一种类变形被孢霉的菌种培养基及其培养方法与流程

[0001]
本发明涉及微生物技术领域，具体为一种类变形被孢霉的菌种培养基及其培养方法。


背景技术：

[0002]
本发明涉及到的菌种是一种从野生冬虫夏草中分离的菌种，其与冬虫夏草的有效成分类似，并且具有培养快，操作便捷的特点，可以成为冬虫夏草菌丝体的替代品。本发明的方法可生产大量发酵产物，它具有多种生理活性物质，其生产周期较使用昆虫作宿主的其他方法短得多。按照发酵规模大小，在约15天内，用本发明的方法可重复性地生产高产量优质的菌丝体发酵产物。例如，用本发明的方法已得到含腺苷，鸟苷及甘露醇，花生四稀酸较高的产品。现阶段，野生冬虫夏草生长条件十分苛刻和人类盲目的毁灭性采挖，导致野生资源濒临灭绝。同时其生长周期长，采摘困难。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于提供一种类变形被孢霉的菌种培养基及其培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0004]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种类变形被孢霉的菌种培养基，培养基包括碳源、氮源、盐类和凝固剂，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，所述氮源包括酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白，所述盐类采用柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁，所述凝固剂采用琼脂，其中本发明中添加柠檬酸钠能显著提高类变形被孢霉的发酵情况，同时提高发酵菌丝的腺苷含量。
[0005]
优选的，所述葡萄糖、蔗糖、麦芽糖占培养基的质量百分比分别为1％-3％、1％-2％和1％-3％。
[0006]
优选的，所述酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白和琼脂占培养基的质量百分比分比为1％-2％、1％-2％、0.3％-1％、0.8％-1.2％。
[0007]
优选的，所述柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁占培养基的质量百分比分比为0.1％-0.3％、0.2％～0.5％、0.1～0.3％。
[0008]
优选的，所述培养基的形态为液态或者固态。
[0009]
优选的，所述培养基的酸碱度为5.0-6.5。
[0010]
一种类变形被孢霉的菌种培养方法，采用上述所述的培养基进行培养，其特征在于包括如下步骤：
[0011]
s1,对菌种进行分离；
[0012]
s2,制备培养基；
[0013]
s3,将步骤s1中分离的菌种接于发酵培养基表面，在20～30℃温度下，在有氧的环境下静置培养14天，即可得发酵菌丝体。
[0014]
优选的，所述步骤s1中菌种的分离方法为将天然新鲜的冬虫夏草用纯净水洗净，
无菌环境下无菌水冲洗，75％乙醇消毒，再用无菌水多次冲洗，用无菌纸吸去表面水分，切去外皮，避开肠道，切取白净组织为薄片，将其接种于常见的分离培养基上在5～15℃温度下，静置置培养10天，白色菌丝即从培养基表面长出，将白色菌丝进一步分离纯化，可得到类变形被孢霉。
[0015]
优选的，所述步骤s2中培养基的制备方法为将碳源、氮源和盐类按照质量配比称取，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。
[0016]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0017]
本发明，涉及到的菌种是一种从野生冬虫夏草中分离的菌种，其与冬虫夏草的有效成分类似，并且具有培养快，操作便捷的特点，可以成为冬虫夏草菌丝体的替代品。本发明的方法可生产大量发酵产物，它具有多种生理活性物质，其生产周期较使用昆虫作宿主的其他方法短得多。按照发酵规模大小，在约15天内，用本发明的方法可重复性地生产高产量优质的菌丝体发酵产物。
附图说明
[0018]
图1是野生虫草与类变形被孢霉成分比较图。
具体实施方式
[0019]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0020]
实施例1
[0021]
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种类变形被孢霉的菌种培养基，培养基包括碳源、氮源、盐类和凝固剂，碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，氮源包括酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白，盐类采用柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁，凝固剂采用琼脂，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖占培养基的质量百分比均为1％，酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白和琼脂占培养基的质量百分比分比为1％、1％、0.3％、0.8％，柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁占培养基的质量百分比分比为0.1％、0.2％、0.1％，其余成分为水，培养基的形态为液态或者固态，培养基的酸碱度为5.0-6.5。
[0022]
一种类变形被孢霉的菌种培养方法，采用上述的培养基进行培养，其特征在于包括如下步骤：
[0023]
s1,对菌种进行分离；
[0024]
s2,制备培养基；
[0025]
s3,将步骤s1中分离的菌种接于发酵培养基表面，在20～30℃温度下，在有氧的环境下静置培养14天，即可得发酵菌丝体。
[0026]
具体的，步骤s1中菌种的分离方法为将天然新鲜的冬虫夏草用纯净水洗净，无菌环境下无菌水冲洗，75％乙醇消毒，再用无菌水多次冲洗，用无菌纸吸去表面水分，切去外皮，避开肠道，切取白净组织为薄片，将其接种于常见的分离培养基上在5～15℃温度下，静置培养10天，白色菌丝即从培养基表面长出，将白色菌丝进一步分离纯化，可得到类变形被
孢霉。
[0027]
具体的，步骤s2中培养基的制备方法为将碳源、氮源和盐类按照质量配比称取，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。
[0028]
实施例2
[0029]
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种类变形被孢霉的菌种培养基，培养基包括碳源、氮源、盐类和凝固剂，碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，氮源包括酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白，盐类采用柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁，凝固剂采用琼脂，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖占培养基的质量百分比分别为2％、1.5％和2％，酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白和琼脂占培养基的质量百分比分比为1.5％、1.5％、0.6％、1％，柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁占培养基的质量百分比为0.2％、0.35％、0.2％，其余成分为水，培养基的形态为液态或者固态，培养基的酸碱度为5.0-6.5。
[0030]
一种类变形被孢霉的菌种培养方法，采用上述的培养基进行培养，其特征在于包括如下步骤：
[0031]
s1,对菌种进行分离；
[0032]
s2,制备培养基；
[0033]
s3,将步骤s1中分离的菌种接于发酵培养基表面，在20～30℃温度下，在有氧的环境下静置培养14天，即可得发酵菌丝体。
[0034]
具体的，步骤s1中菌种的分离方法为将天然新鲜的冬虫夏草用纯净水洗净，无菌环境下无菌水冲洗，75％乙醇消毒，再用无菌水多次冲洗，用无菌纸吸去表面水分，切去外皮，避开肠道，切取白净组织为薄片，将其接种于常见的分离培养基上在5～15℃温度下，静置培养10天，白色菌丝即从培养基表面长出，将白色菌丝进一步分离纯化，可得到类变形被孢霉。
[0035]
具体的，步骤s2中培养基的制备方法为将碳源、氮源和盐类按照质量配比称取，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。
[0036]
实施例3
[0037]
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种类变形被孢霉的菌种培养基，培养基包括碳源、氮源、盐类和凝固剂，碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，氮源包括酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白，盐类采用柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁，凝固剂采用琼脂，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖占培养基的质量百分比分别为3％、2％和3％，酵母浸出粉、蛋白胨、水解蚕蛹蛋白和琼脂占培养基的质量百分比分比为2％、2％、1％、1.2％，其余成分为水，柠檬酸钠、磷酸二氢钾和硫酸镁占培养基的质量百分比为0.3％、0.5％、0.3％，培养基的形态为液态或者固态，培养基的酸碱度为5.0-6.5。
[0038]
一种类变形被孢霉的菌种培养方法，采用上述的培养基进行培养，其特征在于包括如下步骤：
[0039]
s1,对菌种进行分离；
[0040]
s2,制备培养基；
[0041]
s3,将步骤s1中分离的菌种接于发酵培养基表面，在20～30℃温度下，在有氧的环境下静置培养14天，即可得发酵菌丝体。
[0042]
具体的，步骤s1中菌种的分离方法为将天然新鲜的冬虫夏草用纯净水洗净，无菌
环境下无菌水冲洗，75％乙醇消毒，再用无菌水多次冲洗，用无菌纸吸去表面水分，切去外皮，避开肠道，切取白净组织为薄片，将其接种于常见的分离培养基上在5～15℃温度下，静置培养10天，白色菌丝即从培养基表面长出，将白色菌丝进一步分离纯化，可得到类变形被孢霉。
[0043]
具体的，步骤s2中培养基的制备方法为将碳源、氮源和盐类按照质量配比称取，放入容器，加热，溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。
[0044]
对比例1
[0045]
将天然新鲜的冬虫夏草用纯净水洗净，无菌环境下无菌水冲洗，75％乙醇消毒，再用无菌水多次冲洗，用无菌纸吸去表面水分，切去外皮，避开肠道，切取白净组织为薄片，接于分离培养基表面，在5～15℃温度下，静置培养10天，白色菌丝即从培养基表面长出，将白色菌丝进一步分离纯化，可得到类变形被孢霉。
[0046]
对比例2
[0047]
本发明提供一种技术方案：一种类变形被孢霉的菌丝体发酵方法。
[0048]
步骤一，配置发酵液体培养基，葡萄糖20g/l，蔗糖10g/l，麦芽糖20g/l，酵母浸出粉10g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾3g/l，水解蚕蛹蛋白5g/l，硫酸镁1.5g/l；放入容器，加热，用1l纯水溶解，混合均匀后按常规灭菌方法灭菌即可。
[0049]
步骤二,将对比例1中分离的类变形被孢霉接种于步骤一的液体培养基，培养温度为25℃，有氧的环境下，静置发酵14天，得到发酵菌丝。
[0050]
对比例3
[0051]
本发明提供一种技术方案：一种类变形被孢霉的菌丝体发酵方法。与实对比例2的不同之处在于在步骤一中加入柠檬酸钠1g/l。
[0052]
天然冬虫夏草菌丝作为对照组，按照以下方法检测本发明对比例2的制备得到的类变形被孢霉菌丝体腺苷含量对比采用液相色谱测定，色谱条件为选用shim-packgistc18色谱柱(5um,4.6x250mm)；以磷酸盐缓冲液(ph6.5)一甲醇(85：15)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长260nm，进样量5ul；柱温25℃
[0053]
分别取样0.5g野生冬虫夏草，对比例2，对比例3的样品，置于具塞的锥形瓶中，向锥形瓶中加入体积分数为90％的甲醇10ml，将锥形瓶瓶塞塞紧，随后摇匀，称定重量，加热回流30min后冷却，再次称定重量，然后用体积分数为90％的甲醇补足损失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液为供试品溶液，取供试品溶液，按照上述色谱条件测试样品中腺苷的含量(μg/g)。
[0054]
对比野生冬虫夏草中腺苷的含量。类变形被孢霉菌丝体中的腺苷含量大大增强。加入柠檬酸钠的培养基产出菌丝体腺苷含量较于普通培养基也有很大的提高。
[0055]
样品名天然野生虫草对比例2对比例3腺苷含量mg/g0.3882.94.4
[0056]
比较对比例2和对比例3的生物转换率
[0057]
比较对比例2和对比例3同时培养14天，称量干重，计算其生物转化率得出加入柠檬酸钠的培养基产出菌丝体生物转化率更高。
[0058] 对比例2对比例33生物转化率32％45.23％
[0059]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。