一种水稻粒型相关基因GLW2的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及水稻育种领域，具体涉及一种水稻粒型相关基因glw2的snp(单核苷酸多态性)分子标记及其应用。
背景技术：
：水稻是我国重要的粮食作物，其产量高低涉及粮食安全。近年来，随着全球人口的激增,耕地面积的逐年减少，土地流转与非粮化趋势加剧，粮食短缺仍旧是困扰许多国家的重大问题。因此，开展水稻遗传育种研究一直成为国家的重中之重，保持粮食的稳产及高产成为农作物品种选育的首要目标并亟需解决。水稻产量构成要素主要包含有效穗数、穗粒数、粒重、结实率等，其中粒重主要是受粒型和灌浆影响。水稻的产量性状是由多基因决定的复杂性状，主要受单株有效穗数、每穗有效粒数和千粒重3个因素共同调控，千粒重遗传力最高，主要由灌浆程度和粒型控制，粒型性状又由粒长、粒宽和粒厚共同构成，通过分子标记对水稻粒型相关基因进行选择可以在水稻苗期即对粒重进行选择，可以大大提高育种效率。技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种水稻粒型相关基因glw2的snp分子标记。本发明还提出用于检测上述snp分子标记k_020501的引物组。本发明还提出上述snp分子标记的检测方法。本发明还提出上述snp分子标记的应用。根据本发明的第一方面实施方式的snp分子标记，所述snp分子标记为k_020501，其中k_020501的多态性为g或t。根据本发明的一些实施方式，所述snp分子标记k_020501的多态性位点位于chr2.28865722(msu7.0position)。根据本发明第二方面实施方式的用于检测上述snp分子标记k_020501的引物组，所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，特异性引物序列包括primerseqallelex和primerseqalleley，所述primerseqallelex的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述primerseqalleley的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述通用引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。根据本发明的一些实施方式，优选地，所述primerseqallelex的5’端连接fam或hex荧光序列，primerseqalleley的5’端分别连接fam和hex荧光序列。根据本发明的一些实施方式，所述引物组在水稻育种中的应用。根据本发明的第三方面实施方式的上述snp分子标记的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：s1、从水稻叶片中提取基因组dna；s2、以步骤s1中提取的基因组dna为模板，利用snp分子标记k_020501的引物，对k_020501分子标记进行检测；s3、若k_020501的snp位点碱基为g，判定测试的水稻样品含有纯合的glw2基因；若检测位点碱基为t，判定测试的水稻样品含有纯合的glw2基因；若检测位点同时检测到g、t，判断待测水稻含有杂合的glw2基因。根据本发明的一些实施方式，优选地，步骤s1中，水稻叶片中提取基因组dna采用简化ctab法(十六烷基三甲基溴化铵法)。根据本发明的一些实施方式，优选地，步骤s2中，用kasp(竞争性等位基因特异性pcr)技术对snp位点进行检测。根据本发明的第四方面实施方式的上述snp分子标记的应用，所述应用为snp分子标记在水稻育种中的应用。根据本发明的一些实施方式，所述应用为利用k_020501分子标记进行检测，选择携带glw2基因的水稻品系进行后续育种。根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测glw2基因snp分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如seqidno.1-3所示的引物。根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒用于水稻育种。根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括核苷酸序列如seqidno.1-3所示的引物。根据本发明实施方式的水稻粒型相关基因glw2的snp分子标记，至少具有如下有益效果：通过对本发明的水稻粒型相关基因glw2进行snp分子标记，应用kasp技术反应对水稻材料进行glw2基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻粒型相关基因glw2。本发明利用kasp技术对所开发的snp标记进行基因分型，kasp技术流程中dna抽提、pcr体系构建和荧光信号检测等基本自动化，可实现96，384，1536孔板高通量检测，适用于大规模、高通量的glw2基因鉴定和筛选。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少pcr产物气溶胶的污染以及eb等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择和背景选择，提高背景回复率，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于glw2基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明图1为本发明实施例的分子标记开发流程图；图2为本发明实施例的分子标记k_020501的分型图。具体实施方式为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。本发明实施例为：一种水稻粒型相关基因glw2的snp分子标记及其应用，该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因glw2确定物理位置，提取snp位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：1引物设计将glw2(ncbi：loc4330436)基因确定在2号染色体长臂端15.3kb范围内，利用glw2的供体材料与非供体材料的重测序数据对此基因区间及其附近两侧的snp位点进行挖掘。glw2基因区间存在一个mirna396结合位点，在基因供体材料中，该位点发生突变不能被mirna396所剪切，表现为大粒。将选出的snp位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站batchprimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。k_020501的引物设计如表1所示，每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接fam和hex荧光序列。引物委托invitrogen公司合成。表1：k_020501的引物设计2样品检测dna提取：从水稻叶片中提取基因组dna，采用简化ctab法。kasp反应测试：kasp反应测试在lgcsnpline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngdna样品，烘干后加入kasp反应混合液，反应体系见表2。pcr扩增在水浴热循环仪中完成，touchdownpcr反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，61℃～55℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，32个循环。反应完成后利用扫描仪pherastar对kasp反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。表2：kasp检测的反应体系终浓度体积(ul)100umprimerc0.42μm0.0125100umprimerx0.17μm0.0050100umprimery0.17μm0.00502xkaspmastermix1x1.4792超纯水1.4983总体积33标记分型数据根据上述检测方法，用标记k_020501对含有glw2基因的水稻品种和其它不含的23个水稻品种进行kasp初筛反应验证，结果如表3所示。表3：k_020501初筛分型数据材料编号材料名称k_0205011307rt:t2明恢63g:g3黄华占g:g4籼小占g:g5蜀恢527g:g6珍汕97bg:g7南京11g:g89311g:g9ir24g:g10ir64g:g11多年生稻g:g12野生稻g:g13slg1g:g14特青g:g15lemontg:g16kasalathg:g17中花11g:g18nipponbareg:g19武育粳3g:g20tp309g:g21辽粳294g:g22松粳6g:g23asominorig:g由表3可以看出，除了大粒材料307r测试位点检测结果为碱基t，其他10份水稻材料均在测试位点检测出碱基g，证明了本发明对glw2基因检测的准确性。4自然群体验证利用180份材料对snp标记k_020501进行自然群体验证。180份材料中包括已知含纯合glw2基因的品种，常见杂交稻、核心水稻育种和核心育种材料构建的f1材料。标记在自然群体分型结果如图2所示，只有1份的材料检测为具有大粒性状的纯合glw2基因型且为为已知的glw2供体，其余材料除了分型不明确和无扩增外均为非大粒的纯合glw2基因型。可见，snp标记检测的位点为高特异型位点，glw2基因未在检测的常见水稻育种中广泛应用，后续导入glw2基因定向改良水稻基因，k_020501可用于水稻glw2基因的高效检测。本发明中使用的lgcsnpline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国lgc公司。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>华智生物技术有限公司<120>一种水稻粒型相关基因glw2的snp分子标记及其应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtttccacaggctttcttg19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgtttccacaggctttcttt20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccggattccaagtactgc18当前第1页12