一种大规模生产重组Exendin-4多肽的发酵方法与流程

本发明涉及产品发酵领域，具体涉及一种大规模生产重组exendin-4多肽的发酵方法。

背景技术：

iptg作为基因工程菌调控乳糖操纵子的诱导剂，能够激活乳糖操纵子，使操纵子下游编码rexendin-4融合蛋白的基因表达，从而获得含有rexendin-4的融合蛋白。在工程菌的培养过程中iptg不会被降解，iptg具有潜在的毒性，影响最终原液的安全性。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的发酵生产重组exendin-4多肽有毒性物质残留的缺陷，从而提供一种生产重组exendin-4多肽的发酵方法，该方法不会产生毒性残留物质。

一种大规模生产重组exendin-4多肽的发酵方法，采用pet32a(+)-exendin-4/bl21(de3)发酵培养，在发酵中，以乳糖作为发酵培养的诱导剂。

可选的，诱导的条件为，加入乳糖的终浓度为5g/l-20g/l；可选的为5g/l。

可选的，所述的诱导的条件为，诱导温度为25℃-40℃，诱导时间为4-6小时；

可选的，所述的诱导温度为25℃-30℃或30℃-40℃；

可选的，所述的诱导时间为4-6小时，可选的为6小时。

可选的，发酵过程还包括加入补料培养基的步骤；

可选的，在开始诱导时加入补料培养基；

可选的，发酵使用的发酵培养基为tb培养基；

可选的，所述tb培养基含有8ml/l甘油。

可选的，菌体od600值为8～12时，加入诱导剂。

可选的，发酵培养基的体积为50l-500l；可选的，为200l。

可选的，诱导剂分1-6次加入；可选的为2-6次加入；可选的，将开始诱导时记为第0小时，于第0、1、2、3、4小时各加1/5体积诱导剂。

可选的，发酵之前还包括：1)一级种子制备和2)二级种子制备的步骤。

可选的，一级种子制备方法：取申请号为200410052039.4制备的pet32a(+)-exendin-4/bl21(de3)原始菌液，按1‰(v/v)接种量接种到1500ml一级种子培养基中，培养温度为36℃-38℃(可选的为37℃)，转速为220rpm-270rpm(可选的为250rpm)，振荡培养15～17h，得到一级种子培养物；

可选的，二级种子制备方法为：将一级种子培养物移种到培养基体积为30l-50l发酵罐中，温度设置37℃，转速250rpm，振荡培养2.0～3.0h，测od600值达到3.0～5.0后，得到二级种子培养物；

可选的，补料培养基由mgso4·7h2o、胰蛋白胨、酵母提取物和甘油组成，mgso4·7h2o的浓度为11-12g/lg/l，胰蛋白胨的浓度为98g/l-102g/l、酵母提取物的浓度为98g/l-102g/l，甘油的体积百分数为20％。

可选的，补料培养基由mgso4·7h2o、胰蛋白胨、酵母提取物和甘油组成，mgso4·7h2o的浓度为11.4g/l，胰蛋白胨的浓度为100g/l、酵母提取物的浓度为100g/l，甘油的体积百分数为20％。

发酵具体为如下步骤：

将30l二级种子培养物通过移种管道转移入到500l发酵罐内(培养基体积为200l)；温度37℃±2℃，溶氧30％(偶联通气与搅拌)，ph波动范围7.00±0.20；od600至8～12开始诱导，即补加补料培养基460ml和乳糖溶液400ml，同时培养温度降为30℃±2℃，上述400ml乳糖分5次补加，每次补加80ml，从诱导0h算起，前5h全部补完使加入罐内乳糖终浓度为5g/l。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供一种大规模生产重组exendin-4多肽的发酵方法，采用pet32a(+)-exendin-4/bl21(de3)发酵培养，在发酵中，以乳糖作为发酵培养的诱导剂。乳糖代替iptg作为工程菌发酵培养的诱导剂，乳糖在发酵过程中会被菌体做为碳源分解代谢，不会产生毒性残留物质。

2、为使重组exendin-4多肽的工艺更加适用于产业化生产，对发酵工艺参数进行了优化，发酵规模由30l扩大为500l，优化后的菌体湿重、蛋白表达量(高达14.1％～14.6％)优于前工艺，且不会产生具有潜在的毒性残留。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1不同乳糖浓度诱导的结果对比；

图2不同温度诱导4小时电泳图；图中s1表示实验编号，没有实际意义，20080417和20080422均为实验时间，没有其他涵义；

图3不同温度诱导6小时电泳图；图中s1表示实验编号，没有实际意义，20080417和20080422均为实验时间，没有其他涵义；

图430℃诱导不同时间表达量的电泳图；图中s1表示实验编号，没有实际意义；

图5不同培养基30℃诱导6小时电泳图；图中s1表示实验编号，没有实际意义

图6乳糖不同加入方式电泳图；

图7发酵工艺流程图。

具体实施方式

本发明使用的是授权公告号为：cn100535111c中实施例1公开的工程菌(pet32a(+)-exendin-4/bl21(de3))制备重组exendin-4多肽。

实施例1重组exendin-4多肽的制备

总体工艺流程见图7，本实施例通过实验摸索，确定了乳糖的诱导浓度、诱导温度和诱导时间。在以乳糖作为诱导剂，比较了三种培养基tb、lb、lm9的表达量。在确定选用tb培养基后，比较了乳糖加入方式对发酵及表达的影响。根据摸索的实验数据，在发酵罐进行放大和研究。

1、乳糖诱导浓度的确定

取菌种接种于250ml摇瓶(含50mllb培养基)中，37℃培养至od600值2，按5、10、20、30、40g/l(终浓度)添加乳糖，诱导培养4小时取样检测，比较不同乳糖浓度对表达的影响，结果显示：乳糖加入在30g/l以上，出现表达量下降(图1a)；再分别按5、10、15、20g/l添加乳糖进行诱导，诱导培养4小时取样检测，结果显示加入乳糖量5-20g/l的表达量接近(图1b)，5g/l乳糖量的结果略高，因此确定用乳糖诱导浓度为5g/l。

2、诱导温度及诱导时间的确定

取菌种接种于250ml摇瓶(含50mllb培养基)中，37℃培养至od600值2，按终浓度5g/l添加乳糖，分别置25℃、28℃、30℃、32℃、37℃、40℃培养，并在诱导后4、6小时取样进行sds-page分析(见图2-4)，将sds-page半定量结果进行统计学分析，得表1和2。结果显示30℃诱导6小时表达量最高(表1、2)，所以确定用30℃诱导培养。通过在30℃诱导4至8小时比较，在6小时后表达反而下降(表3、图4)，确定诱导温度及时间为30℃、6小时。

表1不同温度乳糖诱导4小时表达情况

表达量＝融合蛋白质量/菌体总蛋白质量×100％。

表2-1不同温度乳糖诱导6小时表达情况

表2-230℃诱导不同时间表达量

表达量＝融合蛋白质量/菌体总蛋白质量×100％。

3、培养基的确定

取菌种接种于分别含50ml的tb、lb、lm9培养基的250ml摇瓶中，置37℃培养至od600值2，按5g/l添加乳糖，30℃诱导培养6小时后取样进行sds-page分析及测定生物量，上述实验重复4次，结果显示tb培养基的表达量及生物量均高其它两种培养基(表3，图5)，且由于tb培养基的营养结构更完整，适合放大生产，所以确定发酵培养基为tb培养基。

表3-1lm9培养基

表3-2tb培养基

表3-3lb培养基

表3-4不同培养基表达量的比对

表达量＝融合蛋白质量/菌体总蛋白质量×100％。

4、乳糖加入方式对结果的影响

乳糖作为诱导剂又作为碳源利用，当加入浓度过高时，会影响菌体的生长与产物表达。故在乳糖加入总量不变的情况下，分次加入进行表达比较。

菌种转接于tb培养基中，37℃培养至od600值2，转入30℃诱导培养，乳糖分1、2、4、5、6次平均加入(1次是在开始诱导时全部加入；2次是在开始诱导与诱导三小时后各加入一半；4次是从诱导开始每隔一小时加入1/4，前4小时补完；5次是从诱导开始每隔一小时加入1/5，前5小时补完；6次是从诱导开始每隔一小时加入1/6)，乳糖总加入量均为每升tb培养基培养基加入5g乳糖。平行对照加入终浓度为0.5mmiptg。上述实验重复2次，即实验1和实验2，其中乳糖加入方式4次的实验，进行了4次重复(见图6a和b)。试验结果取平均值。试验结果显示，分5次平均加入的表达量及生物量均略高(表4，图6)。因此确定在乳糖总加入量不变的情况下，以每小时补加1/5体积的乳糖溶液的方式进行诱导，即从诱导开始，诱导第4小时补完。

表4不同乳糖加入方式表达量的比对

注：表达量＝融合蛋白质量/菌体总蛋白质量×100％；

其中，乳糖加入方式4次的实验，进行了4次重复(见图6a和b)，均值为13.3；表中列出了其中2次。

5、乳糖诱导时机的确定

对诱导时机及补料调控做进一步优化，以提高菌密度及表达量，增加单位发酵体积产量。主要的优化条件：

1)根据该菌在5l发酵罐中培养的生长曲线，分别取od600值3～5和8～12时工程菌诱导；

2)tb培养基中的甘油含量由原来4ml/l提高到8ml/l；

3)补料培养基(11.4g/lmgso4·7h2o、100g/ltrytone、100g/l酵母提取物(yeastextract)、20％(v/v)甘油)以甘油作为碳源，比较10％(v/v)、20％(v/v)甘油对表达和生物量的影响。

结果显示：在初始tb培养基中增加甘油含量后，前期生长速度有所加快；当诱导时机od600值8～12，补料培养基中加入20％的甘油，在此条件下，生物量和表达量相对较高(表5)。

表5：在5l发酵罐不同条件发酵的结果对比

注：表达量＝融合蛋白质量/菌体总蛋白质量×100％。

6、发酵工艺优化结果

综合以上实验摸索结果，初步确定发酵工艺条件：发酵培养基为tb培养基(甘油量8ml/l)，培养温度37℃，ph值7.0、溶解氧(do)值30％，诱导时机od600值8～12，诱导温度30℃，诱导时间6小时，乳糖诱导浓度5g/l(诱导第0、1、2、3、4小时各加1/5)，补料培养基(11.4g/lmgso4·7h2o、100g/l胰蛋白胨、100g/l酵母提取物、20％甘油(v/v))根据溶氧及ph值变化情况进行补加。

7、发酵工艺

对开发的重组促胰岛素分泌素(rexendin-4)发酵工艺进行商业化规模研究。

1)一级种子液制备

取工作种子一支，按1‰(v/v)接种量接种到0.75l一级种子培养基(tb培养基)中，放置于摇床中，温度设置37℃，转速250rpm，培养15～17h，测od600值(见下表)。

2)二级种子液制备

将一级种子培养物移种到50l发酵罐，培养基(tb培养基)体积为30l，温度设置37℃，溶氧30％，转速250rpm振荡培养2～3h，测od600值达到3～5后，得到二级种子培养物。

3)发酵

将30l二级种子培养物通过移种管道转移入到500l发酵罐内(培养基体积为200l)。温度37℃±2℃，溶氧30％(偶联通气与搅拌)，ph波动范围7.00±0.20。od600至8～12开始诱导，即补加补料培养基460ml和乳糖溶液400ml，同时培养温度降为30℃±2℃，上述400ml乳糖分5次补加，每次补加80ml，每次补加乳糖时间在4-5min内进行补完，从诱导0h算起，前5h全部补完使加入罐内乳糖终浓度为5g/l。ph高于7.0并不断攀升时，补加补料液直至发酵结束。诱导5～6h，od600值变化趋势趋于平缓时，终止发酵。

表6发酵工艺研究结果

上述实验结果表明：蛋白表达量为14.1％～14.6％，证明此工艺放大后能保证稳定的水平。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。