优选为30％以下，再优选为10％以下，最优选为表达消失了的基因。

“同时稳定地表达的”是指，具体而言，本发明的细胞是用于产生希望得到的蛋白质的宿主细胞时，导入编码2个以上的蛋白质的外来基因的，向含apes的宿主细胞导入希望得到的蛋白质的基因之后，即使至少2次、由mtx等的药剂处理而进行用于希望得到的蛋白质的基因扩增的挑选处理，所述挑选处理前的所述编码2个以上的蛋白质的外来基因的表达量仍各自维持50％以上、优选为70％以上的表达量的状态。

另外，作为别的侧面“同时稳定地表达的”是指，挑选导入2个以上的外来基因的细胞之时的，与所述外来基因的表达量相比，即使对所述细胞进行至少15世代继代培养之后，所述编码2个以上的蛋白质的外来基因的表达量仍各自维持50％以上、优选为70％以上、再优选为80％以上的表达量的状态。

在本发明中，如上所述，将维持2个以上的外来基因“同时稳定地表达的”状态的细胞株称为建立的细胞株。

本发明中的“同时稳定地表达困难的蛋白质”可属于有类似的功能的蛋白质。同时稳定地表达困难的，作为有类似的功能的蛋白质的组合的例，可举出2种以上的膜输送蛋白质或对于其发挥功能必要的辅助蛋白或2种以上的酶蛋白质、优选为与相同的代谢途径相关的代谢酶或2种以上的转录因子的组合。

或者，同时稳定地表达困难的蛋白质的组合也可为2种以上的膜输送蛋白质和1或2种以上的酶蛋白质的组合。或者，同时稳定地表达困难的蛋白质的组合也可为1或2种以上的膜输送蛋白质和2种以上的酶蛋白质的组合。

膜输送蛋白质在活体膜上，指介导物质的输送的蛋白质，也被称为转运子(transporter)、载体(carrier)、透过酶(permease)等。有作为细胞膜的重要的作用而使各种离子或营养素等选择性地透过的功能，是司其功能的膜蛋白质。在膜输送蛋白质中也包括介导糖或氨基酸等的有机物质的输送的蛋白质、以及作为离子输送体的离子泵及离子通道。各种糖或氨基酸的输送体(转运子、透过酶)及离子输送体被纯化，它们的基因是公知的。

在本发明中，例如，有类似的功能的蛋白质的基因可为2种以上的转运子基因的组合。作为2种转运子的例，可举出taut和ae1。

有类似的功能的酶蛋白质的代表例是多个代谢酶的组合。例如，有类似的功能的酶蛋白质的基因可为相同途径的2种以上的代谢酶基因。那样的代谢酶可为促进相同途径内的连续的反应的2种以上的酶。例如，相同途径的代谢酶可为催化氨基酸的分解反应的酶。另外，例如，代谢酶可为丙酮酸代谢途径的酶。2种以上的丙酮酸代谢途径的酶的例可为alt1和pc。

或者，有类似的功能的酶蛋白质的例可为多个糖转移酶的组合。

另外，1或2种以上的膜输送蛋白质和2种以上的酶蛋白质的组合的例可为taut及2种代谢酶。

如上所述，在宿主细胞中使apes人为地表达可通过向细胞，人为地导入抑制nfkbia的表达的非编码rna的基因，使该基因表达来实现。2个以上的外来基因的表达也同样地，可通过向细胞人为地导入它们的外来基因，使该基因表达来实现。

向宿主细胞的外来性dna(也可整合到载体)的导入可例如，使用磷酸钙法、deae葡聚糖法、阳离子核糖体dotap(boehringermannheim公司制)的方法、电穿孔法、nucleofection法(amaxa公司)、脂转染等的方法进行。

再者，在本发明中，“导入dna(或者基因)的”细胞，除了被转染外来性dna的细胞之外、也包含由基因活化技术(参照例如，国际公开第wo94/12650号单行本)内源性dna被活化，结果，对应于所述dna的蛋白质的表达或所述dna的转录开始或增加的细胞。

为了向宿主细胞导入同时稳定地表达困难的2个以上的外来蛋白质的基因而使稳定地表达，优选在导入第2外来基因前，向宿主细胞预先导入apes。使用载体时，apes及第2往后的外来基因的导入优选使用多个载体分别导入。

另一方面，1个目的外来基因和apes的导入的顺序无特别限制，可导入apes之后，导入1个目的外来基因，也可导入1个目的外来基因之后，导入apes。另外、也可同时导入apes和1个目的外来基因。使用载体时，apes及1个目的外来基因的导入可由单个载体同时导入，也可使用多个载体分别导入。

【(6)重组蛋白质生产用的细胞株】

在本发明中，通过导入抑制nfkbia的表达的非编码rna(apes)的基因，使该基因表达，重复继代培养，也可得到编码多个蛋白质的外来基因稳定地高表达的，用于重组蛋白质生产的细胞株。

另外，通过向宿主细胞导入apes的基因，可得到倍增时间快，可稳定增殖的，用于重组蛋白质生产的细胞株。那样的细胞，除apes之外，还可为导入别的外来基因而稳定地高表达的细胞。

作为在本发明提供的细胞的例，在后述的实施例中，首先建立向taut高表达的细胞导入apes165(seqidno：2：gtctgtaaaaatctgtttaataaatatacatcttagaagtaccaaaataattaccaacaaaatacaacatatacaacatttacaagaaggcgacacagaccttagttgggggcgacttttaagcacatgccactgaacacctggctcttacatgggaggacacac)的细胞，接下来，通过向所述细胞再导入别的转运子基因，建立协调性地发挥功能的2种转运子一同稳定地高表达的细胞。另外，首先建立向taut高表达的细胞导入apes165的细胞，接下来，通过向所述细胞再导入2种丙酮酸代谢途径的酶的基因，建立促进taut以及丙酮酸代谢途径的连续的反应的2种酶一同稳定地高表达的细胞。这些细胞由于有对于重组蛋白质生产优选的性质，作为用于生产作为药品或抗原有用的希望得到的蛋白质的宿主细胞适宜。通过将这些细胞作为宿主，培养人为地导入希望得到的蛋白质的基因的细胞，使希望得到的蛋白质产生，回收产生的蛋白质，可制造所述希望得到的蛋白质。

【实施例】

以下，由实施例具体说明本发明。再有，这些实施例仅旨在说明本发明，不在于限定本发明的范围。

【实施例1：使表达困难的特定的基因高表达的细胞的建立】

(1)膜蛋白的taut和ae1在细胞表面上通过氯离子的搬入-排出协同发挥功能。至今，为了taut高表达细胞的taut功能增强，重复试使ae1同时高表达的宿主细胞的建立，但在药剂挑选过程中见到悬浮细胞的附着化，未建立共表达的细胞。此时，宿主细胞中的原本的ae1的表达量用qpcr在检测限界以下。

(2)酶的alt1和pc(丙酮酸羧化酶)从丙氨酸生物合成丙酮酸、从丙酮酸生物合成草酰醋酸。至今，为了促进向tca通路连续的代谢途径的反应，要在alt1高表达的宿主细胞使pc高表达，但共表达的细胞未建立。此时，宿主细胞中的原本的alt1的表达量用qpcr在检测限界以下。

然而，在上述2例中，第2基因导入之前预先使apes高表达，则建立高表达含apes的3种以上的基因的细胞。即，在(1)中构建在taut高表达细胞中使apes高表达的taut/apes细胞之后，通过导入ae1，建立高表达taut和ae1的高增殖的taut/apes/ae1细胞。在(2)中，也从(1)的taut/apes高表达细胞构建高表达alt1的taut/apes/alt1细胞之后，通过导入pc，建立高表达alt1和pc的高增殖的taut/apes/alt1/pc细胞。另一方面，从不预先使apes高表达的taut/alt1细胞未建立高表达alt1和pc的taut/alt1/pc细胞。

再有，在本实施例中，作为宿主细胞使用cho细胞dxb-11株。

【实施例1-1：dxb11/taut/apes细胞的建立】

将表达仓鼠taut的质粒phyg-taut通过电穿孔法导入宿主细胞的dxb11，在200μg/ml潮霉素存在下挑选，则建立作为高增殖、并且高表达仓鼠taut(牛磺酸转运子)的细胞的dxb11/taut(dt)(图26)。再者，用电穿孔法导入表达apes的质粒ppur-apes165，在6μg/ml的嘌呤霉素存在下挑选，则建立作为高增殖、并且强制表达apes而nfkbiamrna表达被抑制的细胞的dxb11/taut/apes(dtp)(图26)。在dtp细胞中，由taqman法确认，仓鼠tautmrna高表达、nfkbiamrna表达抑制经重复继代培养也稳定维持(图27)。

【实施例1-2：dxb11/taut/apes/ae1细胞的建立】

在使2种转运子一同稳定高表达的宿主细胞的建立中有伴随困难的情况。例如，未建立在宿主细胞dxb11中使taut和ae1(阴离子交换剂1)一同高表达的稳定株。但是，向图26的作为通过仓鼠taut高表达而强制表达apes而nfkbiamrna表达被抑制的细胞的dxb11/taut/apes(dtp)由电穿孔法导入表达人ae1的质粒pneo-ae1，在200μg/ml的g418存在下挑选，建立作为高增殖、并且将仓鼠taut和人ae1一同高表达的细胞的dxb11/taut/apes/ae1(dtpe)(图28)。

在dtpe细胞中，由taqman法确认仓鼠tautmrna高表达、人ae1mrna高表达、nfkbiamrna表达抑制经重复继代培养也稳定维持(图27、图28)。

另一方面，向apes导入前的dxb11/taut(dt)细胞由电穿孔法导入表达人ae1的质粒ppur-ae1，在6μg/ml的嘌呤霉素存在下挑选，未建立dxb11/taut/ae1(dte)细胞。

如上所述，为了经由taut的cl^-离子的排出、由ae1的cl^-离子的提取，使协调发挥功能的2种转运子一同高表达，认为由apes高表达的nfkbiamrna的表达抑制是必要的。

【实施例1-3：dxb11/taut/apes/alt1/pc细胞的建立】

在使2种酶一同稳定地高表达的宿主细胞的建立中也有伴随困难的情况。例如，未建立使alt1(丙氨酸转移酶)和pc(丙酮酸羧化酶)一同高表达的稳定株。但是，向图26的dxb11/taut/apes(dtp)由电穿孔法导入表达人alt1的质粒pneo-alt1，在200μg/ml的g418存在下挑选，则建立作为高增殖、并且高表达人alt1的细胞的dxb11/taut/apes/alt1(dtpl)，再者，向dtpl细胞由电穿孔法导入表达人pc的质粒pzeo-pc，在200μg/ml的zeocin存在下挑选，建立了作为高增殖、并且高表达人pc的细胞的dxb11/taut/apes/alt1/pc(dtplc)(图29)。

在dtplc细胞中，由taqman法确认仓鼠tautmrna高表达，人alt1mrna高表达、nfkbia表达抑制、人pcmrna高表达经重复继代培养也稳定维持(图27、图29)。

另一方面，向apes导入前的dxb11/taut(dt)细胞由电穿孔法导入表达人alt1的质粒ppur-alt1，在6μg/ml的嘌呤霉素存在下挑选，建立了作为高增殖、并且高表达人alt1的细胞的dxb11/taut/alt1(dtl)，再者，向dtl细胞由电穿孔法导入表达人pc的质粒pneo-pc，在200μg/ml的g418存在下挑选，则未建立dxb11/taut/alt1/pc(dtlc)(图30)。

如上所述，为了使作为促进丙酮酸代谢途径的连续反应的酶的alt1和pc一同高表达，由apes高表达的nfkbiamrna的表达抑制被认为是必要的。

【实施例2：倍增时间快，稳定增殖的细胞的建立方法】

【实施例2-1：倍增时间(概算值)的算出】

倍增时间(概算值)由125-mlerlenmeyerflask的摇床培养后，由rochecedex细胞计数器及分析仪系统(innovatisag，bielefeld，germany)测定活细胞数、算出。从活力维持在90％以上的状态的每种细胞开始继代培养，通过从初始细胞密度2×10⁵个细胞/ml的3天培养、或者从初始细胞密度1×10⁵个细胞/ml的4天培养等，不至过增殖地重复进行培养，将活力维持在90％以上而算出继代间的倍增时间。在使基因强制表达的经修饰的细胞的继代培养基中含各种基因导入中使用的潮霉素等的药剂，药剂以外使用与dxb11(dhfr-)相同培养基。

由基因导入的修饰前的dxb11(dhfr-)的倍增时间(概算值)用在不含药剂的培养基中的继代培养(从活力是99.5％的细胞进行7次继代培养(进行4次3天培养、进行3次4天培养))算出时是27.5±1.7小时(图31)。

【实施例2-2：各种基因强制表达宿主的建立和倍增时间】

如图32所示，由各种基因的强制表达建立经修饰的宿主。首先向dxb11(dhfr-)由电穿孔法导入taut(牛磺酸转运子)的表达质粒(phyg-taut)、约2～3周后，挑选2种在200μg/ml潮霉素存在下增殖良好的细胞。再者，通过使用affymetrix公司的寡核苷酸阵列(affymetrixmouse430_2)的genechip实验比较继代培养时的表达基因的表征，将tautmrna高表达，且其他表达表征与dxb11(dhfr-)类似的挑选株作为dt宿主。建立的dt宿主的倍增时间(概算值)在含药剂(潮霉素)的培养基的继代培养(从活力是90.0％以上的细胞进行11次继代培养(进行4次3天培养、进行7次4天培养))中算出时，是26.1±2.7小时，倍增时间对于dxb11(dhfr-)大致同等(图31)。

接下来，为了再修饰dt宿主，使在产生抗体的细胞中表达异常亢进的apes的一部分序列apes165(特愿2011-082002)强制表达。向dt宿主由电穿孔法导入ppur-apes165、约2-3周后，挑选9株在6μg/ml嘌呤霉素存在下增殖良好的细胞，见到与apes表达量和细胞增殖相关(r2＝0.701)(图20)。

将taut和apes一同高表达，倍增时间最快20.8小时的细胞株作为dtp宿主，dtp宿主获得至今没有的表征。例如，电穿孔法导入无法建立与taut一同强制表达的宿主细胞的ae1(阴离子交换剂1)的表达质粒(pneo-ae1)、约2～3周后，挑选在200μg/mlg418存在下增殖良好的细胞，则构建taut和ae1一同高表达的细胞。将ae1表达量最高的细胞作为dtpe宿主，则重复长期间培养也稳定，倍增时间相比dtp宿主更快(图33、57继代、19.9±4.3小时)。

作为以下的例，由电穿孔法导入建立与taut一同强制表达的宿主细胞的alt1(丙氨酸氨基转移酶1)的表达质粒(pneo-alt1)、约2～3周后，挑选在200μg/mlg418存在下增殖良好的细胞，构建taut与ae1一同高表达的细胞。由于在alt1表达量和细胞增殖中见到相关，将alt1表达量最高的细胞作为dtpl宿主，则这也经重复长期间培养而稳定，倍增时间相比dtp宿主更快(图33、57继代、19.8±4.3小时)。由于可建立alt1不依赖于apes的强制表达而与taut一同强制表达的宿主细胞，将alt1的表达质粒(ppur-alt1)用电穿孔法导入dt宿主、约2～3周后，挑选在6μg/ml嘌呤霉素存在下增殖良好的细胞，将alt1表达量最高的细胞作为dtl宿主，则经重复长期间培养也稳定，但在与dtpl宿主的比较中在增殖中见到偏差，倍增时间相比dtpl宿主更慢(图33、57继代、21.9±7.3小时)。

以上的结果示，(1)可构建通过使apes强制表达而倍增时间快的宿主细胞，(2)apes强表达宿主通过再导入新的基因，可构建倍增时间更快的细胞。具有这样的功能的核酸序列尚不知。

【参考例】

本发明人以前以有高的重组抗体产生能力的培养细胞株(cho细胞株)作为材料，对于在所述细胞株中表达显著的基因进行了探讨，鉴定一个mrna型非编码rna。此转录产物与nfkbia的mrna的非翻译区域的互补链相当。再者发现，通过在重组培养细胞中表达由此转录产物中的一部分的序列组成的核酸分子，使所述培养细胞的抗体产生能力显著地升高。另外，本发明人发现，在所述非编码rna的表达上调的抗体高产生细胞中nfkbia的表达被抑制，有高的抗体产生能力的培养细胞在细胞内抑制nfkbia的表达，通过使控制培养细胞内的nfkbia的表达的转录产物高表达，抗体的生产量增加。

由以下的参考例说明这些事项。

【参考例1：各种基因导入cho细胞的genechip解析实验】

genechip实验使用affymetrix公司的寡核苷酸阵列(affymetrixmouse430_2)，根据通常的顺序实施。但是，仓鼠阵列未商品化，从而使用小鼠基因组4302.0阵列。由杂交条件的优化，在测试3阵列上的小鼠基因16种探针中，用8种探针得到presentcall，与小鼠的碱基序列相同性是约90％以上时，仓鼠转录产物的表达定量变得可能。

从使各种基因强表达的细胞制备高纯度总rna之后，使用总rna和含t7启动子序列的寡dt引物(t7-(t)24)合成cdna。接下来，由使用bio-11ctp，bio-16utp和megascriptt7试剂盒(ambion)的转录反应，从cdna合成生物素标记crna。将crna柱纯化后，将在电泳上确认与18s～28srrna相当的分子量的高品质crna片段化，成为具有均一的尺寸的genechip样品。至使用的genechip样品加杂交样品溶液而于-80℃冷冻保存。样品溶液在使用前热处理、离心、应用于小鼠基因组4302.0阵列，使阵列旋转着在45℃的杂交专用烘箱中温育16小时。回收样品、重复洗阵列，用链霉亲和素r-藻红蛋白染色后扫描。

比较阵列上的转录物(约45,000)的genechip信号值，在1l罐流加培养第10天产生900mg/l以上的mab1(抗il-6r抗体；托珠单抗、商品名actemra)的mab1(抗il-6r抗体)强表达taut强表达csad强表达dg44细胞的继代培养细胞中，作为表达强度高并且表达上调显著的转录产物，鉴定小鼠基因组上的mrna型非编码rnaug_gene＝ai462015(affymetrixmouse430_2，1420088_at)(图1：ai462015转录产物的序列)。

ai462015是437碱基的mrna型非编码rna，但其序列存在于小鼠基因组12的nfkbiamrna3’侧的非翻译区域近傍(56590831-56590397)的互补链上。考虑ai462015转录产物直接作用于nfkbiamrna的非翻译区域而抑制翻译的可能性、或者437碱基的一部分的序列作为低分子rna发挥功能而分解nfkbiamrna的可能性。

例如，含ai462015序列中的5’侧第40a～第91a的52碱基的序列(aagtaccaaaataattaccaacaaaatacaacatatacaacatttacaagaa：seqidno：7)与大鼠nfkbiamrna3‘侧的非翻译区域(1478-1529，geneid：25493nfkbia)的互补链除一个碱基(ai462015中的5’侧第61a)外一致，还有含ai462015的第40a～第63a的24碱基的序列(aagtaccaaaataattaccaacaa：seqidno：9)也是人nfkbiamrna3‘侧的非翻译区域的一部分序列(ttgttggtaattattttggtactt，1490-1513：seqidno：24)的互补链，所以预测将作为52碱基的一部分的19-25碱基作为microrna，或者一部分序列作为反义rna而作用于cho细胞的nfkbiamrna的可能性。

再者，由其后的genebank的信息更新得知，作为ai462015的转录产物的437碱基与小鼠nfkbia基因的3’侧非翻译区域(513碱基)的互补链相当(图23)。如图24所示，在cho-k1细胞的基因组序列上存在ai462015的相同序列(seqidno：25：ai462015；seqidno：26-27：cho-k1基因组)、再者，在抗体高产生的cho细胞中见到nfkbia的表达抑制(参考例4)，从而认为在cho细胞中ai462015的相同序列高表达而发挥功能。

例如，含ai462015序列中的5’侧第7t～第91a的85碱基的序列(图23和24的加下划线部、seqidno：29)(tgtaaaaatctgtttaataaatatacatcttagaagtaccaaaataattaccaacaaaatacaacatatacaacatttacaagaa)与大鼠nfkbiamrna3‘侧的非翻译区域(1478-1562，geneid：25493nfkbia、seqidno：31)的互补链除一碱基(ai462015中的5’侧第70a)外一致(匹配＝84/85、图25b)、同样地，在人(匹配＝75/85、图25a、seqidno：30)、黑猩猩(匹配＝75/85、图25c、seqidno：32)、恒河猴(匹配＝74/85、图25d、seqidno：33)、牛(匹配＝76/85、图25e、seqidno：34)中也确认相同性。从而认为，作为此85碱基(保守序列7-91)的一部分的19-25碱基作为microrna，或者一部分序列作为反义rna跨种作用于动物细胞、或者哺乳动物细胞。从而预测，也作用于如动物培养细胞、优选为cho细胞一样的哺乳动物细胞的nfkbiamrna。

【参考例2：在抗体高产生细胞中表达上调的转录产物的鉴定】

在参考例1中，在mab1(抗il-6r抗体；托珠单抗、商品名actemra)高产生dg44细胞中转录产物ai462015的表达量上调(图2)、但在不同的宿主细胞(cho-dxb11s)中使不同的抗体(mab2：抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体；gc33(参照wo2006/006693))高产生时也同样地见到ai462015转录产物的表达上调(图3)。

如图2所示，在cho-dg44细胞中使牛磺酸转运子(taut)基因强表达时，使半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)基因强表达时(数据未显示)、使taut和csad一同强表达时，转录产物ai462015的表达量均是同程度，但在使taut和csad一同强表达的细胞中再使mab1(抗il-6受体抗体)强表达时，见到ai462015的异常上调(宿主细胞的7倍)，示表达量也异常高的genechip信号值(10,000以上)。对照的gapdh表达强度在细胞间同水平，所以转录产物ai462015的表达上调是mab1抗体高产生细胞特异性的。与图3同样，在cho-dxb11s细胞中使mab2(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体)基因强表达时，ai462015序列的表达上调(taut，csad，ae1强表达细胞的平均值的13倍)是mab2抗体高产生细胞特异性的。

以上的结果示，在摇床继代培养第3天稳定增殖的抗体高产生细胞异常高表达ai462015序列。

另外，在1l罐培养第3天的生产培养条件下也见到ai462015序列的异常的表达上调。如图4所示，在1l罐流加培养的第10天产生约1200-1400mg/l的mab1(抗il-6r抗体)的2种抗体高产生细胞示5,000以上的高的gernechip信号值。从培养条件的差异，在1l罐流加培养第3天的信号值是摇床培养的50％左右，但在培养后期第13天ai462015序列的表达强度上调至与摇床继代培养同程度，示异常高的信号值(图5)。另一方面，抗体产生量低的mab1强表达dxb11s细胞(在水解物未添加的摇床培养第7天是300mg/l以下，在水解物添加是也是500mg/l以下)，在添加贡献于高产生化的水解物(hy-fish、procinelysate)的条件下，也见不到1l罐培养第3天的ai462015序列的表达上调(图6)。

基于在图2示高的信号值的mab1强表达taut强表达csad强表达dg44细胞的抗体产生量高(在水解物未添加的摇床培养第7天是640mg/l)、在图3示高的信号值的mab2强表达dxb11s细胞的抗体产生量高(在水解物未添加的摇床培养第7天是640mg/l)、图6中即使加贡献于抗体高产生化的水解物的时信号值也不上调的实验结果，认为“ai462015序列的表达量高的细胞的抗体产生潜力高”。

【参考例3：由apes强表达的产生抗体的细胞的高产生化例】

由于示ai462015序列表达量的高度与抗体产生潜力的高度相关，在图6向抗体产生潜力低的mab1强表达dxb11s细胞导入表达ai462015序列的一部分的质粒而使强表达，比较抗体产生潜力。

将小鼠基因组来源的转录产物ai462015(图1、437碱基)序列的一部分(含affymetrixgenechip的ai462015探针序列)5’侧第4g～3’末端的至t命名为apes434、将5’侧第4g～第168至c命名为apes165，制成2种表达单位(apes是抗体产生增强序列的简称)。通过合成加kozak序列的表达单位，构建在cmv启动子下高表达的phyg-apes434(图7)、phyg-apes165(图8)、phyg-无(图9)。

由amaxa公司(现、lonza公司)基因导入系统nucleofector，向图6的抗体低产生株的mab1强表达dxb11s细胞导入表达质粒，挑选在96孔板上在含潮霉素(200μg/ml)的选择培养基存在下高增殖的全细胞株，24孔板扩大后，比较抗体产生量。挑选的株数各自是phyg-apes434(n＝38)，phyg-apes165(n＝60)、phyg-无(n＝11)，它们的株数期待由apes强表达质粒导入的阳性效果。在含1ml继代培养基的24孔板的静置培养由于在培养第13天见不到细胞增殖，测定抗体产生量及细胞数。抗体产生量的平均值是phyg-apes434(44.3mg/l)、phyg-apes165(41.2mg/l)、phyg-无(21.9mg/l)、细胞数(平均值)是phyg-apes434(9.27×10⁵个细胞/ml)、phyg-apes165(11.39×10⁵个细胞/ml)、phyg-无(7.76×10⁵个细胞/ml)，phyg-apes434、phyg-apes165导入细胞均相对于对照的phyg-无统计学显著(t检验p＜0.001，图10)。

以上的结果示，使含ai462015转录产物的5’侧165bp的核酸序列(例如作为seqidno：2的dna的转录产物的apes165、或者作为seqidno：3的dna的转录产物的apes434)强表达，则细胞的抗体产生潜力升高。

【参考例4：抗体高产生cho细胞中的nfkbia的表达抑制】

如参考例1所述，ai462015序列存在于小鼠基因组12的nfkbia基因的3’侧的非翻译区域近傍(3’侧78bp)的互补链上，ai462015序列中含的22个碱基(aagtaccaaaataattaccaac：seqidno：10)是与人nfkbia基因的3’侧非翻译区域(1492-1513)的互补链相同序列，还跨大鼠、恒河猴、狗、马等种保守，从而作为microrna进行rna干涉而有分解nfkbiamrna的可能性，或者可定量相当于ai462015表达的affymetrix公司的寡核苷酸阵列(affymetrixmouse430_2)上的特异性探针序列区域(catatacaacatttacaagaaggcgacacagaccttagttgg：seqidno：16)42bp的前半部分的从5’侧第71c的21个碱基(catatacaacatttacaagaa：seqidno：15)是大鼠nfkbiamrna的1478～1498碱基目的互补序列，从而认为通过ai462015序列来源的核酸分子对nfkbiamrna进行rna干涉来抑制表达维持抗体高产生cho细胞的稳态的可能性(敲除小鼠的致死率是出生后)。(注释：之后确证，ai462015的转录产物与小鼠nfkbia基因的3’侧513碱基的非翻译区域的互补链相当。参照参考例8。另外，用小鼠genechip定量的ai462015的第71～第112序列(seqidno：16)作为在cho细胞的转录产物被确认。)

从而，定量在抗体产生潜力高的ai462015高表达细胞的nfkbiamrna表达量，确认其表达被抑制。

由于未知cho细胞的nfkbiamrna序列，从小鼠和大鼠的氨基酸编码区域(一同942碱基：314氨基酸)保守的序列设计探针(5’acttggtgactttgggtgct、5’gcctccaaacacacagtcat)(seqidno：17、18)而得到325bp的pcr产物。pcr克隆的325bp从其序列相同性认为是cho细胞来源nfkbiamrna的一部分序列(图11)。

在小鼠基因组4302.0阵列(参考例1)中，由于其探针序列与cho细胞的种特异性序列相当，或无法定量nfkbiamrna表达，但比较325bppcr产物量，则相对于不产生抗体的基因强表达细胞(泳道1，2)，在ai462015序列的表达上调的抗体高产生细胞(泳道3，4)中nfkbiamrna表达被抑制。再者，设计可定量325bp的一部分的序列的taqman探针组(图12)，用rt-pcr法定量，则在抗体高产生细胞中，nfkbiamrna表达被抑制至不产生抗体的细胞的50％(图13)。

从以上考虑，在抗体高产生细胞中，nfkbiamrna的表达被抑制，结果，抗体产生潜力升高。实际上、在我们用于抗体基因表达的表达质粒的启动子/增强子区域中存在多个以上的nfkb结合部位(图14：小鼠mcmvie2启动子上的nfkb结合部位)、它们的增强子区域由于是对于抗体基因的高表达必须的区域，所以认为由nfkbia表达抑制而活化的nfkb迁移到核内，启动子活性增强是抗体高产生的一个原因。

【参考例5：在抗体高产生cho细胞中亢进的microrna的解析】

为了解析microrna，如图15所示使用mir-x^tmmirna第一链合成试剂盒(clontech)，继代培养中的mab1(抗il-6r抗体)高产生dxb11s细胞和mab1(抗il-6r抗体)高产生taut强表达dxb11s细胞、再在从抗体基因导入前的dxb11s宿主细胞制备的小rna的3’侧附加多聚(a)标签之后，引发在3’侧具有寡dt、在5’侧具有pcr引物序列(mrq3’引物)的适配体而合成第一链cdna。将得到的cdna作为模板，使用mrq3’引物和预计的apes序列来源的microrna-特异性引物(apes40-615’引物或者apes71-915’引物)、再者阳性对照的u6snrna5’引物进行qpcr反应(95℃5sec，60℃20sec，30个循环)。pcr反应液在纯化后，在3％琼脂糖凝胶中电泳。如图16所示，通过由apes40-615’引物和u6snrna5’引物的pcr反应见到目的尺寸的条带。如泳道1、2、3所示，apes40-61(aagtaccaaaataattaccaac：seqidno：10)22碱基在mab1(抗il-6r抗体)高产生细胞中高表达。阳性对照的u6snrna(泳道4)的表达量在任何的细胞中均是同水平，另外无法确认apes71-91(catatacaacatttacaagaa：seqidno：15)的存在(数据未显示)、从而认为跨种序列保守的apes40-61(22碱基)作为microrna贡献于抗体高产生化。

【参考例6：由apes强表达的抗体产生用宿主细胞的高增殖化例】

从抗体产生用宿主细胞dxb11/taut，在1l罐流加培养第14天得到产生3.9g/l的mab1(抗il-6r抗体)的抗体高产生细胞(dxb11/taut/mab1)，由taut的生存率维持能力在培养第31天产生8.1g/l，但考虑实际生产，要在培养第14天成为高产生，有使细胞最高到达密度(4.1×10e6个细胞/ml)增加的必要。只要由apes强表达的nfkbiamrna的表达抑制(参考例4)促进nfkb的活化，由于增殖关联基因的表达亢进，细胞最高到达密度有升高的可能性。将与apes同样地贡献于抗体高产生化的alt1的共表达用质粒各自(ppur-apes165，pphr-alt1，图17)向上述抗体高产生细胞dxb11/taut/mab1(亲本株)导入而挑选高增殖的最佳的各3株，进行摇床流加培养，则示apes165强表达细胞的细胞最高到达密度的平均值是(11.5±1.7)×10e6个细胞/ml，得到以alt1强表达细胞的(8.9±1.8)×10e6个细胞/ml以上高增殖的细胞。再摇床流加培养第14天的抗体产生量的平均值是，apes强表达细胞：4.4±0.6g/l，alt1强表达细胞：4.0±0.6g/l，升高到导入前的dxb11/taut/mab1细胞：3.4g/l以上，apes强表达效果独立于taut强表达效果而正地发挥作用(图18)。由apes强表达的正的效果在il-jar流加培养中显著，比较各自在摇床流加培养的高增殖细胞，则强表达apes的株最高增殖，在培养第12天是5.3g/l，相对于亲本株的3.2g/l，强表达alt1的株4.4g/l示以短期间培养而高产生的长处(图19)。基于以上的结果，将抗体产生用宿主细胞dxb11/taut修饰为更高增殖的宿主细胞，制成apes165强表达宿主dxb11/taut/apes。向dxb11/taut宿主将ppur-apes165用电穿孔法基因导入，药剂挑选后，对于生存率、增殖均良好的宿主候选的9株，定量继代培养时的apessnrna(小非编码rna)表达量。apes表达量高的dxb11/taut/apes宿主候选株培养时的活细胞密度高，示相关(r²＝0.70)(图20)。

【参考例7：由apes强表达的抗体产生细胞的高产生化例2】

与参考例3同样地，向mab1强表达dxb11s细胞导入表达ai462015转录产物的5’侧的部分序列的质粒，比较抗体产生潜力。

除了apes4-168(apes165)之外，再制成由其一部分序列组成的apes4-68(seqidno：5)及apes69-133(seqidno：6)的表达单位，探讨细胞的抗体产生潜力。相对于空载体强表达(空)，apes4-68是以p＜0.05，apes69-133是以p＜0.01的显著差异成抗体高产生(t检验p＜0.001、图21)。

在参考例3及本参考例中鉴定的，有apes活性的部分序列各自与小鼠ai462015转录产物的何区域相当示于图22。示apes活性的部分序列含23碱基以上的nfkbia互补序列。

本发明可应用于所有的抗体等的重组多肽产生细胞。

将本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请作为直接参考并入本说明书中。