检测水稻籽粒小粒形的分子标记及对应的基因和应用

本发明涉及一种检测水稻籽粒小粒形的分子标记及其应用。

背景技术：

提高水稻产量一直以来都是水稻育种的主要目标，水稻的粒形性状是与水稻产量最为直接相关的农艺性状之一，并且还与稻米品质有一定关系。杂交水稻技术从20世纪70年代问世以来就展现出无与伦比的优势，20多个国家得到推广应用，为解决世界粮食安全问题做出了突出贡献。但是近年来杂交水稻推广形势却不容乐观，呈逐年下降之势。随着农业现技术代化水平提高，杂交水稻的制种无法与现代机械化耕作栽培方式配套，导致生产成本大大提高，而其效益优势逐渐被抵消。杂交水稻制种成本高是杂交稻生产成本高的重要原因之一，而人工成本在杂交稻制种成本中又占有很大比重，机械化制种需求日益提升。因此，在杂交水稻制种过程中，除了选育强优组合，要努力攻克的另一个方面是加强与制种相关机械的研制和开发；父母本同播、同收机械分选是机械化制种一个重要的方向，可以一定程度上解决人工难题，例如可以利用籽粒大小差异的“筛选机”等分离机械。因此，小粒基因的发掘及其功能性分子标记在水稻育种上的应用，对于稻米外观品质和机械制种都有很重大的意义。

目前现有的生长调节因子基因，赤霉素信号传递途径是一个关键元件，作为一个植物碳-氮代谢的正调控因子，可以促进氮素吸收、同化和转运途径，以及光合作用、糖类物质代谢和转运等，进而促进植物生长发育维持植物碳-氮代谢平衡，其序列如seqidno:1所述。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种调整水稻籽粒粒形的基因及其用途，以及提供其对应的分子标记sscp1。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种调整水稻籽粒粒形的基因的分子标记sscp1，以水稻作为物种，分子标记引物为正向引物：5’-tttggcggatgagcagagtc-3’，反向引物为5’-ccaaagaacgaaagtggctg-3’。

本发明还同时提供了一种调整水稻籽粒粒形的基因(野生型基因)，其核苷酸序列如seqidno:1所述。

本发明还同时提供了上述基因(野生型基因)的用途，调节(正向调节)水稻籽粒粒形，即，使得水稻籽粒变长、变宽。

本发明还同时提供了一种水稻突变基因的用途：使得水稻籽粒变小变短，千粒重下降；

所述水稻突变基因的核苷酸序列为在seqidno:1的基础上作了如下的突变：第3082由g突变为t。

本发明还同时提供了一种筛选水稻籽粒粒形的方法，利用上述分子标记sscp1：

将需要改良粒形的水稻材料与突变体tsg2杂交后构建f2群体，在群体中利用sscp1分子标记进行筛选；所述突变体tsg2的核苷酸序列为在seqidno:1的基础上作了如下的突变：第3082由g突变为t。

作为本发明的筛选水稻籽粒粒形的方法的改进：

筛选判断规则为：

当条带为野生型或者父本一致时，则判定为hh；

当条带为tsg2突变体一致时，则判定为hh；

当条带兼有两种类型，则判定为hh。

从而实现检测hh、hh和hh三种不同的基因型。

本发明涉及小粒水稻材料tsg2调控小粒基因的图位克隆、基因功能互补及其功能分子标记sscp1的开发，通过小粒水稻材料tsg2和分子标记sscp1的配套使用，改良水稻粒形。将需要改良粒形的水稻材料与小粒tsg2杂交后构建f2群体，在群体中利用sscp1分子标记进行筛选。检测水稻细长粒的分子标记方法包括水稻植株dna提取、特异性分子标记的pcr扩增、带型分析。小粒水稻材料tsg2和分子标记sscp1配套使用，可检测hh、hh和hh三种不同的基因型。本发明涉及到小粒基因的定位，特异性分子标记sscp1的开发，对水稻苗期提取的dna进行pcr扩增后，根据其pcr产物，检测不同水稻植株的基因型，用于辅助选择粒形育种。该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是野生型日本晴和tsg2突变体的籽粒；

(a)野生型日本晴和tsg2突变体的籽粒发育过程；dap:授粉天数(daysafterpollination；dap)；6dap、8dap、10dap和12dap分别代表授粉4天、6天、8天、10天和12天以后的水稻籽粒；

(b)野生型日本晴和tsg2突变体的成熟种子。标尺为3.4mm；上图代表粒长，下图代表粒宽。

图2野生型日本晴和突变体tsg2的稻米颖壳结构；

a：野生型日本晴颖壳内表皮薄壁细胞；

b：突变体tsg2颖壳内表皮薄壁细胞；

c：颖壳内表皮薄壁细胞长度；

d：颖壳内表皮薄壁细胞宽度；

e：野生型日本晴颖壳外表皮细胞；

f：突变体tsg2颖壳外表皮细胞；

g：颖壳外表皮薄壁数目；

a、b、e和f的标尺为100μm。*：在0.05水平上差异显著；**：在0.01的水平上差异显著；t测验；

wt：野生型日本晴；tsg2：突变体tsg2。

图3是tsg2的基因定位；

(a)tsg2基因初步定位在第2染色体上标记rm497和2myh02之间；pl：染色体短臂；ql：染色体长臂；

(b)tsg2基因被精细定位到一个78kb的区间；

(c)区间中包含7个注释基因；

(d)候选基因loc_os02g47280的结构；

图4基于ostsg2基因序列开发的sscp分子标记；

野生型为日本晴。

图5tsg2小粒突变体及其过表达tsg2基因的两个株系粒形图；

(a)粒长；

(b)粒宽；

(c)粒厚；

tsg2：小粒突变体；oe#1：过表达株系1；oe#2：过表达株系2。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：突变体tsg2的鉴定及分析

通过甲基磺酸乙酯(ems)诱变处理日本晴，取粳稻种子500g，浸种16h，用4％ems诱变处理8h，晾干。处理后的种子播种于海南陵水县育种基地，25d秧龄移栽。m1成熟以后混合收种，第二年五月在杭州浙江大学实验农场播种种子，一个月以后移栽，单本插，观测株高、株型、穗部、叶片和生育期等植株性状，筛选各种形态突变体。鉴定到一个小粒的粳稻突变体tsg2，该粳稻突变体tsg2满足小粒形的表型要求。连续多代种植，该突变体的农艺性状表型稳定(表1)。与野生型日本晴比较，在授粉后四天内，tsg3突变体的粒形基本上跟日本晴一致，但是在授粉6天开始，tsg3突变体的粒形粒形明显小于日本晴，在授粉后12天两者差异最为明显(图1a)。成熟后收获种子，发现tsg3突变体的粒长、粒宽均显著小于日本晴(图1b)。虽然突变体tsg2的粒长、粒宽和千粒重明显降低，但是因其分蘖数显著增加，最终导致单株产量明显增加(表1)。

表1野生型日本晴和tsg2突变体的农艺性状

*和**分别代表在0.05和0.01水平上显著差异。

通过扫描电镜分析发现，突变体tsg2的颖壳内表皮细胞不但比野生型日本晴稍小，而且细胞数目也是显著减少(图2a-g)。紧接着通过对小穗横截面的石蜡切片分析发现，突变体tsg2颖壳的外薄壁细胞的大小和数目与野生型日本晴也呈现同样的趋势(图2e和2f)。据此分析，突变体sg3和野生型浙农41粒形的差异是由于稻米细胞数目的变化和大小引起的。

实施例2：突变体tsg2的遗传分析及其图位克隆

突变体tsg2/野生型日本晴杂交，得f1代，f1代自交，得f2代。

在突变体tsg2/野生型日本晴构建的f2代遗传分析群体中，小粒粒植株和正常粒形的植株数目分别为2225株和710株，经卡方检验符合3:1(χ²＝2.05<χ²0.05＝3.84)的分离比。说明突变体tsg2粒形的变化是由一个隐性核基因控制的。

利用图位克隆的方法，构建了突变体tsg2/02428的f2定位群体。选择350对随机分布在水稻12条染色体上的ssr和indel分子标记，利用bsa(bulksegregationanalysis)法来筛选连锁标记，发现分子标记rm497与调控小粒的位点存在连锁(图3a)。通过初步定位，tsg2基因定位在第2染色体上标记rm497和2myh02之间(图3b)。扩大群体样本量，选择672个小粒形的f2植株进行精细定位，将tsg2基因定位区间缩小到分子标记2myh03和2myh04之间78kb内(图3c)。根据网站ricegenomeannotationprojectwebsite(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中的注释信息，得知该区间中包含7个注释基因(表2；图2d)。对于这个7个基因的编码读码框、及其上游2kb和下游1kb的片段扩增测序。相较于野生型日本晴，突变体tsg2上的loc_os02g47280基因3082bp位置有一个碱基替换，从g替换成了t，loc_os02g47280基因编码了一个生长调节因子-ostsg2，该碱基替换直接导致了osgrf4上的丙氨酸变成了丝氨酸(seqidno:2)。

因此，野生型基因的核苷酸序列如seqidno:1所述；突变体的氨基酸序列如seqidno:2所示。

表2目的区间内的候选基因

实施例3、基因功能互补

以日本晴叶片dna为模板，通过pcr扩增包括目的基因上游启动子序列、下游终止序列及编码序列的ostsg2全长(seqidno:3)，构建互补载体pcambia1301-tsg2，转入农杆菌lab4404。

选择成熟的tsg2突变体水稻种子机械脱壳后，75％乙醇消毒1min和20％次氯酸钠溶液后，用无菌水冲洗水稻种子4～5次。稍吹干后放置诱导培养基nbd上培养2周。培养带有pcambia1301-tsg2的农杆菌，使菌液od600＝0.2～0.4，并与淡黄色致密的胚性愈伤组织共培养，使农杆菌侵染愈伤组织。将愈伤组织从共培养培养基上取出转入筛选培养基上培养。在筛选培养基上28℃黑暗培养2周，直至有新的颗粒状的抗性愈伤组织长出。经过一周的预分化后转到分化培养基上，至愈伤组织会长出绿点，分化出幼小植株。待新生植株长至3cm左右即可转入生根培养基。当植株长至瓶口处可打开瓶盖，加少量水室内炼苗2～3d，然后洗去粘附在根上的培养基，换上营养液后继续炼苗2～3d后移栽。鉴定t1植株粒形，发现tsg2突变体恢复至正常状态。从而确定ostsg2基因为本发明的目标基因，其调控了tsg2突变体的籽粒大小。

实施例4、粒形改良及分子辅助育种

1)、配置育种组合

将需要进行粒形改良的水稻材料日本晴为母本，突变体tsg2材料为父本，获得f1种子，自交后获得f2群体。

说明：f2群体有多个单株，有些单株粒形跟突变体亲本一致，为该f2群体中的小粒植株；而其他植株的粒形跟正常粒形的亲本一致，为正常粒形植株。

2)、选择水稻单株，提取dna，具体步骤如下：

取新鲜的水稻叶片，把叶片剪碎后，转移到1.5ml离心管中，并加入65℃预热的ctab溶液800μl，加入小铁珠后研磨成匀浆。65℃水浴中30min，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，充分混匀离心管后，12000r离心10min。取上清液放入新的1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇溶液，于4℃条件下放置10min，于4℃条件下12000r离心5min。倒掉离心管上清液后，加入400μl75％的乙醇溶液，12000r离心3min，再次弃上清，室温中晾干离心管。在离心管中加入150μl超纯水，得到水稻基因组dna。

3)、pcr扩增目标片段：

pcr反应体系(10μl)为：dna模板体积0.5μl，浓度10μm的分子标记sscp1的正向引物(5’-tttggcggatgagcagagtc-3’)和反向引物(5’-ccaaagaacgaaagtggctg-3’)，各0.15μl，dntps0.15μl，10×pcrbuffer1μl，taq酶0.2μl，最后用超纯水加至10μl。pcr克隆需要的程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec、72℃30sec，30个循环；72℃5min；4℃反应停止，获得195bp的扩增片段：

tttggcggatgagcagagtcaactcattactgaagctatcaacacatctattgaaaatccatggcggctgctgccatctcagaactcgccatttcccctttcaagctattctcagctgggggcactaagtgaccttggtcagaacacccccagctcactttcaaaggttcagaggcagccactttcgttctttgg。

4)、单链构象多态性(sscp)电泳

野生型日本晴和突变体tsg2仅有单碱基的差异，因此开发了单链构象多态性(sscp)分子标记。具体过程如下：

(1)按需要配好10％聚丙烯酰胺凝胶溶液(表2)后，充分混匀并缓慢倒入每个玻璃板组合中两块玻璃板之间的缝隙。倒满后，插入带齿的梳子。

表2、sscp检测体系

(2)当玻璃板间的溶液完全凝固后，拆掉胶条以及琼脂条，装入垂直电泳槽(凹槽向内)。向电泳槽灌入1×tbe电泳缓冲液，用力均匀地将梳子拔出。

(3)梳子拔出后，300v电压预电泳30分钟至胶体微微发热即关闭电源。

(4)取2μl的扩增长度为195bp的pcr产物(步骤3)所得)，小心地加入8μl2×sscp上样缓冲液中。100℃下变性10min，随后迅速放置于冰上冷却，取2μl变性产物加入上样孔内。

(5)开始电泳。前五分钟电压设置为180v，随后将电压设置在100-120v之间。

(6)电泳结束后，剥离聚丙烯酰胺胶转移到用0.1％硝酸银溶液中，染色10min。离子水漂洗凝胶2次。

(7)用含1.5％naoh，0.019％碳酸氢钠和0.375％甲醛的显色液处理凝胶5min，直至肉眼可区分的条带结果出现，记录数据并拍照(图4)。

5)、水稻基因型分型：

sscp的带型结果请见图4。扩增产物的双链经过变性后，形成了两条单链dna。

把与突变体tsg2对应的条型一致基因型标记为hh，与父本带型一致的标记为hh，杂合基因型则为hh。我们对群体中的植株进行了基因型鉴定，根据特异性分子标记sscp1的带型，检测显性基因h和隐性基因h的存在与否。

即；判断规则为：当条带为野生型或者父本一致时，则判定为hh；当条带为tsg2突变体一致时，则判定为hh；当条带兼有两种类型，则判定为hh。

实施例5、一种筛选水稻籽粒粒形的方法，

将需要改良粒形的水稻材料浙农34、9311分别与突变体tsg2杂交获得f1种子，自交后获得f2群体，在群体中利用sscp1分子标记进行筛选；

筛选结果分别为(根据条带进行判定)呈现三个类型的带型。

验证实验：将f2群体分别进行种植，所得结果为：筛选结果为hh时，种植后所得水稻籽粒粒形为小粒形；筛选结果为hh或hh时，种植后所得水稻籽粒粒形为正常大小的水稻。

因此，证明：本发明的筛选方法确实有效，且正确率高。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>检测水稻籽粒小粒形的分子标记及对应的基因和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3825

<212>dna

<213>水稻(oryzasatival.)

<400>1

aaagcaccattactaaagaccgcggcgtgtgcttgcgttgcgagcgagcgagagcgagag60

agagattgagagagagagagggaagggatggcgatgccgtatgcctccctgtctccggcg120

gtggccgaccaccgctcgtccccggcagccgcgaccgcctccctcctccccttctgccgc180

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ttatgcagctgttggtggtggaacaggcaaagatctcaggtgattgttcatttctttttt1560

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aatctgtatttttcattgtgatcggttaataactgtgtcccatttgtttgcattggtggc1740

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ctgcctctttgcccttcccatactttctggtatcagttttcagccccagaagccggggac1920

agtctccataagagatttctgctcaggtgaaactggggtgcagggtcttaacatggcttt1980

ggcccagtagtttgaaacatgtactgtccataaagatgatactactacatatttgtgtct2040

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tatttggcccttgcaaaatactgtctctgaagatgtctcaccgatcaccactatacctga2220

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tcccaaatgctgatcagcctctgcttgctatgctctcctgtttgtcgactcaacagtgcc3780

gtcaacatcagtgcagcaacgtgaggctcatgctttttaaggtca3825

<210>2

<211>422

<212>prt

<213>水稻(oryzasatival.)

<400>2

metproprocysleuargargtrpprothrthralaargproarggln

151015

proargproproproserserproseralaalaproproargserpro

202530

arglysglnarggluproalaalathrthrhispheleuglyserser

354045

glyalacysaspasnthrvalargargcysvaltrpvalglyglycys

505560

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65707580

argtrpproproalaalaalaalaargleuproprophethralaala

859095

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100105110

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130135140

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165170175

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180185190

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225230235240

glyglyglyglyargasnmetproserserpheglyseralaleugly

245250255

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260265270

glythrglylysaspleuargtyrthralatyrglythrargserleu

275280285

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290295300

gluasnprotrpargleuleuproserglnasnserpropheproleu

305310315320

sersertyrserglnleuglyserleuseraspleuglyglnasnthr

325330335

proserserleuserlysvalglnargglnproleuserphephegly

340345350

asnasptyralaalavalaspservallysglngluasnglnthrleu

355360365

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370375380

leualaaspgluasnalaasnleuserserpheserglythrglnleu

385390395400

serileserileprometalaserserasppheseralaalaserser

405410415

argserthrasnglyasp

420

<210>3

<211>4388

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gtactaaggtcagactgagattcaccgaagataaatcaaagagttcctttttttttgtag60

ggaagataaatcaaagagttgcattgttaaaatctaatcatcaacattggatgagtatag120

agttgacttggagcatcatgcagctcacgctggccactggaaaatgtttcaggtatagtg180

gtgatcggtgagacatcttcagagacagtattttgcaagggccaaataattgactgcccc240

tgaagagcagagacagaaacaactggattctgtggaggaataaagaagtggagtaaatgc300

caagggaagccatgatcagctaccagcaggcacaagcactgcgagggcagacacaaatat360

gtagtagtatcatctttatggacagtacatgtttcaaactactgggccaaagccatgtta420

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agcaccaaatcgaagtagtactactgagcatggacagctgattcgattgccaccaatgca660

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