用于蛋白二聚化的三部分型系统和使用方法与流程

用于蛋白二聚化的三部分型系统和使用方法
1.本技术要求2019年7月15日提交的美国临时申请第62/874,025号的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。
技术领域
2.本披露涉及允许多肽(靶蛋白和结合成员(binding member)与之融合)的受控相互作用的组合物和方法。这些组合物和方法利用与小分子结合形成复合物的靶蛋白和特异性结合该复合物的结合成员，其中该靶蛋白源自非人蛋白并且该小分子是非人蛋白。非人蛋白可以源自细菌、病毒、真菌或原生动物蛋白。非人蛋白可以源自病毒蛋白酶并且小分子是病毒蛋白酶抑制剂。本披露还涉及含有靶蛋白和结合成员的二聚化诱导型蛋白，例如分拆式转录因子和分拆式嵌合抗原受体。本文所述的方法和组合物可应用于例如涉及蛋白的受控表达和/或活化的细胞和基因治疗方法中。


背景技术：

3.蛋白-蛋白相互作用(ppi)代表了一种控制多种生物学功能的通用调节机制。例如，基因转录、蛋白折叠、蛋白定位、蛋白降解和信号转导都依赖于一种蛋白与另一种蛋白或事实上其他几种蛋白的相互作用或接近。通过在时间上控制蛋白-蛋白相互作用，研究人员可以很容易地监测ppi的功能后果，从而能够剖析复杂的生物机制。此外，控制生物功能的能力正在细胞和基因疗法中被用来控制治疗活性，从而实现更安全和更个性化的治疗。
4.控制蛋白-蛋白相互作用的常用技术是使用所谓的二聚化化学诱导剂(cid)，它是使两种在没有cid时不相互作用的蛋白在一起形成三部分型三元复合物的小分子(stanton，chory，和crabtree 2018)。最广泛使用的cid是雷帕霉素(来自吸水链霉菌的免疫抑制药物)及其类似物，它与蛋白fkbp12(12-kda fk506结合蛋白)和frb(来自mtor(哺乳动物雷帕霉素靶点))形成异二聚体复合物(sabers等人，1995)。雷帕霉素以及其他天然存在的cid，如植物激素s-(+)-脱落酸(aba)和赤霉素(ga3-am)的一个吸引人的特征是其协同结合机制，凭此蛋白2只能与蛋白1：cid复合物结合((banaszynski，liu和wandless 2005)。从头cid也可以通过结合相同或不同蛋白的两个小分子的化学连接产生，其中这些蛋白构成二聚化蛋白对(belshaw，ho，等人1996；belshaw，spencer，等人1996)。然而，在这些系统中，在高浓度的双功能cid下，一个蛋白配偶体和cid之间的非生产性复合物超过了三部分型复合物(tripartite complex)的产生，这意味着无法实现线性剂量应答。
5.因此，对于可用于调节细胞功能并扩大可用于复杂遗传回路的正交系统的数量的新型协作结合cid系统的需求日益增加。此外，很少有cid被批准用于长期人使用。最近，描述了一种使用基于抗体的噬菌体展示筛选方法生成从头cid系统(abcid)的方法(hill等人，2018)。该研究中使用的cid是abt-737，一种bcl-2和bcl-xl抑制剂，bcl-xl本身被用作蛋白配偶体之一。然后从单链fab(scfab)分子的噬菌体展示文库中筛选第二种蛋白，其以对bcl-xl：abt-737复合物的选择性超过对单独bcl-xl的选择性。
6.hill等人2018和wo 2018/213848a1描述的通过利用现有的小分子及其靶标鉴定
复合物特异性分子的方法是一个有吸引力的方法，然而，某些人蛋白(例如抗凋亡bcl-xl蛋白)的过度表达以及与体内人靶标结合的小分子的使用并非没有风险。例如，功能性人蛋白的过度表达会对表达它的细胞产生影响，这可能会影响细胞的健康和活力。此外，由于小分子与内源性靶标和过表达靶标的结合竞争，使用其靶标在体内表达的小分子会导致剂量需求增加。此外，小分子与内源性靶标的结合将影响该蛋白的功能，这可能对表达靶标的细胞有害。


技术实现要素：

7.本文披露了一种旨在克服hill等人描述的abcid系统局限性的方法。首先，本文描述的小分子是那些已经被批准用于人使用的小分子，以促进更顺畅的监管批准途径。其次，而且重要的是，发明人认识到与筛选与非人蛋白，特别是病毒蛋白结合的小分子相关的优势，而不是鉴定具有人靶标的小分子。例如，使用没有人靶标的小分子有望提高在人中使用时的安全性。也有理由认为，使用病毒、细菌、真菌或原生动物靶蛋白将消除在人中使用时内源性小分子“下沉”的风险，其中除了与靶蛋白结合外，小分子还与人中的内源性靶标结合。此外，与具有内源功能的人蛋白相比，人细胞内病毒、细菌、真菌或原生动物蛋白的表达不太可能影响细胞的细胞生理学。
8.抗病毒药物已被批准，其结合并抑制各种病毒蛋白，包括病毒聚合酶、整合酶、转录酶和蛋白酶。发明人认识到源自病毒蛋白酶的靶蛋白尤其是有益的，因为这些蛋白酶位于细胞质中、较小且由离散结构域组成。
9.因此，本披露提供了一种或多种表达载体，其包含：
10.i)编码靶蛋白的第一表达盒，其中该靶蛋白能够结合小分子以形成靶蛋白和小分子之间的复合物(t-sm复合物)；和
11.ii)编码结合成员的第二表达盒，其中该结合成员与该t-sm复合物结合的亲和力高于该结合成员与单独的该靶蛋白和单独的该结合小分子结合的亲和力，
12.其中该靶蛋白源自非人蛋白并且该小分子是该非人蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白并且小分子是病毒蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白酶并且小分子是病毒蛋白酶抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自细菌蛋白并且小分子是细菌蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自真菌蛋白并且小分子是真菌蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自原生动物蛋白并且小分子是原生动物蛋白的抑制剂。
13.如本文所证明的，结合成员与t-sm复合物的结合形成由结合成员、靶蛋白和小分子组成的三部分型复合物，并且该三部分型复合物的形成可以通过该小分子的存在来控制。三部分型复合物的受控形成是有用的，例如，它允许与靶蛋白和结合成员融合至的多肽的受控相互作用。
14.本披露还提供了一种系统，其包含：
15.i)靶蛋白，其中该靶蛋白能够结合小分子以形成靶蛋白和小分子之间的复合物(t-sm复合物)；和
16.ii)结合成员，其中该结合成员与该t-sm复合物特异性结合，使得该结合成员与该t-sm复合物结合的亲和力高于该结合成员与单独的该靶蛋白和单独的该小分子结合的亲
和力，
17.其中该靶蛋白源自非人蛋白并且该小分子是该非人蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白并且小分子是病毒蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白酶并且小分子是病毒蛋白酶抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自细菌蛋白并且小分子是细菌蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自真菌蛋白并且小分子是真菌蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自原生动物蛋白并且小分子是原生动物蛋白的抑制剂。
18.在一些实施例中，病毒蛋白酶是hcv ns3/4a蛋白酶或hiv蛋白酶。已知这些蛋白酶被几种经批准的小分子靶向，这些小分子已知在人中通常具有良好的耐受性并适合长期给药，因此代表适用于本文的靶蛋白。
19.在一些实施例中，病毒蛋白酶是hcv ns3/4a蛋白酶，例如具有seq id no：1的氨基酸序列的蛋白酶。hcv ns3/4a蛋白酶是一种小的单体蛋白，可以在细胞质中表达，并且具有有限数量的内源性人靶标，因此使其成为理想的靶蛋白。
20.在一些实施例中，小分子选自由以下组成的组：西米普韦、阿舒瑞韦、伐尼瑞韦、波普瑞韦、那拉瑞韦和特拉瑞韦。所有这些小分子都被批准用于人治疗。在一些实施例中，小分子选自由以下组成的组：西米普韦、波普瑞韦和特拉瑞韦。这些小分子被批准用于人治疗，并且通常在人中具有良好的耐受性。
21.在一些实施例中，小分子是西米普韦。西米普韦是一种口服小分子，其具有细胞渗透性，并且具有支持每日一次给药的药代动力学(pk)谱。它已与利巴韦林和聚乙二醇化干扰素联合长期(长达39个月)使用用于治疗hcv感染，并被列入who基本药物清单，表明它是一种耐受性良好且广泛使用的药物。
22.发明人认识到，通过使用与其源自的病毒蛋白酶相比具有减弱病毒活性的靶蛋白，可以减轻由病毒蛋白酶过度表达引起的任何潜在的脱靶活性。因此，在一些实施例中，靶蛋白与其来源的病毒蛋白酶相比具有减弱的病毒活性。
23.例如，与其来源的病毒蛋白酶相比，靶蛋白可包含一个或多个氨基酸突变。在病毒蛋白酶是hcv ns3/4a蛋白酶的特定实施例中，靶蛋白可以在选自位置72、96、112、114、154、160和164的一个或多个氨基酸处具有氨基酸突变，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。例如，靶蛋白可以在位置154处具有氨基酸突变，例如突变为丙氨酸，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。如下所述，seq id no：1的位置72、96、112、114、154、160和164分别对应于seq id no：199中列出的全长ns3蛋白的位置57、81、97、99、139、145和149。这些示例指的是根据全长ns3蛋白的氨基酸编号的氨基酸位置。例如，在示例中提及
‘
s139a’突变对应于
‘
s154a’突变，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。
24.在某些情况下，可能期望竞争性小分子能够结合t-sm复合物中的靶蛋白，使得竞争性小分子能够置换t-sm复合物中的小分子，其中第二小分子不同于t-sm复合物中的小分子。这样，第二小分子可以降低结合成员、靶蛋白和小分子之间形成的三部分型复合物的半衰期。这可能是期望的，例如，在认为使用第二小分子来加速三部分型复合物的解离是有用的情况下，例如为了快速抑制由三部分型复合物形成而激活的二聚化诱导型蛋白的活性。
25.如本文所证明的，西米普韦以非常高的亲和力结合靶蛋白hcv ns3/4a蛋白酶(s139a)(seq id no：2)，使得结合靶蛋白的其他小分子不能从t-sm复合物中置换西米普
韦。发明人确定可以在靶蛋白中引入某些降低亲和力的突变，其降低西米普韦对hcv ns3/4a蛋白酶的亲和力并允许其他小分子与西米普韦“竞争”并破坏形成的三部分型复合物。因此，在病毒蛋白酶是hcv ns3/4a蛋白酶并且小分子是西米普韦的一些实施例中，靶蛋白可以在选自位置151和183的一个或多个氨基酸处包含降低亲和力的氨基酸取代，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。在一些实施例中，位置151处的降低亲和力的氨基酸突变是突变为天冬氨酸、天冬酰胺或组氨酸(例如天冬氨酸或天冬酰胺)，并且位置183处的降低亲和力的突变是突变为谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸(例如谷氨酸)。靶蛋白还可包含除了本文所述的其他突变之外的降低亲和力的氨基酸突变，例如在选自位置72、96、112、114、154、160和164的一个或多个氨基酸处的氨基酸突变。
26.在一些实施例中，结合成员是抗体分子，例如单链可变片段(scfv)，或抗体模拟物，例如tn3蛋白。在特定实施例中，结合成员是tn3蛋白或scfv，例如本文定义的tn3蛋白和scfv。与hill等人描述的系统中使用的单链fab(scfab)相比，tn3蛋白和scfv的尺寸都更小。这可能是有利的，例如当表达盒由编码能力有限的表达载体(例如病毒载体)递送时。本文描述了与hcv ns3/4a蛋白酶和西米普韦之间的复合物结合的特定tn3蛋白和scfv的开发和用途，其在本披露内容的上下文中被证明用作结合成员。这些tn3蛋白和scfv被称为hcv ns3/4a pr：西米普韦复合物特异性结合(prsim)分子。
27.认识到本文描述的方法可用于靶蛋白和结合成员单独融合至多肽(称为“组分多肽”)的情况。特别是，人们意识到可以实施该方法来控制需要二聚化或聚簇来驱动其活性的蛋白的活性。此类蛋白在本文中称为“二聚化诱导型蛋白”并且包括“分拆式蛋白”、“二聚化缺陷型蛋白”和“分拆式复合物”。分拆式蛋白包括可以分离或分拆成两个或更多个结构域使组分部分呈无功能或活性最低的单个蛋白；然而，当分离的组分多肽紧密接近时，可以启动或恢复功能或活性。示例包括分拆式荧光蛋白(例如分拆式gfp)、分拆式萤光素酶(例如nanobit)和分拆式激酶。另一个示例描述了分拆式转录因子，其中不同的dna结合结构域(dbd)和激活结构域(ad)被分开，使得单独的转录因子结构域不能单独启动转录。只有当这两个结构域紧密接近时，它们才能重建相关基因的转录激活(即它们形成功能性“转录因子”)。二聚化缺陷型蛋白是需要二聚化才能发挥活性的蛋白，但它们的内源性二聚化能力例如通过一个或多个二聚化结构域的突变或去除已失去。一个这样的示例是icasp9分子，这是一种去除了二聚化(card)结构域的半胱天冬酶9蛋白。分拆式复合物表示单个蛋白或2个或更多个不同的蛋白，它们不是最佳功能性的或功能不同，直到它们紧密接近或“聚簇”。一个这样的示例是分拆式嵌合抗原受体(car)。在这里，负责激活细胞信号传导的car的特定细胞内结构域在物理上是分开的，从而阻止了完全的细胞激活。一旦这些结构域靠近，细胞信号传导就会被激活(即它们形成完全功能性的car)。
28.因此，在一些实施例中，靶蛋白与第一组分多肽融合并且结合成员与第二组分多肽融合。在优选的实施例中，一种或多种表达载体编码二聚化诱导型蛋白，例如分拆式转录因子或分拆式car。
29.在一个实施例中：(1)第一组分多肽包含dna结合结构域并与靶蛋白融合形成dbd-t(dbd-靶蛋白)融合蛋白；并且第二组分多肽包含转录调节结构域并与结合成员融合以形成trd-bm(转录调节结构域-结合分子)融合蛋白，或(2)第一组分多肽包含转录调节结构域并与靶蛋白融合以形成trd-t融合蛋白；并且第二组分多肽包含dna结合结构域并与结合成
员融合以形成dbd-bm融合蛋白，其中第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成转录因子。
30.在另一个实施例中，第一组分多肽包含第一共刺激结构域并与靶蛋白融合；并且第二组分多肽包含细胞内信号传导结构域并且与结合成员融合。第一组分多肽可进一步包含抗原特异性识别结构域和跨膜结构域；第二组分多肽进一步包含跨膜结构域和第二共刺激结构域，其中第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成嵌合抗原受体(car)。
31.可替代地，第一组分多肽包含细胞内信号传导结构域并与靶蛋白融合，并且第二组分多肽包含第一共刺激结构域并与结合成员融合。第一组分多肽进一步包含跨膜结构域和第二共刺激结构域；第二组分多肽还包含抗原特异性识别结构域和跨膜结构域，其中第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成嵌合抗原受体(car)。
32.在另一个实施例中，第一组分多肽包含第一半胱天冬酶组分；第二组分多肽包含第二半胱天冬酶组分，并且第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成半胱天冬酶。
33.在一些实施例中，一种或多种表达载体是病毒载体，例如aav载体。
34.本披露还提供了体外制备病毒颗粒的方法，该方法包括用本文定义的一种或多种病毒载体转染宿主细胞并在宿主细胞中表达形成病毒颗粒所必需的病毒蛋白；在培养基中培养转染的细胞，使得这些细胞产生病毒颗粒。
35.本披露还提供了一种或多种病毒颗粒，其包含
36.i)编码靶蛋白的第一表达盒，其中该靶蛋白能够结合小分子以形成靶蛋白和小分子之间的复合物(t-sm复合物)；和
37.ii)编码结合成员的第二表达盒，其中该结合成员与该t-sm复合物特异性结合，使得该结合成员与该t-sm复合物结合的亲和力高于该结合成员与单独的该靶蛋白和单独的该小分子结合的亲和力，
38.其中该靶蛋白源自非人蛋白并且该小分子是该非人蛋白的抑制剂，并且其中该第一和第二表达盒形成一种或多种病毒颗粒中病毒基因组的一部分。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白并且小分子是病毒蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白酶并且小分子是病毒蛋白酶抑制剂。在另一个实施例中，非人蛋白源自细菌、真菌或原生动物蛋白。
39.一种或多种病毒颗粒中的表达盒、靶蛋白、小分子、结合成员可以如本文进一步描述的。如本文进一步描述的，靶蛋白和结合成员可以分别与第一和第二组分多肽融合(例如用于编码二聚化诱导型蛋白)。
40.病毒颗粒可以是aav颗粒。
41.在一方面，本披露提供了一种结合成员，其特异性结合i)源自非人蛋白的靶蛋白和ii)作为该非人蛋白的抑制剂的小分子之间的复合物，其中该结合成员与该复合物结合的亲和力高于该结合成员与单独的该靶蛋白和单独的该小分子结合的亲和力。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白并且小分子是病毒蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白酶并且小分子是病毒蛋白酶抑制剂。在另一个实施例中，非人蛋白源自细菌、真菌或原生动物蛋白。如本文所述，此类复合物特异性结合成员可用作控制结合成员、靶蛋白和小分子之间的三部分型复合物形成的途径，其方式克服了hill等人描述的结合分子的缺点。
42.在另一方面，本披露提供了包含靶蛋白和结合成员的二聚化诱导型蛋白，如本文所定义。例如，二聚化诱导型蛋白可以是分拆式转录因子、分拆式car或分拆式半胱天冬酶蛋白。
43.在一方面，本披露提供了细胞，例如同种异体或自体细胞，包括干细胞、诱导多能干(ips)细胞或免疫细胞，其包含本文定义的表达盒、表达载体、结合成员、靶蛋白或二聚化诱导型蛋白中的一种或多种。细胞可以表达本文所述的结合成员、靶蛋白或二聚化诱导型蛋白。本披露还提供了遗传修饰细胞以产生表达本文所述的结合成员或二聚化诱导型蛋白的细胞的方法，该方法包括向细胞施用表达载体。该方法可以在体外进行或离体。
44.另外还认识到，本文描述的其中靶蛋白和结合成员与分拆式转录因子的组分多肽融合的方法可用于涉及调节细胞中期望的表达产物(例如期望的多肽)的表达的基因治疗方法中。
45.因此，在一方面，本披露提供了一种调节细胞中期望的表达产物表达的方法，该方法包括：
46.i)在细胞中表达本文定义的二聚化诱导型蛋白，其中第一和第二组分多肽在二聚化后形成转录因子，并且其中dna结合结构域结合细胞中的靶序列，使得转录因子能够调节细胞中期望的表达产物的表达；并且
47.ii)将小分子施用至细胞以调节期望的表达产物的表达。
48.在该方法的一些实施例中，dna结合结构域靶序列位于启动子中，该启动子与期望的表达产物的编码序列可操作地连接。
49.该方法可包括递送编码二聚化诱导型蛋白的表达盒以控制也外源递送至细胞的期望的表达产物的表达。
50.因此，在一些实施例中，该方法包括向细胞施用第三表达盒，其中该第三表达盒编码期望的表达产物，并且其中该第三表达盒包含dna结合结构域的靶序列。
51.可替代地，该方法可包括递送编码二聚化诱导型蛋白的表达盒以控制已作为细胞基因组的一部分存在的期望的表达产物(即内源性的期望的表达产物)的表达。
52.因此，在该方法的其他实施例中，靶序列位于细胞的基因组中。
53.此外，人们认识到本文描述的方法可用于细胞疗法的方法中。此类方法通常涉及从个体(自体细胞)获取细胞，在体外修饰这些细胞以表达特定蛋白，例如二聚化诱导型蛋白，并重新施用回至该个体。
54.因此，本披露的另一方面提供了一种治疗方法，该方法包括：
55.i)将包含编码本文定义的二聚化诱导型蛋白的表达盒的细胞给予有需要的个体；并且
56.ii)将该小分子施用至该个体。
57.在一方面，本披露内容提供了编码本文定义的结合成员、靶蛋白和二聚化诱导型蛋白的核酸。
58.在一方面，本披露提供了如本文所定义的试剂盒。
59.另外认识到，可以利用另外的小分子(本文称为“竞争性小分子”)来诱导在结合成员、靶蛋白和小分子之间形成的三部分型复合物的解装配。这可能是有用的，例如，当需要快速灭活本文披露的二聚化的化学诱导剂(cid)时，例如为了关闭转基因表达或与二聚化
诱导型蛋白的活性相关的治疗活性。
60.本披露的另一方面提供了一种诱导三部分型复合物解装配的方法，该方法包括向包含三部分型复合物的细胞施用竞争性小分子，
61.其中三部分型复合物在结合成员与由靶蛋白和小分子形成的复合物(t-sm复合物)之间形成，其中该结合成员与该t-sm复合物结合的亲和力高于该结合成员与单独的该靶蛋白和单独的该小分子结合的亲和力，并且
62.其中竞争性小分子能够结合t-sm复合物中的靶蛋白并从t-sm复合物中置换小分子。
63.确定竞争性小分子是否能够与t-sm复合物中的靶蛋白结合并从t-sm复合物中置换小分子的方法包括以下测定，其中产生预先形成的三部分型复合物并且随着添加竞争性小分子浓度的增加，测量结合成员结合t-sm复合物的能力(例如通过均相时间分辨荧光(htfr)结合测定)。当使用htfr结合测定法测量时，如果竞争性小分子能够抑制结合成员与t-sm复合物的结合的至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，竞争性小分子可能能够展示来自t-sm复合物的小分子。在一些实施例中，竞争性小分子是阿舒瑞韦、维卢瑞韦、伐尼瑞韦、戈雷瑞韦、达诺瑞韦或格来瑞韦。在该方法中使用的结合成员、靶蛋白和小分子可以如本文关于本披露的其他方面进一步定义。
64.在特定实施例中，靶蛋白可以源自hcv ns3/4a蛋白酶并且t-sm复合物中的小分子可以是西米普韦，并且任选地，结合成员可以是prsim_23。例如，靶蛋白可以具有与seq id no：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。如本文所证明的，西米普韦以非常高的亲和力结合靶蛋白hcv ns3/4a蛋白酶(s139a)(seq id no：2)，使得结合靶蛋白的其他小分子不能从t-sm复合物中置换西米普韦。如本文进一步证明，有可能在hcv ns3/4a蛋白酶中引入突变，这些突变降低西米普韦对hcv ns3/4a蛋白酶的亲和力，并允许竞争性小分子破坏hcv ns3/4a蛋白酶、西米普韦和结合成员prsim_23之间形成的三部分型复合物
65.因此，在靶蛋白源自hcv ns3/4a蛋白酶且小分子是西普瑞韦的实施例中，靶蛋白可在选自位置151和183的一个或多个氨基酸处具有降低亲和力的氨基酸突变(例如取代)，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。在一些实施例中，位置151处的降低亲和力的氨基酸突变是突变为天冬氨酸、天冬酰胺或组氨酸，并且位置183处的降低亲和力的突变是突变为谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸。在一些实施例中，位置151处的降低亲和力的氨基酸突变是突变为天冬氨酸或天冬酰胺，并且位置183处的降低亲和力的突变是突变为谷氨酸。靶蛋白还可包含除了本文所述的另一氨基酸突变(例如，除了位置154的氨基酸突变，例如突变为丙氨酸)之外的降低亲和力的氨基酸突变。
66.本披露包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不容许或明确避免此类组合的情况外。
附图说明
67.现将参考附图来讨论说明本披露原理的实施例和实验，在附图中：
68.图1显示了示例性的基于prsim的二聚化化学诱导剂(cid)的三个组分的示意图。a代表靶蛋白(例如示例的hcv ns3/4a pr(s139a)突变体)，b表示小分子(例如例示的西米普韦)，c代表结合成员(例如对西米普韦和hcv ns3/4a pr(s139a)的复合物特异的scfv或
tn3)。
69.图2描绘了与hcv ns3/4a pr(pdb代码：3kee；)复合的西米普韦的三维结构并说明了hcv ns3/4a pr的浅结合位点和西米普韦的大表面暴露区域。
70.图3a显示了重组wt和s139a hcv ns3/4a pr的sds-page凝胶。s139a hcv ns3/4a pr在对应于全长ns3蛋白(seq id no：199)的氨基酸位置139的位置处包含丝氨酸到丙氨酸的突变。该丝氨酸到丙氨酸突变的位置对应于此处作为seq id no：1提供的hcv ns3/4a蛋白酶的位置154。
71.图3b说明了hcv ns3/4a pr的s139a突变体在肽切割测定中与其wt对应物相比的最小活性。
72.图3c显示等温量热数据，其表明西米普韦对hcv ns3/4a pr的wt和s139a版本具有等效的亲和力。
73.图4a显示了用于分离hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦选择性结合分子(prsim)的筛选策略。
74.图4b显示了三个不同文库的不同轮筛选的输出，如在西米普韦存在下elisa信号的倍数变化所代表，与在单独hcv ns3/4a pr(s139a)存在下获得的结合信号相比。
75.图5显示了用于测量prsim分子与单独的或与西米普韦复合物的hcv ns3/4a pr(s139a)的结合的均相时间分辨荧光(htrf)测定的示意图。
76.图6显示了用一组显示hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦选择性结合的prsim分子获得的htrf数据。靠上行存在西米普韦，靠下行不存在西米普韦。
77.图7a-b显示了biacore衍生的针对以下的亲和力数据：hcv ns3/4a pr(s139a)与图7a：prsim_57和图7b：prsim_23在西米普韦存在下结合(左)和在不存在西米普韦下没有显著结合(中)。存在西米普韦的bsa用作对照(右)。灰色曲线代表测量的数据点，黑色虚线代表用于分析的全局拟合线。
78.图7c显示西米普韦诱导hcv ns3/4a pr(s139a)/prsim_57(左；ec50＝4.57nm)或hcv ns3/4a pr(s139a)/prsim_23(右；ec50＝4.03nm)异二聚化的滴定曲线。
◇
＝40nm hcv ns3/4a pr(s139a)+0nm西米普韦。
79.图8显示了nanobit系统(普洛麦格公司(promega))的示意图(左)，该系统用于通过使lgbit和smbit结构域紧密接近来鉴定能够重建nanoluc功能的prsim分子。还描述了生成和测试的lgbit和smbit融合蛋白的不同方取向(右)。
80.图9显示了从nanobit筛选获得的数据，其中描绘了存在西米普韦时的发光信号相比于不存在西米普韦时的信号的倍数变化，并证明了几种prsim结合分子能够重建nanoluc活性。
81.图10描述了两个质粒的组分，这两个质粒用于瞬时转染以当组分部分与hcv ns3/4a pr(s139a)和不同的prsim分子融合时测量西米普韦重建分拆式转录因子和激活萤光素酶报告基因转录的能力。
82.图11a-b显示了从基于tn3的prsim分子(图11a)和基于scfv的prsim分子(图11b)的分拆式转录因子测定获得的剂量应答数据。几个被测试的prsim分子能够实现萤光素酶报告基因转录的剂量依赖性激活。
83.图12a显示了与雷帕霉素诱导型frb：fkbp12阳性对照相比，从prsim_23和prsim_
k136d pr(图23b)、hcv ns3/ns4a k136n pr(图23c)和hcv ns3/ns4a d168e pr(图23d)结合的octet衍生的亲和力数据。数据代表2-3个独立实验。
103.图24a显示了西米普韦诱导突变hcv ns3/4a pr/prsim_23结合分子异二聚化的滴定曲线；hcv ns3/4a pr
‘
wt’(s139a)(
●
)、hcv pr ns3/4a k136d(
■
)、hcv pr ns3/4a k136n(
▲
)和hcv pr ns3/4a d168e(
◇
)。
104.图24b-e显示了在西米普韦(西米普韦分别为20、800、40和20nm)存在下hcv ns3/4a pr
‘
wt’(s139a)(图24b)、hcv pr ns3/4a k136d(图24c)、hcv pr ns3/4a k136n(图24d)和hcv pr ns3/4a d168e(图24e)与prsim_23结合的biacore衍生的亲和力数据(左)，并且在西米普韦不存在下无显著结合(右)。灰色曲线代表测量的数据点，黑色虚线代表用于分析的全局拟合线。数据代表3个独立实验。
105.图25a比较了添加hcv ns3/4a pr的小分子抑制剂以在有和没有西米普韦/hcv ns3/4a pr预孵育的情况下抑制开关复合物的形成。
106.图25b hcv ns3/4a pr的小分子抑制剂可以通过与西米普韦竞争结合hcv ns3/4a pr变体(在位置168或136具有氨基酸突变)来破坏开关复合物。
107.图26a显示了与野生型相比从prsim_23 hcv ns3/4a pr突变体的分拆式转录因子测定获得的数据。
108.图26b描述了用于生成在prsim_23 hcv ns3/4 pr wt和通过crispr经由aavs1转基因敲入获得的突变体控制下表达gfp-pest的单克隆细胞系的载体。还描述了表达的蛋白和导致细胞激活的西米普韦添加的效果。
109.图26c显示了代表性直方图，其证明了在分拆式转录因子prsim_23 hcv ns3/4 pr wt和突变体的控制下表达gfp-pest的细胞系中通过流式细胞术测量的gfp荧光强度。用西米普韦诱导单克隆细胞系24小时。
110.图26d显示在分拆式转录因子prsim_23 hcv ns3/4a pr wt或突变体的控制下表达gfp-pest的细胞系中获得的gfp荧光数据。用西米普韦处理细胞以诱导表达。去除西米普韦并在去除后的不同时间点使用流式细胞术测定gfp荧光。
111.图27a显示了hcv ns3/4a(s193a)pr：prsim_57：西米普韦三元复合物的整体结构。上图像：hcv ns3/4a(s193a)pr(浅灰色)和prsim_57(深灰色)以表面表示形式显示，西米普韦分子以球棒形式(黑色)显示，夹在两种蛋白的交界面中。下图像：hcv ns3/4a(s193a)pr(浅灰色)和prsim_57(深灰色)以卡通形式显示。西米普韦以球棒形式(黑色)显示，2mfo-dfc电子密度轮廓在2σ。
112.图27b显示了hcv ns3/4a(s193a)pr、prsim_57和西米普韦之间的分子相互作用的细节。上分图：hcv ns3/4a(s193a)pr和prsim_57与西米普韦相互作用的细节。hcv ns3/4a(s193a)pr残基与西米普韦(球棒，黑色)相互作用是如先前测定的(pdb 3kee)，并以球棒形式显示侧链(碳-浅灰色，氧/氮-黑色)。prsim_57中的在西米普韦周围形成疏水腔的疏水残基(phe77、ile74、ile125和trp249)以球棒形式显示(碳-深灰色，氧/氮-黑色)。phe77的侧链和西美普韦喹啉之间发生直接相互作用。下分图：hcv ns3/4a(s193a)pr和如左分图中着色的prsim_57之间相互作用的细节。相互作用的残基以球棒形式显示。
113.图28a-c显示了杀伤开关(kill switch)的设计。图28a：半胱天冬酶9(casp9)通过其card二聚化结构域的同二聚化对于通过细胞凋亡诱导细胞死亡至关重要。图28b：用
prsim开关组分替换card结构域。图28c：添加西米普韦诱导prsim23-hcv pr异二聚体的形成，导致casp9活性结构域的二聚化并随后诱导细胞凋亡。
114.图29a-e显示添加西米普韦后杀伤开关的功能。图29a：用wt杀伤开关稳定转导的hek293细胞的相差图像显示在用西米普韦处理后细胞迅速死亡。图29b：用wt杀伤开关稳定转导的人肿瘤细胞系hct116和ht29的相差图像显示在用西米普韦处理后细胞迅速死亡。图29c：半胱天冬酶3测定的示意图。图29d：相对于经处理的未转导的hek293细胞，wt杀伤开关转导的hek293+/-10nm西米普韦中的半胱天冬酶3活性。图29e：在10nm西米普韦存在下，相对于未转导的hct116和ht29，杀伤开关转导的hct116和ht29的三个单细胞克隆中的半胱天冬酶3活性。****p＜0.0001；ns＝不显著。
115.图30显示了未转导的es细胞系sa121和用西米普韦诱导型wt杀伤开关转导的相同细胞系在添加浓度增加的西米普韦后随时间的汇合度。
116.图31a-c诱导多能干细胞(ipsc)中杀伤开关的b2m基因座靶向敲入促进了西美普韦诱导的细胞杀伤。图31a：杀伤开关的敲入策略示意图。杀伤开关(icasp9)被敲入ipsc的b2m基因座。腺相关病毒(aav)载体用于递送包含侧翼是b2m同源臂的icasp9表达盒的供体模板。浅色符号表示crispr靶向位点。lha，左同源臂；rha，右同源臂；efla promt，ef-1α启动子；p2a，猪捷申病毒-1衍生的2a自切割肽；puro，嘌呤霉素抗性基因；blast，杀稻瘟素抗性基因；bgh pa；牛生长激素聚腺苷酸化信号；primerf，用于基因分型的正向引物；primerr，用于基因分型的反向引物。图31b：含有杀伤开关的ipsc的单细胞克隆的基因分型。基因敲入后分离出五个单细胞ipsc克隆(1b7、1d6、1d12、1g8和2d8)。从这些克隆中提取基因组dna。a)中指示的引物用于扩增靶向的基因座。将扩增子加载入1.2％琼脂糖凝胶进行电泳。基因分型数据表明，单细胞克隆1b7、1d12、1g8和2d8具有双等位基因b2m靶向杀伤开关敲入，而克隆1d6具有单等位基因杀伤开关敲入。ipsc-wt，野生型(未修饰的)ipsc；ki，敲入等位基因的扩增子；wt，野生型等位基因的扩增子。图31c：通过xcelligence实时细胞分析(rtca)测定法量化的细胞增殖指数。ipsc单细胞克隆在西米普韦诱导前培养1天。在诱导前后监测细胞指数3天。
117.图32a-b显示了添加西米普韦后杀伤开关s196a突变体的功能。图32a：用杀伤开关s196a突变体稳定转导的hek293细胞的相差图像显示在用西米普韦处理后细胞迅速死亡。图32b：相对于经处理的未转导的hek293细胞，wt和s196a突变型杀伤开关转导的hek293+/-10nm西米普韦中的半胱天冬酶3活性。***p＜0.0005；ns＝不显著。
具体实施方式
118.现将参考附图来讨论本披露的各方面和实施例。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施例将是显而易见的。该文本中提及的所有文件均通过援引并入本文。
119.表达载体和表达盒
120.如本文所用，“表达载体”是用于在细胞中表达外源遗传物质的dna分子。可以使用本领域已知的任何合适的载体。合适的载体包括dna质粒、二元载体、病毒载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。在某些实施例中，表达载体是如下文更详细描述的病毒载体。在某些实施例中，表达载体是dna质粒。
121.如本文所用，“表达盒”是能够影响表达产物转录的多核苷酸序列，该表达产物可
以是蛋白。“编码序列”旨在表示编码表达产物的基因多核苷酸序列的一部分。当表达产物是蛋白时，该序列可称为“蛋白编码序列”。蛋白编码序列通常在5’端以起始密码子开始，在3’端以终止密码子结束。如下文更详细描述的，表达盒可以是表达载体的一部分，或病毒颗粒中病毒基因组的一部分。
122.通常，表达盒包含与蛋白编码序列可操作地连接的启动子。术语“可操作地连接”包括选择的编码序列和启动子以将蛋白编码序列的表达置于启动子的影响或控制之下的方式共价连接的情况。因此，如果启动子能够影响蛋白编码序列的转录，则启动子与蛋白编码序列可操作地连接。在适当的情况下，所得转录物随后可被翻译成期望的蛋白。
123.本领域已知的任何合适的启动子都可以用于表达盒中，只要它在所使用的细胞类型中起作用。例如，当细胞是哺乳动物细胞时，启动子可以是巨细胞病毒(cmv)启动子。在使用多个表达盒的情况下，每个编码序列可以独立地可操作地连接至其自身的启动子。可替代地，一个或多个表达盒的编码序列可以与相同的启动子可操作地连接。
124.在描述了多个表达盒，例如第一和第二表达盒的情况下，它们可以是同一表达载体或不同表达载体的一部分。因此，在一些实施例中，第一和第二表达盒可以位于同一表达载体上。在其他实施例中，第一表达盒位于第一表达载体上，并且第二表达盒位于第二表达载体上。
125.当多个表达盒位于同一表达载体上时，各个表达盒(例如第一和第二表达盒)可以由内部核糖体进入位点(ires)或2a元件隔开。ires或2a元件的使用允许使用相同的启动子表达多种表达产物。换言之，当第一和第二表达盒被ires或2a元件隔开时，第一和第二表达盒都与相同的启动子可操作地连接。
126.靶蛋白和小分子
127.本披露的方面和实施例涉及源自非人蛋白，即对于人而言非内源性的蛋白的靶蛋白。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒、细菌、真菌或原生动物蛋白。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白并且小分子是病毒蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自细菌蛋白并且小分子是细菌蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自真菌蛋白并且小分子是真菌蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自原生动物蛋白并且小分子是原生动物蛋白的抑制剂。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白酶并且小分子是该病毒蛋白酶的抑制剂。
128.靶蛋白上下文中的术语“源自”旨在表示靶蛋白与其来源的蛋白具有相似但不一定相同的氨基酸序列，并且靶蛋白仍然能够结合小分子。源自蛋白的靶蛋白与其来源的蛋白可具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。源自蛋白的靶蛋白与其来源的蛋白相比可含有少于50个、少于40个、少于30个、少于20个、少于10个、少于9个、少于8个、少于7个、少于6个、少于5个，少于4个、少于3个或少于2个序列改变。例如，具有seq id no：2中列出的氨基酸序列的靶蛋白源自具有seq id no：1中列出的序列的病毒蛋白酶。此外，靶蛋白的氨基酸数量可能比其来源的蛋白少(即它是一种较短的蛋白)。
129.病毒蛋白酶是由病毒病原体的遗传物质编码的酶。这些酶的正常功能是催化病毒多蛋白前体或细胞蛋白中特定肽键的裂解。病毒蛋白酶的示例包括由丙型肝炎病毒(hcv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、疱疹病毒、逆转录病毒和人鼻病毒(hrv)家族编码的那些。某些病毒
蛋白酶以及这些蛋白酶的小分子抑制剂的示例在例如patick和potts1998中描述。
130.小分子是一种有机化合物，其分子量通常为2000道尔顿或更小。小分子可以是合成的或天然存在的。
131.作为小分子的病毒蛋白酶抑制剂的选择不受特别限制，条件是它a)能够结合靶蛋白并且b)已经在人临床目的上进行了评估。已被评估用于人临床目的的病毒蛋白酶抑制剂包括那些已被监管机构批准用于人临床应用的病毒蛋白酶抑制剂，例如，被食品和药物管理局(fda)和/或欧洲药品管理局(ema)批准用于治疗的抑制剂。已被评估用于临床目的的病毒蛋白酶抑制剂还包括那些正在/已经在涉及人的临床试验中进行测试并且优选已经进行过i期临床试验的病毒蛋白酶抑制剂。优选地，病毒蛋白酶抑制剂被批准用于人临床应用。优选地，病毒蛋白酶抑制剂适用于长期给药(每天给药持续六个月或更长时间)，是细胞渗透性的，口服给药和/或不用作一线疗法。
132.所用的病毒蛋白酶可以是单体的或多聚体的(例如二聚体、三聚体、四聚体等)。单体病毒蛋白酶的使用可能是优选的，例如在靶蛋白融合蛋白和结合成员融合蛋白的严格1∶1比例引发所期望功能活性的情况下。可能存在首选多聚体病毒蛋白酶的替代情况，例如，当靶蛋白与分拆式转录因子中的转录调节结构域融合时，使用多聚体病毒蛋白酶可以增加募集到靶基因的转录调节结构域的数量。
133.在一些实施例中，病毒蛋白酶是hcv ns3/4a蛋白酶或hiv蛋白酶。已知这两种蛋白酶被几种经批准的小分子抑制剂靶向，这些小分子抑制剂已知在人中通常具有良好的耐受性并适合长期给药。de clercq.2014中描述了靶向hcv ns3/4a蛋白酶的小分子抑制剂的示例。lv等人2015描述了靶向hiv蛋白酶的小分子抑制剂的示例。
134.在一些实施例中，病毒蛋白酶是hcv ns3/4a蛋白酶。hcv ns3/4a pr是单体，大小相对较小(21kda)，可以在细胞质中表达，并且未发现与dna相关联，使其成为用于本披露的病毒蛋白酶的理想候选者。hcv ns3/4a蛋白酶可具有uniprot登录号a8dg50-1(序列的版本2；序列2008年4月29日更新)中列出的氨基酸序列的氨基酸位置1030-1206的氨基酸序列。在一些实施例中，hcv ns3/4a蛋白酶可具有在seq id no：1中列出的氨基酸序列。源自hcv ns3/4a蛋白酶的靶蛋白可具有与seq id no：1中列出的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。
135.已知有几种小分子抑制剂结合hcv ns3/4a蛋白酶并已获准用于人使用。其中一些列于下表中：
136.[0137][0138]
与相应小分子复合的靶蛋白的结构以pdb登录号提供，其对应于可从蛋白数据库(pdb)获得的晶体结构。小分子结构和化学名称也作为pdb登录号提供。
[0139]
小分子可以是肽模拟物。术语“肽的模拟物”、“肽模拟物”和“肽类似物”可互换使用，是指不由氨基酸构成但与完全由氨基酸构成的肽化合物具有基本相同特征的化合物。
[0140]
其他正在/已经在涉及人的临床试验中测试的小分子抑制剂包括法达瑞韦、索伐瑞韦、维卓瑞韦。
[0141]
在一些实施例中，小分子选自由以下组成的组：西米普韦、波普瑞韦、特拉瑞韦、阿舒瑞韦、伐尼瑞韦、沃昔瑞韦、格来瑞韦、维卢瑞韦、那拉瑞韦、达诺瑞韦、法达瑞韦、戈雷瑞韦、索伐瑞韦、维卓瑞韦其药理学上可接受的类似物或衍生物。所有这些小分子都已被批准用于人使用和/或已在涉及人的临床试验中进行测试。在一些实施例中，小分子选自由以下组成的组：西米普韦、波普瑞韦、特拉瑞韦、阿舒瑞韦、伐尼瑞韦、沃昔瑞韦、格来瑞韦、维卢瑞韦、戈雷瑞韦、达诺瑞韦和那拉瑞韦，或其药理学上可接受的类似物或衍生物。这些小分子已被批准用于人使用。
[0142]
在特定实施例中，小分子选自由以下组成的组：西米普韦、波普瑞韦和特拉瑞韦，或其药理学上可接受的类似物或衍生物。这些小分子(西米普韦、波普瑞韦和特拉瑞韦)在人中具有良好的耐受性，并已被批准用于人长期使用。在特定实施例中，小分子可以是西米普韦或其药理学上可接受的类似物或衍生物。西米普韦是一种口服小分子，其具有细胞渗透性，并且具有支持每日一次给药的药代动力学(pk)谱。它已与利巴韦林和聚乙二醇化干扰素联合长期(长达39个月)使用用于治疗hcv感染，并被列入who基本药物清单，表明它是一种耐受性良好且广泛使用的药物。
[0143]
小分子的药理学上可接受的类似物和衍生物包括与“母体”小分子不同但与母体小分子具有相似抗病毒活性的化合物，并且包括互变异构体、区域异构体、几何异构体以及适用的立体异构体，包括旋光异构体(对映异构体)及其其他立体异构体(非对映异构体)，以及在上下文中适用的情况下其药学上可接受的盐和衍生物(包括前药形式)。例如，西米普韦的类似物包括wo 2007014926a1中定义的式(i)所涵盖的那些化合物。
[0144]
西米普韦可具有以下化学结构：
[0145][0146]
在一些实施例中，病毒蛋白酶是hiv蛋白酶。hiv蛋白酶以22kda同二聚体存在，其中每个亚基由99个氨基酸构成。hiv蛋白酶可具有uniprot登录号p03366-1(序列的版本3；序列2007年1月23日更新)中列出的氨基酸序列的氨基酸位置501-599的氨基酸序列。源自hiv蛋白酶的靶蛋白可具有与uniprot登录号p03366-1中列出的氨基酸序列的氨基酸位置501-599的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。源自hiv蛋白酶的靶蛋白可以是单体蛋白。例如，靶蛋白可包含一个或多个氨基酸突变，其降低形成同二聚体蛋白的可能性。
[0147]
已知有几种小分子抑制剂结合hiv蛋白酶并已获准用于人使用。其中一些列于下表中：
[0148][0149]
磷安普那韦是安普那韦的前药形式，比安普那韦具有更好的溶解性和生物利用度。
[0150]
在一些实施例中，小分子选自由以下组成的组：阿他那韦、达卢那韦和磷安普那韦、安普那韦、茚地那韦、洛匹那韦/利托那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦和替普那韦，或其药理学上可接受的类似物或衍生物。
[0151]
在特定实施例中，小分子选自由以下组成的组：阿扎那韦、地瑞纳韦和磷安普那韦，或其药理学上可接受的类似物或衍生物。这些小分子在人体中具有良好的耐受性并具有良好的生物利用度。此外，hiv蛋白酶抑制剂通常在患者中长期使用，并且预计这些小分子抑制剂可以对于长期使用是耐受的。
[0152]
在一些实施例中，靶蛋白与其来源的病毒蛋白酶相比具有减弱的病毒活性。在这种情况下，病毒活性减弱是指靶蛋白具有较低的酶活性，例如蛋白酶活性低于其来源的病毒蛋白酶。例如，可以使用如实例中所述或sabariegos等人2009所述的荧光肽切割测定来测试酶活性。简而言之，荧光肽切割测定涉及使用含有供体-猝灭剂对的荧光蛋白酶fret底物孵育靶蛋白/病毒蛋白酶，从而使肽的切割将供体与猝灭剂分开，发射可在特定波长例如490nm下检测到的能量。
[0153]
在一些实施例中，如果在酶活性测定中，例如荧光肽切割测定中测量的靶蛋白的活性低于病毒蛋白酶活性的10％，则认为靶蛋白与其来源的病毒蛋白酶相比具有减弱的病毒活性。在一些实施例中，当在酶活性测定中，例如荧光肽切割测定中测量时靶蛋白的浓度小于1nm、小于10nm、小于100nm，或小于1μm的情况下，靶蛋白未显示任何可检测的病毒活性。
[0154]
与其来源的病毒蛋白酶相比(例如与seq id no：1相比)，靶蛋白可以包含一个或多个氨基酸突变(例如取代/插入/缺失)。包含一个或多个氨基酸突变的靶蛋白应保留其与小分子和结合成员形成三部分型复合物的能力，这可以例如使用如实例中所述的均相时间分辨荧光(htrf)测定来确定。
[0155]
在一些实施例中，与其来源的病毒蛋白酶相比，靶蛋白包含一个或多个氨基酸突变，其中该一个或多个氨基酸突变减弱了靶蛋白的病毒活性。一个或多个氨基酸突变可以在病毒蛋白酶的活性位点中。
[0156]
例如，hcv ns3/4a蛋白酶含有催化三联体，其涉及hcv ns3/4a蛋白酶的氨基酸残基h57、d81和s139。见，例如grakoui等人1993；eckart等人1993；和bartenschlager等人1993。这些氨基酸残基对应于seq id no：1的氨基酸序列的位置h72、d96和s154。因此，靶蛋白可在选自hcv ns3/4a蛋白酶的位置72、96和154的一个或多个氨基酸处包含氨基酸突变，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。hcv ns3/4a蛋白酶的已知参与病毒活性的其他残基包括hcv ns3/4a蛋白酶的c97、c99、c145和h149(对应于seq id no：1的位置c112、c114、c160和h164)。见，例如hikikata等人1993；和stempniak等人1997。在一些实施例中，靶蛋白在选自hcv ns3/4a蛋白酶的位置72、96、112、114、154、160和164的一个或多个氨基酸处含有氨基酸突变(例如取代)，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。
[0157]
在特定实施例中，靶蛋白在hcv ns3/4a蛋白酶的位置154处包含氨基酸突变，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号，例如突变为丙氨酸。在某些实施例中，靶蛋白具有seq id no：2的氨基酸序列。
[0158]
ns3蛋白的全长序列在seq id no：199中提供。此处描述的在seq id no：1的位置154处的氨基酸突变对应于seq id no：199的位置139。
[0159]
根据全长ns3蛋白(seq id no：199)及其在seq id no：1中列出的ns3/4a蛋白酶氨基酸序列中的相应位置编号的上述潜在氨基酸突变的鉴定表列如下示出：
[0160][0161]
作为进一步的示例，hiv蛋白酶包含涉及氨基酸残基d25、t26和g27的催化三联体，其中氨基酸编号是根据具有uniprot登录号p03366-1(序列的版本3；序列2007年1月23日更新)中列出氨基酸序列的氨基酸位置501-599的氨基酸序列的hiv蛋白酶。因此，靶蛋白可以在选自hiv蛋白酶的位置25、26和27的一个或多个氨基酸处包含氨基酸突变，其中氨基酸编号是根据具有uniprot登录号p03366-1(序列的版本3；序列2007年1月23日更新)中列出氨基酸序列的氨基酸位置501-599的氨基酸序列的hiv蛋白酶。
[0162]
靶蛋白和小分子相互作用以在靶蛋白和小分子之间形成复合物，本文称为t-sm复合物。相互作用可以是共价相互作用或非共价相互作用。在一些实施例中，例如使用表面等离子体共振或生物层干涉法进行测量时，小分子以低于1mm、优选低于500nm、更优选低于200nm、甚至更优选低于100nm或再更优选低于50nm的kd结合靶蛋白。在一些实施例中，例如使用表面等离子体共振或生物层干涉法进行测量时，小分子以25nm和200nm之间、25nm和100nm之间、或25nm和75nm之间的kd结合靶蛋白。
[0163]
可能期望在靶蛋白中引入氨基酸突变(例如取代)以降低小分子对靶蛋白的亲和力并允许第二小分子置换t-sm复合物中的小分子。例如，如本文所证明的，西米普韦以非常高的亲和力结合靶蛋白hcv ns3/4a蛋白酶(s139a)(seq id no：2)，使得结合靶蛋白的其他小分子不能从t-sm复合物中置换西米普韦。通过在靶蛋白中引入一个或多个氨基酸修饰来降低西米普韦对hcv ns3/4a蛋白酶的结合亲和力，这允许使用不同的hcv ns3/4a蛋白酶小分子抑制剂来破坏hcv ns3/4a蛋白酶(s139a)、西米普韦和prsim_23之间形成的三部分型复合物。因此，在一些实施例中，与其源自的病毒蛋白酶(例如，seq id no：1)相比，靶蛋白包含一个或多个降低亲和力的氨基酸突变(例如取代)，使得小分子与靶分子结合的亲和力低于小分子与亲本靶蛋白结合的亲和力。在这种情况下，“亲本靶蛋白”缺乏一个或多个降低亲和力的氨基酸突变，但在其他方面与靶蛋白相同。亲本靶蛋白可以是靶蛋白所源自的病毒蛋白酶(例如亲本靶蛋白可以具有seq id no：1中列出的氨基酸序列)，或者亲本靶蛋白本身可以源自病毒蛋白酶(例如亲本靶蛋白可以具有在seq id no：2中列出的氨基酸序列)。
[0164]
一个或多个降低亲和力的氨基酸突变可以导致小分子与靶蛋白结合的亲和力比小分子与亲本靶蛋白结合的亲和力低至少1.5倍。一个或多个降低亲和力的氨基酸突变可以导致小分子与靶蛋白结合的亲和力比小分子与亲本靶蛋白结合的亲和力低1.5倍至10倍，或者比小分子与亲本靶蛋白结合的亲和力低1.5倍至5倍。一个或多个降低亲和力的氨基酸突变可以导致小分子以25nm至200nm、25nm至100nm、或25nm至75nm的kd结合靶蛋白，任
选地其中亲和力是使用生物层干涉法，例如使用octet red384测量的。
[0165]
如本文所证明的，发现hcv ns3/4a蛋白酶的位置151和183处的氨基酸取代(其中编号的对应于seq id no：1进行氨基酸编号)降低了西米普韦对hcv ns3/4a蛋白酶的亲和力并允许第二小分子破坏hcv ns3/4a蛋白酶、西米普韦和结合成员prsim_23之间形成的三部分型复合物。此外，还证明了包含这些降低亲和力的突变的靶蛋白在二聚化诱导型蛋白中例如在分拆式转录因子中保留了功能。seq id no：1的氨基酸位置151和183分别对应于seq id no：99中列出的全长ns3蛋白的氨基酸位置136和168。
[0166]
因此，在靶蛋白源自病毒蛋白酶即hcv ns3/4a蛋白酶的一些实施例中，靶蛋白可在选自位置151和183的一个或多个氨基酸处具有降低亲和力的氨基酸突变(例如取代)，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。在一些实施例中，位置151处的降低亲和力的氨基酸突变是突变为天冬氨酸、天冬酰胺或组氨酸，并且位置183处的降低亲和力的突变是突变为谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸。在一些实施例中，位置151处的降低亲和力的氨基酸突变是突变为天冬氨酸或天冬酰胺，并且位置183处的降低亲和力的突变是突变为谷氨酸。靶蛋白还可包含除了本文所述的另一氨基酸突变(例如，除了位置154的氨基酸突变，例如突变为丙氨酸)之外的降低亲和力的氨基酸突变。
[0167]
在某些实施例中，靶蛋白具有与seq id no：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列并且包含位置154处的丙氨酸和位置151处的天冬氨酸、天冬酰胺或组氨酸(例如天冬氨酸或天冬酰胺)，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。在某些实施例中，靶蛋白源自具有seq id no：1中列出的氨基酸序列的病毒蛋白酶，其中靶蛋白与病毒蛋白酶的不同之处在于它在位置154包含丙氨酸和在位置151包含天冬氨酸、天冬酰胺或组氨酸(例如天冬氨酸或天冬酰胺)，和任选的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个另外的序列改变(例如功能性保守取代)，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。在某些实施例中，靶蛋白包含与seq id no：211和215中列出的任一序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0168]
在某些实施例中，靶蛋白具有与seq id no：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列并且包含位置154处的丙氨酸和位置183处的谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸(例如谷氨酸)，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。在某些实施例中，靶蛋白源自具有seq id no：1中列出的氨基酸序列的病毒蛋白酶，其中靶蛋白与病毒蛋白酶的不同之处在于它在位置154包含丙氨酸和在位置151包含天冬氨酸、天冬酰胺或组氨酸(例如天冬氨酸)，和任选的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个另外的序列改变(例如功能性保守取代)，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。在某些实施例中，靶蛋白包含与seq id no：213中列出的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0169]
结合成员
[0170]
如本文所用，“结合成员”是指与t-sm复合物特异性结合的多肽或蛋白。术语“特异性”可指结合成员不会表现出与t-sm复合物以外的分子的任何显著结合的情况。此类分子被称为“非靶分子”并且包括单独的靶蛋白和单独的小分子，即当不是t-sm复合物的一部分
时的靶蛋白或小分子。
[0171]
在一些实施例中，如果与非靶分子的结合程度小于结合成员与t-sm的结合的约10％，如例如通过等温量热法、elisa、表面等离子体共振(spr)、生物层干涉法(bli)、均相时间分辨荧光(htrf)、微量热泳(mst)或通过放射免疫测定(ria)所测量，则认为结合成员未表现出与非靶分子的任何显著结合。在一些实施例中，与非靶分子的结合程度小于结合成员与t-sm结合的约5％或约1％。用于确定涉及spr(biacore)和htrf的结合程度的方法在实例中有所描述。在通过htfr测量结合程度的一些实施例中，本文所述的结合成员以比对另一种非靶分子(例如，单独的靶蛋白或单独的小分子)的亲和力大至少2倍的亲和力与t-sm复合物结合。在一些实施例中，结合成员以比对另一种非靶分子的亲和力大至少3倍、5倍、10倍、20倍之一的亲和力与其靶分子结合。可替代地，在本文所述的结合成员以比对另一种非靶分子(例如，单独的靶蛋白或单独的小分子)的亲和力大至少10倍的亲和力与t-sm复合物结合的情况下，结合特异性可以根据结合亲和力来反映。结合亲和力可以通过表面等离子共振例如biacore测量。在一些实施例中，结合成员以比对另一种非靶分子的亲和力大至少50倍、100倍、1000倍、10000倍之一的亲和力与其靶分子结合。
[0172]
结合亲和力通常通过kd(结合成员与其靶标之间的平衡解离常数)来测量。众所周知，kd值越低，结合成员的结合亲和力就越高。例如，以1nm的kd与t-sm复合物结合的结合成员将被视为以大于以100nm的kd结合非靶分子的结合成员的亲和力结合t-sm复合物。
[0173]
结合成员可以以具有等于或低于50nm、25nm、20nm、15nm或10nm的kd的亲和力结合t-sm复合物。结合成员可以以具有等于或高于500nm、1μm、10μm、100μm或1mm的kd的亲和力结合单独的靶蛋白或单独的小分子。结合亲和力可以通过spr例如通过biacore测量。当通过spr测量时，结合成员可以显示与单独的靶蛋白和/或单独的小分子的结合最小或不结合。
[0174]
在一些实施例中，结合成员在仅存在于t-sm复合物上而不存在于单独的靶蛋白或单独的小分子上的表位处特异性结合t-sm复合物。例如，结合成员可以结合t-sm复合物的包含小分子的至少一部分和靶蛋白的一部分的位点。可替代地，t-sm复合物的形成可以诱导靶蛋白的构象变化，从而导致新表位的形成，该新表位被结合成员特异性结合。确定结合成员是否与特定表位结合的方法包括x射线晶体学、肽扫描、定点诱变作图和质谱法。
[0175]
在t-sm复合物包含源自hcv ns3/4a蛋白酶(例如seq id no：2)的靶蛋白和小分子西米普韦的实施例中，结合成员可以通过与靶蛋白的以下残基中的至少一个形成相互作用来特异性结合t-sm：tyr71、gly75、thr76、val93、asp94，其中对应于seq id no：1进行氨基酸编号。结合成员可以与这些残基中的1、2、3、4个或最优选地所有5个形成相互作用。结合成员还可以通过与西米普韦的喹啉部分形成相互作用来特异性结合t-sm复合物。这些相互作用中的至少一些可以是疏水相互作用和/或水介导的相互作用。相互作用可以使用x射线晶体学来确定，例如如实例中所述。
[0176]
结合成员可以是抗体分子，例如单链可变片段，或抗体模拟物，例如tn3蛋白。
[0177]
抗体分子
[0178]
本披露的方面和实施例涉及为作为抗体分子，例如单链可变片段(scfv)的结合成员。
[0179]
术语“抗体分子”描述了无论是天然的或部分或全部合成产生的免疫球蛋白。抗体
分子可以是人的或人源化的。抗体分子可以是单克隆抗体分子。抗体的示例是免疫球蛋白同种型，例如免疫球蛋白g(igg)，和它们的同种型亚类，例如igg1、igg2、igg3和igg4，以及其片段。
[0180]
抗体分子通常包含六个互补决定区(cdr)；三个在可变重(vh)区：hcdr1、hcdr2和hcdr3，以及三个在可变轻(vl)区：lcdr1、lcdr2和lcdr3。六个cdr共同定义了抗体分子的互补位，互补位是抗体分子中与t-sm复合物结合的部分。vh区和vl区包含每个cdr任一例的框架区(fr)，其为cdr提供支架。从n末端到c末端，vh区包含以下结构：n末端-[hfr1]-[hcdr1]-[hfr2]-[hcdr2]-[hfr3]-[hcdr3]-[hfr4]-c末端；vl区包含以下结构：n末端-[lfrl]-[lcdrl]-[lfr2]-[lcdr2]-[lfr3]-[lcdr3]-[lfr4]-c末端。
[0181]
有几种不同的定义抗体cdr和fr的惯例，例如以下中所描述的那些：kabat等人，sequences of proteins of immunological interest[免疫学上感兴趣的蛋白序列]，第5版public health service[公共卫生服务]，national institutes of health[美国国家卫生研究院]，马里兰州贝塞斯达(1991)，chothia等人，j.mol.biol.[分子生物学杂志]196：901-917(1987)，lefranc等人，nucleic acids res.[核酸研究](2015)43(数据库册)：d413-22描述的imgt编号，和retter等人，nucl.acids res.[核酸研究](2005)33(增刊1)：d671-d674描述的vbase2。本文描述的抗体分子的vh区和vl区的cdr和fr根据kabat(kabat，e.a等人(1991))定义。
[0182]
如本文所用，术语“抗体分子”包括抗体片段，条件是它们显示与一种或多种相关靶分子的结合。抗体片段的实例包括fv、scfv、fab、scfab、f(ab’)2、fab2、双抗体、三抗体、scfv-fc、微型抗体和单结构域抗体(例如vhh)等)。除非上下文另有要求，本文所用的术语“抗体分子”因此等同于“抗体分子或其抗原结合片段”。在具体的示例性实施例中，抗体分子是单链可变片段(scfv)。
[0183]
抗体分子及其构建和使用方法是本领域熟知的，并且在例如holliger&hudson，nature biotechnology[自然生物技术]23(9)：1126-1136(2005)中描述。可以采用单克隆和其他抗体分子并使用重组dna技术来产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可以涉及将一种抗体分子的cdr或可变区引入不同的抗体分子中(ep-a-184187、gb 2188638a和ep-a-239400)。
[0184]
鉴于当今与单克隆抗体技术相关的技术，可以制备针对大多数抗原的抗体分子。抗原结合结构域可以是抗体(例如fab片段)或合成的抗体片段(例如scfv)的一部分。可通过已知技术制备针对所选抗原的合适单克隆抗体，例如在“monoclonal antibodies：a manual of techniques[单克隆抗体：技术手册]”，h zola(crc出版社，1988)和在“monoclonal hybridoma antibodies：techniques and applications[单克隆杂交瘤抗体：技术和应用]”，j g r hurrell(crc出版社，1982)中披露的那些技术。neuberger等人(1988，8th international biotechnology symposium part 2[第八届国际生物技术研讨会第二部分]，792-799)讨论了嵌合抗体。
[0185]
prsim_57、prsim_01、prsim_04、prsim_67、prsim_72和prsim_75的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3、可变重(vh)链、可变轻(vl)链和scfv氨基酸序列的序列标识符(seq id no)如下表中列出的：
[0186][0187]
在一些实施例中，抗体分子包含以下项的重链互补决定区(hcdr)1至3和/或轻链互补决定区(lcdr)：
[0188]
i)prsim_57，分别在seq id no：151、152、153、154、155和156中列出；
[0189]
ii)prsim_01，分别在seq id no 151、152、198、154、155和156中列出；
[0190]
iii)prsim_04，分别在seq id no：151、152、163、154、155和164中列出；
[0191]
iv)prsim_67，分别在seq id no：165、166、167、168、169和170中列出；
[0192]
v)prsim_72，分别在seq id no：171、172、173、174、175和176中列出；或者
[0193]
vi)prsim_75，分别在seq id no：177、178、179、180、181和182中列出，
[0194]
其中cdr序列根据kabat编号方案定义。
[0195]
在一些实施例中，结合成员在上文定义的任何一个或多个cdr中包含许多序列改变，例如一个、两个、三个、四个或五个序列改变。
[0196]
在一些实施例中，抗体分子包含以下项的可变重(vh)链和/或可变轻(vl)链：
[0197]
i)prsim_57，分别在seq id no：186和187中列出；
[0198]
ii)prsim_01，分别在seq id no 188和189中列出；
[0199]
iii)prsim_04，分别在seq id no：190和191中列出；
[0200]
iv)prsim_67，分别在seq id no：192和193中列出；
[0201]
v)prsim_72，分别在seq id no：194和195中列出；或者
[0202]
vi)prsim_75，分别在seq id no：196和197中列出。
[0203]
在特定实施例中，抗体分子是单链可变片段(scfv)。通常，scfv包含由肽接头分隔的vh链和vl链。肽接头可以如本文所定义。在一些实施例中，分隔vh和vl链的肽接头可包含氨基酸序列seq id no：204。
[0204]
在一些实施例中，scfv包含与以下的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：
[0205]
i)seq id no：12中列出的prsim_57；
[0206]
ii)seq id no：10中列出的prsim_01；
[0207]
iii)seq id no：11中列出的prsim_04；
[0208]
iv)seq id no：13中列出的prsim_67；
[0209]
v)seq id no：14中列出的prsim_72；或者
[0210]
vi)seq id no：15中列出的prsim_75。
[0211]
在特定实施例中，scfv包含以下的氨基酸序列：
[0212]
i)seq id no：12中列出的prsim_57；
[0213]
ii)seq id no：10中列出的prsim_01；
[0214]
iii)seq id no：11中列出的prsim_04；
[0215]
iv)seq id no：13中列出的prsim_67；
[0216]
v)seq id no：14中列出的prsim_72；或者
[0217]
vi)seq id no：15中列出的prsim_75。
[0218]
抗体模拟物
[0219]
结合成员可以是抗体模拟物。抗体模拟物是能够特异性结合抗原但在结构上与抗体分子不同的有机化合物。抗体模拟物的示例包括支架蛋白，例如tn3蛋白、亲和体(affibodies)、亲和素(affilins)、亲和聚体(affimers)、亲和丁(affitins)、阿尔法体(alphabodies)、抗运载蛋白(anticalins)、亲和多聚体(avimers)、darpins、flynomers、kunitz结构域肽、单体和纳米钳(nanoclamps)。
[0220]
在特定方面和实施例中，结合成员是tn3蛋白。
[0221]
tn3蛋白基于iii型纤连蛋白模块(fniii)的结构并且源自人生腱蛋白c的第三个fniii结构域。tn3蛋白的产生和使用在例如wo 2009/058379、wo 2011/130324、wo 2011130328和gilbreth等人2014中描述。
[0222]
tn3蛋白和来自肌腱蛋白c的天然fniii结构域由相同的三维结构表征，即由六个环区连接的在一例具有三条β链(a、b和e)并且在另一例具有四条β链(c、d、f和g)的β夹心结构。根据连接至每个环的n末端和c末端的β链来指定这些环区。因此，ab环位于β链a和b之间，bc环位于链b和c之间，cd环位于β链c和d之间，de环位于β链d和e之间，ef环位于β链e和f之间，并且fg环位于β链f和g之间。fniii结构域具有耐受随机化的溶剂暴露环，这些环协助能够以高亲和力与特定靶标结合的蛋白支架的不同池的产生。
[0223]
野生型tn3蛋白可包含序列seq id no：134。在野生型tn3蛋白中，bc、de和fg环位于位置23至31、51至56和75至80，其中对应于seq id no：134进行氨基酸编号。tn3蛋白可以含有一个、优选两个、更优选三个、甚至更优选四个选自由i32f、d49k、e86i和t89k组成的列表的稳定突变，其中对应于seq id no：134进行氨基酸编号。野生型tn3蛋白的包含所有四个稳定突变的氨基酸序列在seq id no：135中列出。tn3蛋白可以另外包含一个或多个在gilbreth等人2014(特别是参见gilbreth等人2014的表1)中描述的稳定突变。
[0224]
使tn3蛋白经受被设计成随机化与抗体可变区的互补决定区(cdr)类似的一个或多个环的定向进化。这样一种定向进化途径导致对感兴趣的靶标(例如本文所述的t-sm复合物)具有高亲和力的抗体样结合成员的产生。
[0225]
因此，与本文所述的t-sm复合物特异性结合的tn3蛋白可包含prsim_23、prsim_32、prsim_33、prsim_36或prsim_47的bc、de和fg环。例如，tn3蛋白可以包含seq id no：134
或seq id no：135的序列，其中分别位于位置23至31、51至56和75至80处的bc、de和fg环取代了prsim_23、prsim_32、prsim_33、prsim_36或prsim_47的bc、de和fg环，其中对应于seq id no：134进行氨基酸编号。
[0226]
本领域技术人员将能够容易地确定本文描述的prsim克隆的bc、de和fg环的氨基酸序列。例如，可以将prsim克隆的氨基酸序列与野生型tn3蛋白的氨基酸序列进行比较，例如seq id no：134或135中列出的那些氨基酸序列。
[0227]
prsim_23、prsim_32、prsim_33、prsim_36或prsim_47的tn3序列、氨基酸位置和bc、de和fg环的序列如下表中列出的：
[0228][0229]
在一些实施例中，tn3蛋白包含以下项的bc、de和fg环：
[0230]
i)prsim_23，分别在seq id no：136、137和138中列出；
[0231]
ii)prsim_32，分别在seq id no：139、140和141中列出；
[0232]
iii)prsim_33，分别在seq id no：142、143和144中列出；
[0233]
iv)prsim_36，分别在seq id no：145、146和147中列出；或者
[0234]
v)prsim_47，分别在seq id no：148、149和150中列出，
[0235]
在一些实施例中，tn3蛋白包含以下项的bc、de和fg环：
[0236]
i)prsim_23，其中bc环包含seq id no：5的位置23至32的氨基酸；de环包含seq id no：5的位置52至57的氨基酸；并且fg环包含seq id no：5的位置76至85的氨基酸；
[0237]
ii)prsim_32，其中bc环包含seq id no：6的位置23至34的氨基酸；de环包含在seq id no：6的位置54至59的氨基酸；并且fg环包含seq id no：6的位置78至87的氨基酸；
[0238]
iii)prsim_33，其中bc环包含seq id no：7的位置23至34的氨基酸；de环包含在seq id no：7的位置54至59的氨基酸；并且fg环包含seq id no：7的位置78至87的氨基酸；
[0239]
iv)prsim_36，其中bc环包含seq id no：8的位置23至34的氨基酸；de环包含在seq id no：8的位置54至59的氨基酸；并且fg环包含seq id no：8的位置78至87的氨基酸；或者
[0240]
v)prsim_47，其中bc环包含seq id no：9的位置23至31的氨基酸；de环包含在seq id no：9的位置51至56的氨基酸；并且fg环包含seq id no：9的位置75至84的氨基酸。
[0241]
在一些实施例中，tn3蛋白在上文定义的bc、de和ef环中的任何一个或多个中包含许多序列改变，例如一个、两个、三个、四个或五个序列改变。在一些实施例中，tn3蛋白在上文定义的bc、de和ef环之外包含许多序列改变，例如一、二、三、四或五个序列改变。
[0242]
在一些实施例中，tn3蛋白包含与以下的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：
[0243]
i)seq id no：5中列出的prsim_23；
[0244]
ii)seq id no：6中列出的prsim_32；
[0245]
iii)seq id no：7中列出的prsim_33；
[0246]
iv)seq id no：8中列出的prsim_36；或者
[0247]
v)seq id no：9中列出的prsim_47。
[0248]
在特定实施例中，tn3蛋白包含以下的氨基酸序列：
[0249]
i)seq id no：5中列出的prsim_23；
[0250]
ii)seq id no：6中列出的prsim_32；
[0251]
iii) seq id no：7中列出的prsim_33；
[0252]
iv)seq id no：8中列出的prsim_36；或者
[0253]
v)seq id no：9中列出的prsim_47。
[0254]
二聚化诱导型蛋白
[0255]
在一些实施例中，靶蛋白与第一组分多肽融合并且结合成员与第二组分多肽融合。在特定实施例中，第一和第二组分多肽形成二聚化诱导型蛋白的一部分。
[0256]
如本文所用，“二聚化诱导型蛋白”是指包含第一和第二组分多肽的蛋白或复合物，其中第一和第二多肽在二聚化后形成功能性蛋白。术语“二聚化诱导型蛋白”包括“分拆式蛋白”、“二聚化缺陷型蛋白”和“分拆式复合物”。术语“组分多肽”旨在包括单链和多链多肽。二聚化诱导型蛋白中的第一和第二组分多肽在分离时通常不具有活性或活性较低，但在二聚化后紧密接近并因此变得有活性或具有增加的活性。如实例中所述，本文所述的特定结合成员、靶蛋白和小分子的组合能够调节二聚化诱导型蛋白的二聚化，从而与单独的二聚化诱导型蛋白的分开的组分相比，当结合成员与t-sm复合物结合时，观察到活性显著增加。
[0257]
二聚化诱导型蛋白的实例包括分拆式嵌合抗原受体(分拆式car；例如，如wu等人2015中所述)、分拆式激酶(例如，如camacho-soto等人2014中所述)、分拆式转录因子(例如，如taylor等人2010中所述)、分拆式凋亡蛋白(例如chelur等人2007中描述的分拆式半胱天冬酶)、分拆式报告子系统(例如，如dixon等人2016中所述)。
[0258]
当结合成员与t-sm复合物结合时，二聚化诱导型蛋白将具有增加的活性。增加的活性可以与当结合成员未与t-sm复合物结合时(例如因为不存在一种或多种靶蛋白、小分子或结合成员)时观察到的活性进行比较。在一些实施例中，与结合成员未与t-sm复合物结合时观察到的活性相比，当结合成员与t-sm复合物结合时观察到的活性增加至少1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、105倍、110倍、115倍或120倍。
[0259]
测量二聚化诱导型蛋白活性的方法将取决于所研究的特定二聚化诱导型蛋白。当第一和第二组分多肽在二聚化后形成嵌合抗原受体(car)时，car活性可以通过测量免疫细
胞激活和/或增殖来确定。如实例中所述，car活性可以通过在抗原刺激car后的白介素-2(il-2)产生来测量，例如通过elisa测量。当第一和第二组分多肽在二聚化后形成激酶时，激酶的活性可以如camacho-soto等人2014所述将磷酸盐(例如放射性
32
p)掺入肽底物中来测量。当第一和第二组分多肽在二聚化后形成转录因子时，转录活性可以通过测量下游期望的表达盒的表达来确定，该表达盒由如实例中所述的分拆式转录因子调控。当第一和第二组分多肽在二聚化后形成治疗性蛋白时，活性可以通过使用合适的测定法测定蛋白的功能活性来测量。当第一和第二组分多肽在二聚化后形成半胱天冬酶时，半胱天冬酶活性可以使用半胱天冬酶活性测定或通过测量细胞凋亡细胞死亡来测量。当第一和第二组分多肽在二聚化后形成报告子系统时，报告子活性可以通过测量报告子例如萤光素酶的表达来确定。
[0260]
第一组分多肽可以融合至靶蛋白或结合成员的c末端或n末端。第二组分多肽可以融合至靶蛋白或结合成员的c末端或n末端。组分多肽可以通过肽接头与靶蛋白或结合成员融合。合适的肽接头包括由[g]n、[s]n、[a]n、[gs]n、[ggs]n、[gggs]n(seq id no.：239)、[ggggs)n(seq id no.：240)、[ggsg]n(seq id no.：241)、[gsgg]n(seq id no.：242)、[sggg]n(seq id no.：243)、[ssgg]n(seq id no.：244)、[sssg]n(seq id no.：245)、[gg]n、[ggg]n、[sa]n、[tggggsggggs]n(seq id no.：185)及其组合代表的那些，其中n是1到30之间的整数。例如，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或高达30的任何数字。组分多肽可以直接融合至靶蛋白或结合成员，例如以以下形式：第一组分多肽-肽接头-靶蛋白。可替代地，组分多肽可以用将第一组分多肽与靶蛋白或结合成员分隔的一个或多个另外的多肽间接融合至靶蛋白或结合成员，例如以以下形式：第一组分多肽-另外的多肽-肽接头-靶蛋白。
[0261]
在一些实施例中，第一组分多肽与多于一个靶蛋白或结合成员融合。在一些实施例中，第二组分多肽与多于一个靶蛋白或结合成员或两者的组合融合。例如，第一或第二组分多肽可以与1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个结合成员融合。在一些实施例中，第一或第二组分多肽与2至10个或2至5个结合成员融合。在特定实施例中，第一或第二组分多肽与3个结合成员融合。例如，第一或第二组分多肽可以与1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶蛋白融合。在一些实施例中，第一或第二组分多肽与2至10个或2至5个靶蛋白融合。在特定实施例中，第一或第二组分多肽与3个靶蛋白融合。当存在多个结合成员或靶蛋白时，它们可以通过肽接头彼此融合，例如上面描述的那些肽接头。
[0262]
分拆式转录因子
[0263]
二聚化诱导型蛋白可以是分拆式转录因子。在一些实施例中，第一组分多肽包含dna结合结构域；并且第二组分多肽包含转录调节结构域，并且其中第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成转录因子。“形成转录因子”是指使第一和第二组分多肽足够接近以致它们能够重建期望的表达产物的转录调节活性。当结合成员与t-sm复合物结合时，二聚化诱导型蛋白将具有增加的转录调节活性，其中与结合成员未与t-sm复合物结合时观察到的转录调节活性相比，转录调节活性增加。
[0264]
转录调节结构域可以是能够上调分拆式转录因子结合的基因的转录的转录激活结构域。合适的转录激活结构域包括核因子κb的p65亚基(bitko&barik，j.virol.[病毒学杂志]72：5610-5618(1998)和doyle&hunt，neuroreport 8：2937-2942(1997))；liu等人，cancer gene ther.[癌症基因疗法]5：3-28(1998))；复制和转录激活因子(rta；lukac等
人，jvirol.[病毒学杂志]73，9348-61(1999))，hsv vp16激活结构域(参见，例如hagmann等人，j.virol.[病毒学杂志]71，5952-5962(1997))核激素受体(参见，例如torchia等人，curr.opin.cell.biol.[细胞生物学当前观点]10：373-383(1998))；或人工嵌合功能结构域，例如vp64(beerli等人，(1998)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]95：14623-33)和降解决定子(degron)(molinari等人，(1999)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]18，6439-6447)。另外的示例性激活结构域包括oct1、oct-2a、sp1、ap-2和ctf1(seipel等人，embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]11，4961-4968(1992)以及p300、cbp、pcaf、src1 pvalf、athd2a和erf-2。参见，例如robyr等人(2000)mol.endocrinol.[分子内分泌学]14：329-347；collingwood等人(1999)j.mol.endocrinol.[分子内分泌学杂志]23：255-275；leo等人(2000)gene[基因]245：1-11；manteuffel-cymborowska(1999)acta biochim.pol.[波兰生物化学学报]46：77-89；mckenna等人(1999)j.steroid biochem.mol.biol.[类固醇生物化学和分子生物学杂志]69：3-12；malik等人(2000)trends biochem.sci.[生物化学科学的趋势]25：277-283；和lemon等人(1999)curr.opin.genet.dev.[遗传学与发育的最新观点]9：499-504。另外的示例性激活结构域包括但不限于osgai、half-1、c1、ap1、arf-5、-6、-7和-8、cprf1、cprf4、myc-rp/gp和trab1以及经修饰的cas9反式激活蛋白。参见，例如ogawa等人(2000)gene[基因]245：21-29；okanami等人(1996)genes cells[基因与细胞]1：87-99；goff等人(1991)genes dev.[基因与发育]5：298-309；cho等人(1999)plant mol.biol.[植物分子生物学]40：419-429；ulmason等人(1999)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]96：5844-5849；sprenger-haussels等人(2000)plant j.[植物杂志]22：1-8；gong等人(1999)plant mol.biol.[植物分子生物学]41：33-44；hobo等人(1999)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]96：15,348-15,353；和perez-pinera等人(2013)nature methods[自然方法]10：973-976)。转录激活结构域可以包含上述示例性激活结构域的任何组合。在一些实施例中，可以使用多个转录激活结构域，例如相同结构域的串联报告物或不同结构域的融合物。在一些实施例中，转录激活结构域是vpr，其是由vp64、p65和rta结构域构成的三部分型激活物。包含vpr的trd-t融合蛋白的示例在seq id no：225(ns4a/3pr s139a-vpr)中列出。例如在chavez等人2015中描述了vpr作为转录激活剂的产生和使用。在一些实施例中，转录激活结构域是hsf-1，任选地与p65组合。
[0265]
可替代地；转录调节结构域可以是能够下调分拆式转录因子结合的基因的转录的转录抑制结构域。转录抑制结构域包括但不限于krab a/b、kox、tgf-β诱导型早期基因(tieg)、v-erba、sid、mbd2、mbd3、dnmt家族的成员(例如dnmt1、dnmt3a、dnmt3b)、rb和mecp2。参见，例如bird等人(1999)cell[细胞]99：451-454；tyler等人(1999)cell[细胞]99：443-446；knoepfler等人(1999)cell[细胞]99：447-450；和robertson等人(2000)nature genet.[自然遗传学]25：338-342。其他示例性抑制结构域包括但不限于rom2和athd2a。参见，例如chem等人(1996)plant cell[植物细胞]8：305-321；和wu等人(2000)plant j.[植物杂志]22：19-27。
[0266]
dna结合结构域可以是以序列特异性方式结合靶序列的任何蛋白。例如，dna结合结构域可以是或可以含有以序列特异性方式结合靶序列的转录因子，或其dna结合片段。预期能够以特定方式结合靶序列的任何转录因子或其dna结合片段可与本文披露的分拆式转录因子一起使用。dna结合结构域可以是或包含天然存在的dna结合结构域，例如来自人转
录因子的结合结构域。例如，dna结合蛋白可以是vaquerizas等人(2009)描述的任何人转录因子(例如补充信息s3中列出的任何那些)，或其dna结合片段。例如，dna结合蛋白可以是c2h2锌指家族、同源结构域家族或螺旋-环-螺旋家族的成员或其dna结合片段。在特定实施例中，dna结合结构域可以是锌指同源结构域转录因子1(zfhd1)。zfhd1包含来自zif268转录因子和oct-1同源结构域的锌指1和2。例如，pomerantz等人1995描述了zfhd1的设计和构建。
[0267]
dna结合结构域可以是或包含dna结合结构域，例如锌指dna结合结构域、tale dna结合结构域、来自大范围核酸酶(例如基于iscei)的dna结合结构域或来自crispr/cas系统的dna结合结构域。这些结合结构域可以被工程改造以结合选择的靶序列，例如细胞中天然存在(内源性)的靶基因中的靶序列或反式提供的靶序列(例如作为第三表达盒的一部分)。例如在us 6453242 b1中描述了工程改造锌指dna结合结构域以结合特定靶序列。在一个实施例中，dna结合结构域是tale dna结合结构域。例如在wo 2010079430 a1中描述了工程改造tale dna结合结构域结构域以结合特定靶序列。在一个实施例中，dna结合结构域是来自大范围核酸酶的经工程改造的dna结合结构域。例如在wo 2007047859 a1中描述了工程改造大范围核酸酶以结合特定靶序列。可以对大范围核酸酶进行工程改造，使其不再切割dna。在一个实施例中，dna结合结构域是来自crispr/cas系统的经工程改造的dna结合结构域。例如在wo 2013176772 a1中描述了工程改造来自crispr/cas系统的dna结合结构域以结合特定序列。crispr/cas系统通常涉及rna指导的核酸内切酶(例如cas9)，该酶通过相关联的指导rna(grna)与其靶序列之间的互补性定向到特定的dna序列。因此，来自crispr/cas系统的经工程改造的dna结合结构域通常包含rna指导的核酸内切酶(例如cas9或其变体)和指导rna的复合物。已经产生了cas9变体，它们缺乏核酸内切酶活性，但保留了与dna相互作用的能力。参见例如chavez等人2015，它描述了在转录调节方法中使用核酸酶无效(dcas9)变体。因此，dna结合结构域可包括核酸酶无效cas9变体，其在添加对靶序列特异的特定grna后结合靶序列。包含dcas9作为dna结合结构域的dbd-bm融合蛋白的示例在seq id no：227(spdcas9-prsim_23x3)中列出。将dbd-bm靶向人il-2的指导rna的示例在seq id no：seq id no：229中列出。hill等人2018和wo 2018/213848 a1描述了使用dcas9变体作为分拆式转录因子的一部分。
[0268]
结合成员可以与转录调节结构域或与dna结合结构域融合。
[0269]
在一些实施例中：
[0270]
(1)第一组分多肽包含dna结合结构域并与靶蛋白融合形成dbd-t融合蛋白；并且
[0271]
第二组分多肽包含转录调节结构域并与结合成员融合以形成trd-bm融合蛋白，或
[0272]
(2)第一组分多肽包含转录调节结构域并与靶蛋白融合形成trd-t融合蛋白；并且
[0273]
第二组分多肽包含dna结合结构域并与结合成员融合以形成dbd-bm融合蛋白，
[0274]
其中dna结合结构域、靶蛋白、转录调节结构域和结合成员如本文进一步定义。
[0275]
在某些实施例中：
[0276]
(1)第一组分多肽包含dna结合结构域并与靶蛋白融合形成dbd-t融合蛋白，其中靶蛋白包含与seq id no：1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且
[0277]
第二组分多肽包含转录调节结构域并与结合成员融合以形成trd-bm融合蛋白，或
[0278]
(2)第一组分多肽包含转录调节结构域并与靶蛋白融合形成trd-t融合蛋白，其中
靶蛋白具有与seq id no：1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且
[0279]
第二组分多肽包含dna结合结构域并与结合成员融合以形成dbd-bm融合蛋白，
[0280]
其中在(1)或(2)中：
[0281]
a)结合成员包含prsim_23的bc、de和fg环或tn3序列；
[0282]
b)结合成员包含prsim_32的bc、de和fg环或tn3序列；
[0283]
c)结合成员包含prsim_33的bc、de和fg环或tn3序列；
[0284]
d)结合成员包含prsim_36的bc、de和fg环或tn3序列；
[0285]
e)结合成员包含prsim_47的bc、de和fg环或tn3序列；
[0286]
f)结合成员包含prsim_57的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0287]
g)结合成员包含prsim_01的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0288]
h)结合成员包含prsim_04的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0289]
i)结合成员包含prsim_67的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0290]
j)结合成员包含prsim_72的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；或者
[0291]
k)结合成员包含prsim_75的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列。
[0292]
dbd-t融合蛋白可以包含与seq id no：45中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，上文(1)中定义的trd-bm融合蛋白可包含与seq id no：57-67中任一个所列的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0293]
trd-t融合蛋白可以包含与seq id no：44中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，上文(2)中定义的dbd-bm融合蛋白可以包含与seq id no：46-56中任一个所列的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0294]
如实例中所述，一些示例性结合成员表现出对融合至dna结合结构域或转录调节结构域的偏好，由此观察到转录调节活性的增加取决于特定结合成员是否与dna结合结构域或转录调节结构域融合。因此，在一些实施例中：
[0295]
(1)第一组分多肽包含dna结合结构域并与靶蛋白融合以形成dbd-t融合蛋白，其中靶蛋白包含与seq id no：1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且
[0296]
第二组分多肽包含转录调节结构域并与结合成员融合以形成trd-bm融合蛋白，
[0297]
其中：
[0298]
a)trd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_23的bc、de和fg环或tn3序列；
[0299]
b)trd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_47的bc、de和fg环或tn3序列，或
[0300]
c)trd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_04的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0301]
d)trd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_72的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0302]
e)trd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_67的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；或者
[0303]
f)trd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_75的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列，或
[0304]
(2)第一组分多肽包含转录调节结构域并与靶蛋白融合以形成trd-t融合蛋白，其
中靶蛋白具有与seq id no：1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且
[0305]
第二组分多肽包含dna结合结构域并与结合成员融合以形成dbd-bm融合蛋白，
[0306]
其中：
[0307]
g)dbd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_23的bc、de和fg环或tn3序列；
[0308]
h)dbd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_01的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0309]
i)dbd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_57的hcdr和/或lcdr，或vh和/或vl序列；
[0310]
j)dbd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_32的bc、de和fg环或tn3序列；
[0311]
k)dbd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_33的bc、de和fg环或tn3序列；或者
[0312]
l)dbd-bm融合蛋白中的结合成员包含prsim_36的bc、de和fg环或tn3序列。
[0313]
在一些实施例中，结合成员或靶蛋白融合至dna结合结构域的c末端。在其他实施例中，结合成员或靶蛋白融合至转录调节结构域的n末端。结合成员或靶蛋白可以通过肽接头融合至dna结合结构域或转录调节结构域，例如通过一种或多种上述肽接头。在特定实施例中，接头具有氨基酸序列tggggsggggs(seq id no：185)或sa。
[0314]
如实例中所述，发现prsim_23在两个方向上都提供强基因表达调节。因此，在一些实施例中：
[0315]
(1)第一组分多肽包含dna结合结构域并与靶蛋白融合以形成dbd-t融合蛋白，其中靶蛋白包含与seq id no：1中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；和
[0316]
第二组分多肽包含转录调节结构域并与结合成员融合以形成trd-bm融合蛋白，或
[0317]
(2)第一组分多肽包含转录调节结构域并与靶蛋白融合以形成trd-t融合蛋白，其中靶蛋白具有与seq id no：1具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且
[0318]
第二组分多肽包含dna结合结构域并与结合成员融合以形成dbd-bm融合蛋白，
[0319]
其中在(1)或(2)中，结合成员包含prsim_23的bc、de和fg环或tn3序列。
[0320]
在特定实施例中：
[0321]
(1)dbd-t融合蛋白包含与seq id no：45具有至少90％同一性的氨基酸序列；trd-bm融合蛋白具有与seq id no：57中所列氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或
[0322]
(2)dbd-bm融合蛋白包含与seq id no：46中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且trd-t融合蛋白包含与seq id no：44中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0323]
如实例中所示，基于prsim的cid也可以应用于激活crispr(crispra)系统。例如，这可用于促进内源基因调节。
[0324]
因此，在一些实施例中，dbd-bm融合蛋白包含与seq id no：227中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且trd-t融合蛋白包含与seq id no：225中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。dbd-bm融合蛋白可以通过使用对靶序列特异的特定指导rna被指导至所述靶序列。
[0325]
如实例中所示，包含与靶蛋白或结合成员的多个拷贝融合的dna结合结构域的分拆式转录因子相对于包含与靶蛋白或结合成员的单个拷贝融合的dna结合结构域的分拆式转录因子表现出增加的表达。
[0326]
因此，在一些实施例中，
[0327]
dbd-t融合蛋白包含与靶蛋白的多个拷贝(例如两个、三个、四个、五个或更多个靶蛋白)融合的dna结合结构域；或者
[0328]
dbd-bm融合蛋白包含与靶蛋白的多个拷贝(例如两个、三个、四个、五个或更多个结合成员)融合的dna结合结构域。
[0329]
多个结合成员或多个靶蛋白可以通过接头分开，例如通过一个或多个上述肽接头分开。在具体的示例性实施例中，dbd-t融合蛋白包含与三个靶蛋白融合的dna结合结构域，或dbd-bm融合蛋白包含与三个结合成员融合的dna结合结构域。
[0330]
第一和/或第二组分多肽可另外包含核定位信号(例如来自sv40培养基t-抗原的信号)。
[0331]
分拆式转录因子也可以与第三表达盒一起提供，其中第三表达盒编码期望的表达产物，其中分拆式转录因子的dna结合结构域结合第三表达盒中的靶序列，使得转录因子能够调节期望的表达产物的表达。“能够调节表达”意指dna结合结构域能够结合靶序列并且在与转录调节结构域形成转录因子后(即在二聚化诱导型蛋白的二聚化后)具有调节(增加或减少)期望的表达产物的表达的转录调节活性。期望的表达产物可以是rna或肽类(肽、多肽或蛋白)。优选地，期望的表达产物是肽类。期望的表达产物可以是治疗性蛋白，即在受试者中发挥治疗作用的蛋白。
[0332]
靶序列可以位于启动子中或紧密接近启动子，该启动子与期望的表达产物的编码序列可操作地连接。“紧密接近”是指靶序列在对应于启动子的序列的500bp内、250bp内、100bp内、50bp内或25bp内。
[0333]
分拆式嵌合抗原受体
[0334]
二聚化诱导型蛋白可以是分拆式嵌合抗原受体(分拆式car)。
[0335]
car组合了抗体样识别和t细胞激活功能。它们通常由以下构成：抗原特异性识别结构域(例如源自抗体)、将car锚定到t细胞的跨膜结构域、共刺激结构域和一个或多个在转导的t细胞中诱导持久性、运输和效应子功能的细胞内信号传导结构域。car的设计和使用在本领域中是众所周知的，并且在例如sadelain等人2013中描述。
[0336]
已经设计了分拆式car，其需要用户提供的外源信号来激活car，例如wu等人2015中描述。在这些分拆式受体中，抗原结合组分和细胞内信号传导组分仅在异二聚化小分子存在的情况下组装，这允许用户精确控制t细胞活性的时间、位置和剂量。这种分拆式car有望减轻毒性，例如通过减少脱靶效应。
[0337]
在一个实施例中，二聚化诱导型蛋白包含：
[0338]
包含共刺激结构域并与本文定义的靶蛋白融合的第一组分多肽；并且
[0339]
包含细胞内信号传导结构域并与本文定义的结合成员融合的第二组分多肽。
[0340]
上述第一组分多肽可进一步包含抗原特异性识别结构域和跨膜结构域，并且第二组分多肽进一步包含跨膜结构域和第二共刺激结构域，并且其中第一组分多肽和第二组分多肽二聚化后形成嵌合抗原受体(car)。“形成car”是指使第一和第二组分多肽足够接近以致它们能够重构完全功能性car。
[0341]
在另一个实施例中，二聚化诱导型蛋白包含：
[0342]
包含细胞内信号传导结构域并与本文定义的靶蛋白融合的第一组分多肽；和
[0343]
包含第一共刺激结构域并与本文定义的结合成员融合的第二组分多肽。
[0344]
上述第一组分多肽可进一步包含跨膜结构域和第二共刺激结构域，并且第二组分多肽进一步包含跨膜结构域和第二共刺激结构域，其中第一组分多肽和第二组分多肽二聚化后形成嵌合抗原受体(car)，
[0345]
当结合成员与t-sm复合物结合时，分拆式car将具有增加的活性，其中与结合成员未与t-sm复合物结合时观察到的活性相比，活性增加。
[0346]
在一个实施例中，第一组分多肽从n末端到c末端包含：
[0347]
i)抗原特异性识别结构域；
[0348]
ii)跨膜结构域；和
[0349]
ii)第一共刺激结构域；
[0350]
并且第二组分多肽从n末端到c末端包含：
[0351]
i)跨膜结构域；
[0352]
ii)第二共刺激结构域；和
[0353]
iii)细胞内信号传导结构域，
[0354]
其中第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成car。
[0355]
在一些实施例中，靶蛋白和结合成员在第一和第二组分多肽中相应跨膜结构域的c末端位置融合。例如，靶蛋白或结合成员可以融合至第一和第二组分多肽中相应共刺激结构域的n末端或c末端。在特定实施例中，靶蛋白和结合成员之一与第一共刺激结构域的c末端融合，并且另一个与第二共刺激结构域的c末端融合。
[0356]
例如，在一个实施例中，第一组分多肽从n末端到c末端包含：
[0357]
i)抗原特异性识别结构域；
[0358]
ii)跨膜结构域
[0359]
iii)第一共刺激结构域；
[0360]
并且第二组分多肽从n末端到c末端包含：
[0361]
i)跨膜结构域；
[0362]
ii)第二共刺激结构域；和
[0363]
iii)细胞内信号传导结构域，
[0364]
其中，靶蛋白与第一共刺激结构域的c末端融合，并且结合成员与第二共刺激结构域的c末端融合。
[0365]
例如，在另一个实施例中，第一组分多肽从n末端到c末端包含：
[0366]
i)抗原特异性识别结构域；
[0367]
ii)跨膜结构域
[0368]
iii)第一共刺激结构域；
[0369]
并且第二组分多肽从n末端到c末端包含：
[0370]
i)跨膜结构域；
[0371]
ii)第二共刺激结构域；和
[0372]
iii)细胞内信号传导结构域，
[0373]
其中，结合成员与第一共刺激结构域的c末端融合，靶蛋白与第二共刺激结构域的c末端融合。
[0374]
靶蛋白和/或结合成员可以直接融合至相应的共刺激结构域。更优选地，靶蛋白和结合成员通过肽接头与其相应的共刺激结构域分开。肽接头可以如本文进一步定义。在一些实施例中，靶蛋白和结合成员通过包含在seq id no：204中列出的氨基酸序列的接头与其相应的共刺激结构域分开。类似地，肽接头可以将第一和第二组分多肽中的不同结构域分开。例如，跨膜结构域可以通过肽接头(例如包含氨基酸序列gs的肽接头)与第二共刺激结构域分开，和/或第二共刺激结构域可以通过肽接头(例如包含seq id no：204中列出的氨基酸序列的肽接头)与细胞内信号传导结构域分开。
[0375]
合适的共刺激结构域的非限制性示例包括但不限于来自4-1bb(cd137)、cd28、icos、ox-40、btla、cd27、cd30、gitr和hvem的激活结构域。在一个实施例中，第一和第二共刺激结构域是4-1bb激活结构域。
[0376]
合适的细胞内信号转导结构域的非限制性示例包括但不限于t细胞受体(tcr)的细胞质序列和协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能的任何合成的序列。特定的细胞内信号传导结构域是包括称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号传导基序的那些。含有itam的信号传导结构域的示例包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在特定实施例中，细胞内信号传导结构域源自cd3ζ。
[0377]
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。如果来源是天然的，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区可以源自(即至少包含以下中的一个或多个跨膜区)t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154，或源自免疫球蛋白如igg4。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。可以在合成的跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，长度优选在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以形成car的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。在特定实施例中，跨膜结构域源自cd28。
[0378]
第一和第二多肽可以另外包括铰链结构域，例如igg4或cd8a铰链结构域，其位于第一和/或第二多肽的跨膜结构域的n末端。铰链结构域的示例描述于，例如，qin等人2017。在特定实施例中，铰链结构域是人igg4铰链结构域。
[0379]
适用于本披露的二聚化诱导型蛋白的抗原特异性识别结构域可以是任何抗原结合多肽，其中多种是本领域已知的。在一些情况下，抗原结合结构域是单链fv(scfv)。其他基于抗体的识别结构域(cab vhh(骆驼抗体可变结构域)和人源化版本、ignar vh(鲨鱼抗体可变结构域)和人源化版本、sdab vh(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼化”抗体可变结构域适用于使用。在某些情况下，基于t细胞受体(tcr)的识别结构域，例如单链tcr(sctv，包含ννβ的单链双结构域tcr)也适合于使用。
[0380]
在特定实施例中，抗原特异性识别结构域是单链fv(scfv)。如别处所述，scfv通常包含通过肽接头(例如包含在seq id no：204中列出的氨基酸序列的肽接头)与vl链分开的vh链。
[0381]
适用于本披露的二聚化诱导型蛋白的抗原特异性识别结构域可具有多种抗原结合特异性。在一些情况下，抗原结合结构域对癌细胞表达(合成)的抗原(即癌细胞相关抗原)中存在的表位具有特异性。癌细胞相关抗原可以是与以下相关的抗原：例如乳腺癌细
胞、b细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、非霍奇金b细胞淋巴瘤(b-nhl)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤、结直肠癌细胞等。癌细胞相关抗原也可以由非癌细胞表达。
[0382]
在特定示例性实施例中，分拆式car中使用的靶蛋白源自hcv ns3/4a蛋白酶，小分子是西米普韦并且结合成员基于prsim_23(例如包含prsim_23的bc、de和fg环或tn3序列，任选地具有本文所述的序列同一性和/或改变)。
[0383]
在一些实施例中，第一组分多肽从n末端到c末端包含：
[0384]
i)抗原特异性识别结构域；
[0385]
ii)跨膜结构域
[0386]
iii)第一共刺激结构域；
[0387]
并且第二组分多肽从n末端到c末端包含：
[0388]
i)跨膜结构域；
[0389]
ii)第二共刺激结构域；和
[0390]
iii)细胞内信号传导结构域，
[0391]
其中靶蛋白与第一共刺激结构域的c末端融合，结合成员与第二共刺激结构域的c末端融合，其中与靶蛋白融合的第一组分多肽包含与seq id no：70中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且其中与结合成员融合的第二组分多肽包含与seq id no：200中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，任选地其中抗原特异性识别结构域(例如scfv)位于与seq id no：70中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的n末端。
[0392]
在一些实施例中，第一组分多肽包含位于抗原特异性识别结构域n末端的第一信号肽。第一信号肽可以包含在seq id no：201或seq id no：202中列出的氨基酸序列。在示例性实施例中，第一信号肽包含在seq id no：201中列出的氨基酸序列。
[0393]
在一些实施例中，第二组分多肽包含位于跨膜结构域n末端的第二信号肽。第二信号肽可以包含在seq id no：201或seq id no：202中列出的氨基酸序列。在示例性实施例中，第二信号肽包含在seq id no：202中列出的氨基酸序列。在一个实施例中，第二组分多肽包含与seq id no：203中列出的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0394]
还提供了包含本文披露的分拆式car的经工程改造的免疫细胞。在一个实施例中，免疫细胞是t细胞。还提供了一种遗传修饰免疫细胞以表达本文披露的分拆式car的方法。该方法可以离体进行。该方法可以包括将本文所述的一种或多种表达载体施用于免疫细胞，使得分拆式car在免疫细胞的表面上表达。
[0395]
分拆式报告子系统
[0396]
二聚化诱导型蛋白可以是分拆式报告子系统。分拆式报告子系统可以是酶或荧光蛋白，其在第一和第二组分多肽二聚化时提供可观察的表型。可观察的表型可以是色度信号、发光信号或荧光信号。dixon等人2017提供了分拆式报告子系统的具体示例。
[0397]
在一些实施例中，第一组分多肽包含第一报告子组分；并且第二组分多肽包含第二报告子组分，并且其中第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成报告子系统，任选
地其中当结合成员与t-sm复合物结合时，报告子系统提供增加的色度、发光或荧光信号。
[0398]
分拆式凋亡蛋白
[0399]
二聚化诱导型蛋白可以是分拆式凋亡蛋白。分拆式凋亡蛋白是当分拆式凋亡蛋白的第一和第二组分多肽二聚化时能够诱导凋亡的任何蛋白。分拆式凋亡蛋白的示例是分拆式半胱天冬酶(例如分拆式半胱天冬酶9或分拆式半胱天冬酶3)，它能够在二聚化后诱导细胞凋亡，因此可用于杀死含有分拆式凋亡蛋白的特定细胞(例如患病细胞，或已被施用用于细胞治疗目的的治疗性细胞)。chelur等人2007提供了分拆式半胱天冬酶的示例。例如，gargett等人2014描述了诱导型半胱天冬酶9自杀基因系统的使用。
[0400]
在一些实施例中，第一组分多肽包含第一半胱天冬酶组分；第二组分多肽包含第二半胱天冬酶组分，其中第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化后形成半胱天冬酶。当结合成员与t-sm复合物结合时，分拆式半胱天冬酶可能能够诱导细胞死亡。
[0401]
在某些实施例中，第一和第二半胱天冬酶组分是相同的，例如两种半胱天冬酶组分都包含半胱天冬酶9激活结构域。示例性半胱天冬酶9激活结构域作为人半胱天冬酶9氨基酸序列(作为ncbi登录号aao21133.1提供(版本1；最后更新于2009年12月1日))的氨基酸残基152-414提供。在第一和第二半胱天冬酶组分相同的情况下，第一和第二半胱天冬酶组分可以由相同的表达盒编码。例如，分拆式凋亡蛋白可以由一个或多个编码靶蛋白、结合成员和半胱天冬酶9激活结构域的表达盒编码，其中靶蛋白和结合成员都与半胱天冬酶9激活结构域融合。表达后，产生了包含靶蛋白、结合成员和半胱天冬酶9激活结构域的多种蛋白，并且半胱天冬酶9激活结构域(即至少第一和第二半胱天冬酶9激活结构域)的二聚化可以通过添加小分子来调节。
[0402]
在某些示例性实施例中，分拆式凋亡蛋白包含与seq id no：223具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0403]
其他二聚化诱导型蛋白
[0404]
考虑与本披露一起使用的其他二聚化蛋白包括分拆式治疗性蛋白、分拆式tev蛋白酶和分拆式cas9。分拆式治疗性蛋白是当分拆式治疗性蛋白的第一和第二组分多肽二聚化时能够发挥治疗作用的任何蛋白。
[0405]
病毒载体和病毒颗粒
[0406]
在一个实施例中，表达载体是病毒载体。适合使用的病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、甲病毒载体、黄病毒载体、弹状病毒载体、麻疹病毒载体、新城疫病毒载体、痘病毒载体和小核糖核酸病毒载体。
[0407]
如本文所用，病毒载体是指包含第一和第二表达盒的dna表达载体，使得表达盒转化为病毒基因组，当与病毒颗粒的组装所需的组分一起在细胞中表达时，该病毒基因组包装在病毒颗粒中。此外，在一个实施例中，病毒载体包含编码期望的表达产物的第三表达盒。
[0408]
在特定实施例中，表达载体是腺相关病毒(aav)载体。aav是研究最积极的基因疗法媒剂之一，其特点是具有出色的安全性谱和在广泛的靶组织中的高效转导。例如，naso等人2017和colella等人2018描述了使用aav作为基因疗法的载体。
[0409]
各种aav血清型，包括aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav6.2、aav6.2ff、aav8、aav 8.2、aav9和aav rh10以及假型aav，例如aav2/8、aav2/5和aav2/6也可根据本披露使用。
srivastava，2006描述了血清型及其分离的更多示例。
[0410]
aav颗粒是一种来自细小病毒科家族的小型(25-nm)病毒，它由无包膜的二十面体衣壳(蛋白壳)构成，其中包含约4.8kb的线性单链dna基因组。aav基因组编码几种蛋白产物，即四种非结构rep蛋白、三种衣壳蛋白(vp1-3)和组装激活蛋白(aap)。aav基因的侧翼是两个aav特异性回文反向末端重复序列(itr)。
[0411]
因此，当表达载体是aav载体时，这可能意味着第一和第二表达盒的侧翼是itr(例如itr-第一表达盒-第二表达盒-itr)，使得表达盒被转化为单链基因组，当与aav颗粒组装所需的组件一起在细胞中表达时，该基因组被包装在aav颗粒中。
[0412]
可以对aav载体进行工程改造，例如以改善它们的功能。kotterman和schaffer，2014描述了为临床基因疗法而工程改造的aav的示例。
[0413]
aav载体的包装容量小于5kb，这会限制可以引入病毒基因组的遗传物质(例如表达盒)的大小。如本文所证明的，使用具有相对小的大小的组分，例如tn3蛋白和scfv作为结合成员，允许编码三部分型复合物(例如作为二聚化诱导型蛋白的一部分，例如分拆式转录因子)的一个或多个表达盒适合在单个aav载体中。如本文另外证明的，编码三部分型复合物的一个或多个小表达盒允许将转基因(例如作为第三表达盒的一部分)作为分拆式转录因子的组分引入相同的aav载体中，允许分拆式转录因子与转基因“顺式”递送。
[0414]
本披露还包括体外制备病毒颗粒的方法。在一个实施例中，制备病毒颗粒的方法包括用本文所述的病毒载体转染宿主细胞例如哺乳动物细胞，并在细胞中表达颗粒形成所必需的病毒蛋白，并在培养基中培养转染细胞，使得细胞产生病毒颗粒。病毒颗粒可以被释放到培养基中，或者该方法可以另外涉及裂解和从细胞裂解物中分离颗粒。合适的哺乳动物细胞的示例是人胚胎肾(hek)293细胞。
[0415]
通常，使用多个质粒表达载体来产生生成病毒颗粒的各种蛋白组分。还可以利用组成性表达病毒包装组分的细胞系，从而能够使用很少的质粒。
[0416]
例如，aav颗粒的构建需要rep和cap蛋白以及来自腺病毒的另外基因来介导aav复制。例如，robert等人2017描述了制作aav颗粒。
[0417]
robert等人2017描述了生产aav颗粒的示例性方法。简而言之，这涉及用三个质粒转染哺乳动物细胞系，例如hek293细胞。一个载体使用其内源启动子编码aav(prepcap)的rep和cap基因；一个载体(phelper)编码三个另外的腺病毒辅助基因(e4、e2a和va rna)，这些基因在hek293细胞中不存在，并且；一个载体(病毒载体)(paav-goi)包含一个或多个侧翼为两个itr的表达盒。参见罗伯特等人的图2。
[0418]
在病毒颗粒释放后，可以收集包含病毒颗粒的培养基，并且任选地可以将病毒颗粒与细胞裂解物分离。任选地，病毒颗粒可以被浓缩。
[0419]
在生产和任选的浓缩之后，病毒颗粒可以被储存，例如通过在-80℃冷冻以准备好通过施用给细胞使用和/或用于疗法中。
[0420]
本披露还提供病毒颗粒，例如aav颗粒，例如通过本文所述的方法产生的那些。如本文所用，病毒颗粒包含包装在病毒包膜内的病毒基因组，其能够感染细胞，例如哺乳动物细胞。
[0421]
本文披露了一种或多种病毒颗粒，其包含编码以下的病毒基因组：
[0422]
i)靶蛋白，其中该靶蛋白能够结合小分子以形成靶蛋白和小分子之间的复合物
(t-sm复合物)；和
[0423]
ii)结合成员，其中该结合成员与该t-sm复合物特异性结合，使得该结合成员与该t-sm复合物结合的亲和力高于该结合成员与单独的该靶蛋白和单独的该小分子结合的亲和力，
[0424]
其中靶蛋白源自病毒蛋白酶并且小分子是病毒蛋白酶抑制剂。在一个实施例中，靶蛋白与第一组分多肽融合并且结合成员与第二组分多肽融合。
[0425]
本文还披露了一种或多种病毒颗粒，其包含：
[0426]
i)编码靶蛋白的第一表达盒，其中该靶蛋白能够结合小分子以形成靶蛋白和小分子之间的复合物(t-sm复合物)；和
[0427]
ii)编码结合成员的第二表达盒，其中该结合成员与该t-sm复合物特异性结合，使得该结合成员与该t-sm复合物结合的亲和力高于该结合成员与单独的该靶蛋白和单独的该小分子结合的亲和力，
[0428]
其中该靶蛋白源自非人蛋白并且该小分子是非人靶蛋白的抑制剂，并且其中该第一和第二表达盒形成一种或多种病毒颗粒中病毒基因组的一部分。在一个实施例中，非人蛋白源自病毒蛋白酶并且小分子是病毒蛋白酶抑制剂。在一个实施例中，靶蛋白与第一组分多肽融合并且结合成员与第二组分多肽融合。
[0429]
在一些实施例中，第一和第二表达盒形成病毒颗粒的相同病毒基因组的一部分。在其他实施例中，第一表达盒位于第一病毒颗粒的第一病毒基因组中，第二表达盒位于第二病毒颗粒的第二病毒基因组中。
[0430]
表达盒、靶蛋白、结合成员、小分子以及第一和第二组分多肽可以如上文进一步定义。根据所使用的病毒颗粒，病毒基因组可以是单链或双链核酸，也可以是rna或dna。例如，当病毒颗粒是aav颗粒时，病毒基因组是单链dna病毒基因组。病毒基因组可以编码如上定义的分拆式蛋白。
[0431]
基因疗法
[0432]
药剂(即一种或多种表达载体、表达产物或病毒颗粒，加上小分子)可以作为治疗方法或疾病预防方法的一部分施用于患者。在结合成员与t-sm复合物结合后，接受者个体可能会经历所治疗疾病或障碍的症状减轻。这可能对个体的疾病状况具有有益影响。
[0433]
如本文在治疗病状的上下文中所用，术语“治疗”通常涉及人类的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病状的进展，并且包括进展速率的降低、进展速率的停止、病状的消退、病状的改善和病状的治愈。还包括作为预防措施的治疗(即预防、防止)。
[0434]
在本说明书的上下文中的“预防”不应被理解为限制完全成功，即完全保护或完全预防。相反，在本文中的预防是指在检测到有症状病症之前施用的措施，其目的是通过帮助延迟、减轻或避免该特定病症来保持健康。
[0435]
治疗方法可包括在细胞中表达如本文进一步定义的一种或多种二聚化诱导型蛋白。二聚化诱导型蛋白可以例如包含在二聚化后形成治疗性多肽的第一组分多肽和第二组分多肽。以此方式，添加小分子可导致治疗性蛋白具有增加的活性并且可用于例如治疗其中治疗性蛋白缺乏的疾病的方法中。
[0436]
本文披露了一种调节细胞中期望的表达产物的表达的方法，该方法包括i)在细胞
中表达本文所述的二聚化诱导型蛋白，其中第一和第二组分多肽在二聚化后形成转录因子，并且其中dna结合结构域结合细胞中的靶序列，使得转录因子能够调节(即增加或减少)细胞中期望的表达产物的表达；以及ii)将小分子施用至细胞以调节期望的表达产物的表达。
[0437]
本文另外披露了一种二聚化诱导型蛋白，其用于在人或动物受试者的细胞中调节期望的表达产物的表达的方法中使用，该方法包括在细胞中表达本文所述的二聚化诱导型蛋白，其中第一和第二组分多肽在二聚化后形成转录因子，并将小分子施用至细胞以调节(例如增加或减少)期望的表达产物的表达。本文还披露了一种小分子，其用于在人或动物受试者的细胞中调节期望的表达产物的表达的方法中使用，该方法包括在细胞中表达本文所述的二聚化诱导型蛋白，其中第一和第二组分多肽在二聚化后形成转录因子，并将小分子施用至细胞以调节(例如增加或减少)期望的表达产物的表达。
[0438]
该方法可以包括施用一种或多种如本文所述的表达载体或病毒颗粒以在细胞中表达二聚化诱导型蛋白。在其他实施例中，该方法可以包括施用由一种或多种表达载体产生的表达产物(例如编码二聚化诱导型蛋白的mrna)至细胞。特定施用将由医师自行决定，医师也将使用他/她的公知常识和熟练从业者已知的给药方案来选择剂量。
[0439]
期望的表达产物可以是rna或肽类(肽、多肽或蛋白)。优选地，期望的表达产物是肽类。期望的表达产物可以是治疗性蛋白，即在受试者中发挥治疗作用的蛋白。
[0440]
期望的表达产物可以是存在于靶细胞基因组中的内源基因的一部分。例如，当该方法在人细胞中进行时，期望的表达产物可以是人基因的一部分。可替代地，期望的表达产物可以是递送至靶细胞的转基因(例如治疗性转基因)的一部分。调节基因的表达可用于治疗疾病的方法或预防疾病的方法中。在分拆式转录因子的表达和小分子的施用之后，接受者个体可能表现出所治疗的疾病或障碍的症状减少。这可能对个体的疾病状况具有有益影响。
[0441]
当靶序列是递送至细胞的转基因的一部分时，该方法可进一步包括将第三表达盒施用至细胞，其中第三表达盒编码期望的表达产物并且其中第三表达盒包含靶序列。转基因可包含与期望的表达产物的编码序列可操作地连接的启动子，该期望的表达产物可为治疗性蛋白，例如治疗性抗体。治疗性抗体的示例是medi8852，其重链氨基酸序列如seq id no：205中列出的，轻链氨基酸序列如seq id no：206中列出的。第三表达盒可以是与第一和第二表达盒中的一个或两个相同的表达载体或病毒颗粒的一部分。换言之，转基因可与分拆式转录因子“顺式”递送至细胞，例如在同一病毒(例如aav)颗粒内。可替代地；第三表达盒可以是与第一和第二表达盒中的一个或两个不同的表达载体或病毒颗粒的一部分。换言之，转基因可以与分拆式转录因子一起“反式”递送至细胞，例如在分开的病毒(例如aav)颗粒内。如本文所证明的，本披露内容的分拆式转录因子适用于与转基因的“顺式”和“反式”递送。
[0442]
靶序列可以位于启动子中或紧密接近启动子，该启动子与期望的表达产物的编码序列可操作地连接。“紧密接近”是指靶序列在对应于启动子的序列的500bp内、250bp内、100bp内、50bp内或25bp内。
[0443]
可以通过任何合适的方式向细胞施用。例如，表达盒可以通过病毒递送，例如作为本文所述病毒颗粒的一部分，或通过非病毒方式递送。非病毒递送方式包括电穿孔、脂转
染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸dna、裸rna、人工病毒体和增强对dna的吸收的试剂。在一个实施例中，表达盒作为mrna递送。在一个实施例中，表达盒作为dna质粒递送。
[0444]
在本文披露的任何体内方法中，小分子可以例如以可接受的剂型如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液口服施用至人受试者。所用的量将取决于所治疗的宿主和特定的施用方式。小分子可以作为单个剂量、多个剂量或在确定的时间段内施用。
[0445]
在该方法涉及向细胞施用病毒颗粒的情况下，可以根据施用的病毒颗粒的剂量来计算单位剂量。病毒剂量包括特定数量的病毒颗粒或噬菌斑形成单位(pfu)或病毒基因组拷贝(vgc)。对于涉及aav的实施例，特定单位剂量包括103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
16
个病毒基因组拷贝(vgc)/kg体重。由于存在感染缺陷型颗粒，颗粒剂量可能稍高(10到100倍)。
[0446]
不希望受理论束缚，据信病毒颗粒(例如aav颗粒)对细胞的感染和转导是通过如下一系列顺序事件发生的：病毒衣壳与靶细胞表面受体的相互作用、内吞作用内化、通过内吞/蛋白酶体区室的细胞内运输、内体逃逸、核输入、病毒体脱壳和病毒dna双链转换，导致由病毒基因组编码的蛋白在病毒颗粒中的转录和表达。
[0447]
虽然一种或多种表达载体、表达产物、病毒颗粒和小分子可以单独使用(例如施用)，但通常优选将各个组分作为例如与药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物或配制品呈现。例如，一种或多种病毒颗粒可以作为包含一种或多种病毒颗粒和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物施用。作为另一个示例，小分子可以作为包含小分子和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物施用。
[0448]
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其在合理的医学判断范围内适于与讨论的受试者(例如人)的组织接触，没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相当。在与配制品的其他成分相容的意义上，每种载体、稀释剂、赋形剂等也必须是“可接受的”。
[0449]
药剂(即一种或多种表达载体、dna质粒或病毒颗粒，加上小分子)可以同时或依次施用，并且可以单独不同的剂量方案和通过不同的途径施用。例如，当依次施用时，药剂可以以紧密间隔(例如，在5-10分钟的时间段内)或以更长的间隔(例如，相隔1、2、3、4或更多小时，或在需要时甚至更长的时间间隔)施用，精确的剂量方案与所施用的一种或多种药剂的特性相称。在一个实施例中，在施用一种或多种表达载体、dna质粒或病毒颗粒之后施用小分子。
[0450]
细胞疗法
[0451]
还提供了细胞疗法的方法。细胞疗法涉及向患者施用经过基因修饰以表达表达产物(例如二聚化诱导型蛋白)的细胞。
[0452]
细胞例如干细胞可用于细胞疗法的方法。与使用干细胞相关的一个潜在优势是它们可以在体外分化为其他细胞类型，并且可以引入哺乳动物(例如细胞的供体)，在那里它们将移植到骨骼中骨髓。合适的干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经元干细胞、心脏干细胞和间充质干细胞。
[0453]
例如，细胞疗法可以包括在离体方法中向细胞(例如干细胞)施用本文所述的一种或多种表达载体，使得二聚化诱导型蛋白由细胞表达并且将细胞施用至患者。在施用表达
二聚化诱导型蛋白的细胞之后，可以向个体施用小分子以诱导第一和第二组分多肽的二聚化，从而在二聚化后重建它们的功能。例如，第一和第二组分多肽可以在二聚化后形成转录因子，或者第一和第二组分多肽可以在二聚化后形成car。
[0454]
本文披露了一种治疗方法，其包括向患者施用表达本文定义的二聚化诱导型蛋白的细胞，该方法包括：
[0455]
i)将该细胞施用至个体；并且
[0456]
ii)将该小分子施用至该个体。
[0457]
二聚化诱导型蛋白可以是例如分拆式转录因子、分拆式car、分拆式凋亡蛋白或分拆式治疗性蛋白。治疗方法可以是治疗癌症的方法。
[0458]
细胞疗法可能涉及从患者分离细胞，用一种或多种表达载体离体转染细胞，然后将细胞施用至患者。适用于离体转染的各种细胞类型是本领域技术人员众所周知的(参见，例如.，freshney等人，culture of animal cells，a manual of basic technique[动物细胞培养基础技术手册](第3版.1994))以及其中引用的讨论如何从患者分离和培养细胞的参考文献。
[0459]
例如，细胞疗法可包括从患者分离细胞，以离体方法向细胞施用本文所述的一种或多种表达载体，使得二聚化诱导型蛋白由细胞表达，并将细胞施用回至患者。在施用表达二聚化诱导型蛋白的细胞之后，可以向个体施用小分子以诱导本文所述的第一和第二组分多肽的二聚化。
[0460]
在一个实施例中，细胞是免疫细胞(例如t细胞)并且由细胞表达的二聚化诱导型蛋白是分拆式car。涉及car t细胞疗法的治疗方法是本领域已知的，并且描述于例如miliotou和papadopoulou，2018中。
[0461]
本文披露了一种治疗方法，其包括向患者施用表达本文定义的二聚化诱导型蛋白的细胞，其中第一和第二组分多肽在二聚化后形成car，该方法包括：
[0462]
i)将该细胞施用至个体；并且
[0463]
ii)将该小分子施用至该个体。
[0464]
治疗方法可以是治疗癌症的方法。
[0465]
核酸
[0466]
本披露还提供了编码本文定义的结合成员或二聚化诱导型蛋白的一种或多种核酸分子。核酸分子可以是一种或多种分离的核酸分子。编码结合成员和二聚化诱导型蛋白的核酸可具有如本文所述的与表达载体相关的必要特征和序列同一性。技术人员使用本领域熟知的方法制备此类核酸分子将没有困难。
[0467]
在一些实施例中，一种或多种核酸分子编码prsim_57、prsim_01、prsim_04、prsim_67、prsim_72或prsim_75的一个或多个vh和/或vl结构域。那些vh或vl结构域的氨基酸序列在本文中定义。
[0468]
在一些实施例中，一种或多种核酸分子或分子编码prsim_23、prsim_32、prsim_33、prsim_36、prsim_47、prsim_57、prsim_01、prsim_04、prsim_67、prsim_72或prsim_75的结合成员。那些结合成员的氨基酸序列在本文中定义。
[0469]
在一些实施例中，一种或多种核酸分子包含与prsim_23、prsim_32、prsim_33、prsim_36、prsim_47、prsim_57、prsim_01、prsim_04、prsim_67、prsim_72或prsim_75中列
出的示例性核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，一种或多种核酸分子包含prsim_23、prsim_32、prsim_33、prsim_36、prsim_47、prsim_57、prsim_01、prsim_04、prsim_67、prsim_72或prsim_75的核酸序列。那些示例性结合成员的核酸序列在下表中列出：
[0470]
结合成员提供的核酸序列如下：prsim_23seq id no：73prsim_32seq id no：74prsim_33seq id no：75prsim_36seq id no：76prsim_47seq id no：77prsim_57seq id no：80prsim_01seq id no：78prsim_04seq id no：79prsim_67seq id no：81prsim_72seq id no：82prsim_75seq id no：83
[0471]
在一些实施例中，一种或多种核酸分子编码与如上所述的靶蛋白或结合成员融合的第一组分多肽和/或第二组分多肽。那些组分多肽的氨基酸序列在本文中定义。
[0472]
在一些实施例中，一种或多种核酸分子编码如上所述的dbd-t融合蛋白、trd-bm融合蛋白、dbd-bm融合蛋白和trd-t融合蛋白中的一种或多种。那些融合蛋白的氨基酸序列在本文中定义。
[0473]
在一些实施例中，编码trd-t融合蛋白的一种或多种核酸分子的核酸序列与seq id no：108中列出的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，编码trd-t融合蛋白的一种或多种核酸分子具有seq id no：108的核酸序列。
[0474]
在一些实施例中，编码dbd-t融合蛋白的一种或多种核酸分子的核酸序列与seq id no：109中列出的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，编码dbd-t融合蛋白的一种或多种核酸分子具有seq id no：109的核酸序列。
[0475]
在一些实施例中，编码dbd-bm融合蛋白的一种或多种核酸分子的核酸序列与seq id no：110-120中所列的任一核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，编码dbd-bm融合蛋白的一种或多种核酸分子具有seq id no：110-120中任一个的核酸序列。
[0476]
在一些实施例中，编码trd-bm融合蛋白的一种或多种核酸分子的核酸序列与seq id no：121-131中所列的任一核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，编码trd-bm融合蛋白的一种或多种核酸分子具有seq id no：121-131中
任一个的核酸序列。
[0477]
在一些实施例中，一种或多种核酸分子编码如本文定义的分拆式car。在一些实施例中，编码分拆式car的一种或多种核酸分子具有与seq id no：133中列出的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核酸序列和编码抗原特异性识别结构域的核酸序列。在一些实施例中，编码分拆式car的一种或多种核酸分子具有seq id no：133的核酸序列和编码抗原特异性识别结构域的核酸序列。在一些实施例中，编码分拆式car的一种或多种核酸分子包含编码位于位置66和67之间的抗原特异性识别结构域(例如scfv)的核酸序列，其中对应于seq id no：133进行核苷酸编号。
[0478]
分离的核酸分子可用于表达本文披露的结合成员或二聚化诱导型蛋白。核酸通常以一种或多种表达载体的形式提供，例如具有本文所述的表达载体的特征。
[0479]
试剂盒
[0480]
本披露还提供了试剂盒，其包含一种或多种表达载体、一种或多种病毒颗粒、细胞或一种或多种核酸(均如本文所定义)以及小分子(也如本文所定义)。在一些实施例中，小分子是西米普韦。当一种或多种表达载体或核酸编码含有来自crispr/cas系统的dna结合结构域的多肽时，试剂盒可另外包括对靶序列特异的指导rna，或编码对靶序列特异的指导rna的核酸。
[0481]
序列同一性和改变
[0482]
通常参考算法gap(威斯康星州gcg软件包，美国圣地亚哥的阿赛乐德网路公司(accelerys inc，san diego usa))来定义序列同一性。gap使用needleman和wunsch算法来比对两个完整序列，从而最大化匹配数并最小化空位数。通常，使用默认参数，其中空位产生罚分等于12且空位延伸罚分等于4。可以优选使用gap，但是也可以使用其他算法，例如blast(使用altschul等人(1990)的方法)、fasta(使用pearson和lipman(1988)的方法)或smith-waterman算法(smith和waterman(1981))或tblastn程序(altschul等人(1990)，同上)，通常采用默认参数。具体而言，可以使用psi-blast算法。
[0483]
当本披露提及与参考氨基酸序列具有至少90％序列同一性的特定氨基酸序列时，这包括与参考氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、有96％、97％、98％、99％和100％序列同一性的氨基酸序列。
[0484]
如本文所用，术语“序列改变”旨在涵盖氨基酸残基的取代、缺失和/或插入。因此，与参考序列相比包含一个或多个氨基酸序列改变的蛋白与参考序列相比包含氨基酸残基的一个或多个取代、一个或多个缺失和/或一个或多个插入。术语“氨基酸突变”在本文中也可与“序列改变”互换使用，除非上下文另有明确说明。
[0485]
在其中一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代的一些实施例中，取代可以是保守取代，例如根据下表。在一些实施例中，中间列中相同框中的氨基酸被取代，即，非极性氨基酸取代例如另一个非极性氨基酸。在一些实施例中，最右边一列中同一行中的氨基酸被取代，即例如g取代a或p。
[0486][0487]
在一些实施例中，一个或多个取代可以是功能上保守的。即，在一些实施例中，与等效的未取代的蛋白相比，取代可能不影响(或可能基本上不影响)包含取代的蛋白的一种或多种功能特性(例如结合亲和力)。
[0488]
结合成员还可包含如本文披露的bc、de或fg环、tn3、cdr、vh结构域、vl结构域和/或scfv序列的变体。合适的变体可以通过序列改变或突变和筛选的方法获得。在优选的实施例中，包含一个或多个变体序列的结合成员保留亲本结合成员的一个或多个功能特征，例如对t-sm复合物的结合特异性和/或结合亲和力。例如，包含一个或多个变体序列的结合成员优选以与(亲本)结合成员相同的亲和力或比(亲本)结合成员更高的亲和力结合t-sm复合物。亲本结合成员是不包含已并入变体结合成员的一个或多个氨基酸取代、一个或多个缺失和/或一个或多个插入的结合成员。
[0489]
例如，结合成员可包含与在此披露的bc、de或fg环、tn3、cdr、vh结构域、vl结构域或scfv序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％序列同一性的bc、de或fg环、tn3、cdr、vh结构域、vl结构域或scfv序列。
[0490]
结合成员可包含相对于在此披露的bc、de或fg环、tn3、cdr、vh结构域、vl结构域或scfv序列具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选20个改变或更少、15个改变或更少、10个改变或更少、5个改变或更少、4个改变或更少、3个改变或更少、2个改变或更少、或1个改变的bc、de或fg环、tn3、cdr、vh结构域、vl结构域或scfv序列。
[0491]
***
[0492]
以其特定形式或根据用于执行所披露的功能的方式、或者用于获得所披露的结果的方法或过程来表达的在前面的说明书或在以下权利要求书或在附图中披露的特征，视情况可以单独地，或者以此类特征的任何组合的方式用于以其各种形式来实现本披露。
[0493]
虽然已经连同上述示例性实施例一起描述了本披露，但是当给出本披露时，许多等同修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，认为以上阐述的本披露的示例性实施例是说明性的而不是限制性的。在不脱离本披露的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施例进行各种改变。
[0494]
为了避免任何疑问，提供本文提供的任何理论解释是为了提高读者的理解。诸位发明人不希望受到任何这些理论解释的束缚。
[0495]
本文使用的任何章节标题只是出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
[0496]
除非上下文另有要求，否则在本说明书(包括后面的权利要求书)全篇，词语“包含”和“包括”及变型应当被理解为暗指包括所陈述的整数或步骤或者多个整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者多个整数或步骤的组。
[0497]
必须指出的是，如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“该”包括复数指示物。本文可以将范围表述为“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。在表述此类范围时，另一个实施例包括从该一个特定值开始和/或到另一个特定值。类似地，通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，应该理解该特定值形成了另一个实施例。相对于数值的术语“约”是任选的并且意指例如+/-10％。
[0498]
实例
[0499]
实例1-材料和方法
[0500]
溶剂可及表面积计算
[0501]
使用visual molecular dynamics(vmd)软件(伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校(university of illinois at urbana-champaign))内置的测量sasa命令从可从蛋白数据库(pdb；http：//www.rcsb.org/)获得的hcv ns3/4a pr：西米普韦复合物的三维结构(pdb代码3kee)计算溶剂可及表面积(sasa)。-restrict选项和的半径用于计算未与hcv ns3/4a pr结合的西米普韦的表面，换句话说，溶剂可及表面积。
[0502]
生物素化hcvns3/4a蛋白酶的产生
[0503]
用于设计hcv ns3/4a pr构建体的序列源自uniprot登录号a8dg50(丙型肝炎病毒亚型1a基因组多聚蛋白)，并结合了美国专利us 6800456的额外修改。蛋白酶结构域对应于多聚蛋白的残基1030-1206。由与ns3蛋白酶(seq id 1)的n末端融合的病毒ns4a蛋白衍生的11个残基肽组成的单链用于产生完全折叠和激活的多肽。该带有n末端六组氨酸(6his)和avitag(seq id 3)(分别用于亲和纯化和生物素化)的序列作为线性dna串(geneart)购买。同时，订购了编码具有活性位点突变s139a(seq id 4)的等效序列的dna串。使用gibson组装将dna串克隆到pet-28a载体(用于细菌表达)中。订购第二组dna串，其编码人密码子优化版本的his和avitag标记的wt和s139a蛋白酶，并将它们克隆到具有cmv启动子的哺乳动物表达载体中。最终构建体的序列通过整个编码序列的桑格测序进行验证。
[0504]
对于细菌表达，将pet-28a质粒转化到bl21(de3)大肠杆菌细胞中，并在含有卡那霉素(50μg/ml)的板上进行筛选。对于每个表达，使用单个菌落接种5ml 2xty+50μg/ml卡那霉素培养物，该培养物在37℃生长过夜。该培养物用于接种500ml的1：500稀释的tb自诱导培养基(formedium，补充有10ml/l甘油和100μg/ml卡那霉素)。培养物在37℃生长至od600为1.3-1.5，然后转移至20℃保持20小时以诱导表达。通过离心收获细胞并将沉淀储存在-80℃。
[0505]
对于哺乳动物表达，使用qiagen plasmid plus gigaprep试剂盒制备质粒dna。将gigaprep dna使用pei介导的递送转染到在freestyle293培养基(赛默飞世尔公司(thermofisher))中培养的expi293f细胞(赛默飞世尔公司)中，其中在转染点时密度为2.5x106个细胞/ml。细胞在37℃、5％co2、140rpm、70％湿度培养6天。以4,000g收获细胞并将沉淀储存在-80℃。
[0506]
对于蛋白纯化，将来自500ml培养物的每个细菌沉淀解冻并重新悬浮在50ml裂解缓冲液(2x dpbs，200mm nacl，ph 7.4)中。使用探头超声波仪裂解细胞，并通过在4℃以50,
000g离心40分钟来澄清裂解物。哺乳动物细胞沉淀通过在含有去污剂(2x dpbs、200mm nacl、1mm tcep、complete、不含edta的蛋白酶抑制剂和25u/ml turbonuclease、1％triton x-100、ph 7.4)的裂解缓冲液中重悬浮来裂解并且在10rpm旋转，在4℃放置2小时。哺乳动物裂解的样品以50,000g、30min、4℃离心。在柱色谱之前，所有样品都用0.22μm瓶顶过滤装置过滤。将过滤的上清液以5ml/min的流速加载到5ml histrap hp柱(通用健康医疗集团(ge healthcare))上。用100ml洗涤缓冲液(2x dpbs，200mm另外的nacl，20mm咪唑，ph 7.4)洗涤柱，并用5个柱体积的20-400mm咪唑的咪唑梯度洗脱。通过sds-page分析级分，合并那些富含正确蛋白的级分，并用hiprep26/10脱盐柱(通用健康医疗集团)进行缓冲液交换到裂解缓冲液(2x dpbs，200mm nacl，ph 7.4)中。合并脱盐的蛋白级分，用离心浓缩装置浓缩，并在hiload superdex 75 26/600pg柱(通用健康医疗集团)上纯化，该柱在2x dpbs、2mm dtt、10μm zncl2中平衡。通过sds-page分析级分，将纯度＞95％的级分合并，通过uv吸光度确定其浓度，并在-70℃储存之前在液氮中速冻。在xbridge beh300，c4(沃特斯公司(waters))上使用rp-hplc验证最终样品纯度。
[0507]
使用mbp标记的bira酶在atp和生物素的存在下在22℃与样品一起孵育2.5小时，将纯化的蛋白在其avitag上进行生物素化。在hiload superdex 75 16/600pg柱(通用健康医疗集团)上，在2x dpbs、2mm dtt、1μm zncl2中，通过尺寸排阻色谱法纯化生物素化的蛋白。通过sds-page分析级分，合并那些含有蛋白酶的级分，并通过xevo g2-cs ms(沃特斯公司)上的完整质谱法确认生物素化的程度。生物素化的蛋白被分成等分试样，在液氮中速冻并储存在-70℃。
[0508]
为了产生带有his和avitag标签并引入另外的突变以降低对西米普韦的亲和力的ns3/4a s139a蛋白酶，编码蛋白酶的pet-28a衍生质粒用作模板，用于使用quikchange lightning定点诱变试剂盒进行定点诱变。蛋白酶构建体的突变形式在表达之前通过整个编码序列的桑格测序进行验证。突变蛋白被转化到带有用于bira生物素蛋白连接酶的iptg诱导过表达的质粒的bl21(de3)大肠杆菌衍生物中以在细菌表达过程中实现生物素化。使用过夜培养物以1：20稀释接种50ml 2xty+50μg/ml卡那霉素。培养物在37℃生长至od600为0.6，然后补充50μm生物素并用1mm iptg诱导。将诱导的培养物转移至25℃保持20小时进行表达。通过离心收获细胞并将沉淀储存在-20℃。为了纯化，将每个沉淀物重新悬浮在20ml裂解缓冲液(50mm hepes、500mm nacl、1mm tcep、complete、不含edta的蛋白酶抑制剂)中，并在40，000kpsi通过细胞破坏器(恒定系统公司(constant systems))进行裂解。在imac的自动化两步程序中纯化蛋白，然后用脱盐柱进行缓冲液交换。一旦加载到imac树脂上，样品用补充有20mm咪唑的裂解缓冲液洗涤，并用含有400mm咪唑的缓冲液洗脱。洗脱液被自动捕获并加载到在50mm hepes、300mm nacl、0.5mm tcep、ph 7.5中平衡的脱盐柱上。最终的蛋白样品被分成等分试样，在液氮中速冻并储存在-70℃。
[0509]
hcvns3/4a pr蛋白酶活性测定
[0510]
为了评估酶活性，通过纯化的hcv ns3/4a pr和s139a突变体(ret s1，anaspec)测量了具有edans-dabcyl供体-猝灭剂对的荧光hcv蛋白酶fret底物的切割。当紧密接近时，就像完整肽的情况一样，edans在340nm处被激发，edans(在490nm处)发射的能量被dabcyl猝灭。hcv ns3/4a pr对肽的切割将dabcyl与edans分开，从而允许检测490nm处的荧光。
[0511]
hcv ns3/4a pr和活性位点突变体s139a在测定缓冲液(hepes ph 7.8、5mm dtt、100mm nacl、10％甘油、0.01％chaps)中的连续稀释液与荧光底物在室温孵育。3小时后使用perkinelmer envision读板仪(激发340nm，发射490nm)测量荧光。
[0512]
等温量热法
[0513]
等温量热法(itc)使用auto-itc 200(马尔文公司(malvern))进行，预注射0.4μl，然后以120秒的间隔进行19次注射，每次2μl。溶液的旋转速度设置为750rpm，温度设置为37℃。将西米普韦(125μm)滴定到hcv ns3/4a pr(wt 8μm和s139a突变体8.2μm)或蛋白缓冲液(对照)中；蛋白缓冲液富含2.5％dmso，与西米普韦溶液中存在的量相等。wt运行一次；s139a突变体运行两次。使用itc-peaq软件(马尔文公司)使用单位点结合模型和逐点参考减法分析数据。
[0514]
噬菌体展示筛选
[0515]
scfv和tn3序列使用如下三个噬菌体展示文库从噬菌体展示筛选中分离：(i)文库1，基于人生腱蛋白c中的第三个此类模块作为fniii替代支架开发的tn3文库((leahy等人1992)，(oganesyan等人2013)，(gilbreth等人2014))，(ii)文库2，受限框架的scfv文库和(iii)文库3，原初scfv文库。
[0516]
所有噬菌体筛选均根据先前建立的方案进行((vaughan等人，1996)，(swers等人，2013))。使用在链霉亲和素包被的磁珠(普洛麦格公司)上捕获的生物素化hcv ns3/4a pr(s139a)进行噬菌体展示筛选。使用浓度递减的生物素化hcv ns3/4a pr和西米普韦，对每个噬菌体文库进行了总共4轮噬菌体展示筛选(图4a和图4b)。
[0517]
在筛选开始之前，将生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)抗原与50倍摩尔过量的西米普韦预孵育，以确保蛋白酶饱和。在每次筛选之前，噬菌体池单独与链霉亲和素珠一起孵育，以耗尽链霉亲和素珠的任何结合剂库。对于第1轮和第2轮噬菌体展示筛选，在不存在西米普韦的情况下，未对生物素化hcv ns3/4a pr(s139a)进行去筛选步骤。然而，对于第3轮和第4轮，筛选是平行进行的，一个组没有对生物素化hcv ns3/4a pr(s139a)的去筛选步骤，而另一个组有去筛选步骤，其中噬菌体颗粒与250nm生物素化hcv ns3/4a pr(s139a)在室温预孵育15分钟，然后使用链霉亲和素包被的珠去除蛋白酶。此后，在西米普韦存在下，将所得噬菌体添加到生物素化的包被在链霉亲和素珠上的hcv ns3/4a pr(s139a)用于筛选方案。
[0518]
在每一轮中使用以下浓度的生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)进行噬菌体展示筛选：
[0519]
第1轮：250nm生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)+12.5μm西米普韦
[0520]
第2轮：100nm生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)+5μm西米普韦
[0521]
第3轮：25nm生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)+1.25μm西米普韦
[0522]
第4轮：25nm生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)+1.25μm西米普韦
[0523]
在西米普韦存在下与生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)孵育后，结合至复合物的噬菌体用d-pbs(西格玛公司(sigma))洗涤三次，然后用胰蛋白酶洗脱。洗脱的噬菌体被用于感染大肠杆菌tg1细胞的对数中期噬菌体培养物，并接种在琼脂板(含有100μg/ml氨苄青霉素和2％(w/v)葡萄糖)上。
[0524]
挑选来自第3轮和第4轮的单个噬菌体克隆用于dna测序和通过噬菌体elisa筛选
抗原结合。dna序列信息见表1。
[0525]
噬菌体拯救
[0526]
通过噬菌体elisa评估与hcv ns3/4a pr(s139a)的特异性结合，使用如所述诱导表达的单个噬菌粒scfv或tn3克隆((osbourn等人1996))。简而言之，将来自第3轮和第4轮筛选输出的编码各个tg1菌落的噬菌体克隆和阴性对照克隆在96孔板中在37℃以280rpm振荡在含有100μg/ml氨苄青霉素和2％(w/v)葡萄糖的培养基中生长至对数期。然后将辅助噬菌体添加到每个孔中，并将板在37℃以150rpm振荡孵育1小时。然后将板在室温以4500rpm离心10分钟，去除培养基并更换为含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的培养基。然后将板在25℃以280rpm振荡孵育过夜。第二天，通过向板的每个孔中加入等体积的含有6％(w/v)脱脂奶粉(马尔文公司)的2x pbs来封闭噬菌体制备物。
[0527]
噬菌体elisa
[0528]
在存在和不存在3倍过量的西米普韦(5.6μm)的情况下，使用生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)以5μg/ml(1.875μm)包被96孔链霉亲和素包被板。用pbs洗涤包被的板并用含有3％(w/v)脱脂奶粉(马尔文公司)的pbs封闭一小时。在此封闭步骤之后，在添加封闭的噬菌体制备物(如噬菌体拯救部分所述生产)之前，将板孔用pbs洗涤三次。在用pbs/tween 20(0.1％v/v)洗涤三次之前，将噬菌体制备物与抗原在室温孵育1小时。通过以下来检测与抗原包被板特异性结合的噬菌体：使用抗m13噬菌体-hrp标记的抗体(通用健康医疗集团)，然后使用3，3’，5，5
’‑
四甲基联苯胺(tmb；西格玛公司)进行检测。使用0.5m h2so4终止检测反应，并使用荧光读板仪在450nm处读取板。通过将在西米普韦存在下观察到的信号除以在西米普韦不存在下观察到的信号，将在西米普韦存在下与生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)结合的每个克隆测定的荧光读数与不存在西米普韦下的结合进行比较。这些数据绘制在图表上(图4b)。从这些数据中，选择了一组名为prsim_xx的scfv和tn3克隆(其中xx是指克隆编号)用于进一步研究。选择的克隆具有独特的dna序列，并且在不存在西米普韦的情况下通过噬菌体elisa确定不与hcv ns3/4a pr(s139a)结合(对照prsim 51、prsim 54、prsim 55和prsim 85除外，它们显示在存在和不存在西米普韦的情况下均与hcv ns3/4a pr(s139a)结合)。
[0529]
scfv和tn3 prsim结合分子的表达
[0530]
scfv和tn3 prsim结合分子使用先前描述的方法(vaughan等人，1996)使用镍螯合色谱然后是尺寸排阻色谱从大肠杆菌中纯化。为了提高最有希望的tn3 prsim结合分子的表达水平，使用寡核苷酸tn3_petfwd2(5
’‑
cgatcatatggactacaaggacgacgatgacaagggcagccgtctggatgcaccgagccag-3’(seq id no：183))和tn3_petrev2(5
’‑
atcgggatccctacagaccggttttaaaggtaatttttgccgg-3’(seq id no：184))将编码它们的dna序列亚克隆到pet16b载体并在bl21(de3)大肠杆菌(新英格兰生物实验室(new england biolabs))中进行细胞质表达。在bugbuster plus benzonase(emd密理博公司(emd millipore))中裂解后，使用镍螯合色谱将基于tn3的prsim结合分子纯化至同质性，然后进行尺寸排阻色谱以提供pbs(ph 6.5)中的单体蛋白。
[0531]
均相时间分辨荧光(htrf)结合筛选
[0532]
对hcv ns3/4a pr(s139a)具有选择性的scfv和tn3 prsim结合分子在平行运行的均相时间分辨荧光测定中进行鉴定，以测量在存在和不存在西米普韦的情况下
ns3/4a pr(s139a)、hcv ns3/4a k136d pr、hcv ns3/4a k136n pr和hcv ns3/4a d168e pr以在10mm hepes ph 7.4、150mm nacl、0.05％表面活性剂p20、0.3％dmso中2μg/ml的浓度加载到高精度链霉亲和素(sax)生物传感器上。西米普韦在相同的缓冲液中以1∶1(46.88-3，000nm)稀释，并将加载的生物传感器浸入西米普韦样品中180秒以测量缔合。对于解离，将生物传感器浸入缓冲液中600秒。使用fortebio数据分析软件分析迹线，并使用1∶1结合模型进行全局拟合。
[0541]
分拆式nanoluc重建分析
[0542]
用nanobit系统(普洛麦格公司)评估prsim结合分子促进它们融合至的两种蛋白二聚化的能力，该系统测量分拆式纳米萤光素酶(nanoluc)的重建以及在提供活细胞成像nano-glo nanoluc底物后产生的发光(图8)。在nanobit系统中，一个相互作用配偶体通过柔性接头与18kda的称为lgbit(代表“大块”)的nanoluc片段(seq id no：16)融合，另一个通过等效接头与1.3kda肽smbit(“小块”)(seq id no：17)融合。lgbit和smbit在没有相互作用配偶体的情况下彼此具有低亲和力(190μm)，并且不会重建形成活性萤光素酶。一旦与cid的相互作用蛋白融合并提供诱导剂，它们就会重建，并且可以测量发光。nanobit系统提供两组与lgbit和smbit融合的对照蛋白：一组组成型相互作用蛋白prkar2a：prkaca；和frb：雷帕霉素可诱导其二聚化的fkbp12对。
[0543]
为了确定hcv ns3/4a pr(s139a)和prsim组分的最佳取向，构建体，其中hcv ns3/4a pr(s139a)在n末端或c末端融合至smbit(分别是seq id no：18和19)以及每个prsim结合模块融合至lgbit的n末端或c末端的一组平行构建体(分别为seq id no：20-30和31-41)。nanobit试剂盒(普洛麦格公司)提供了一组能够生成这些构建体的载体。编码hcv ns3/4a pr(s139a)和prsim分子的dna串购自geneart，并通过pcr用引物扩增(引物的延伸包含与nanobit载体兼容的限制性位点)并通过gibson组装进行克隆。通过整个编码序列的桑格测序验证所有构建体。
[0544]
所有nanobit筛选均在96孔板中培养的贴壁hek293细胞中进行。对从组织培养瓶中酶解的细胞进行计数，并以2x104个细胞/孔接种在白色不透明底的96孔板(costar 3917)中。将板在37℃用5％co2孵育过夜，使细胞粘附。在第2天，质粒与lipofectamine ltx(赛默飞世尔公司)共转染，最终浓度为100ng/孔(50ng/质粒，一个编码smbit融合物，另一个编码lgbit融合物)。在第3天，用100nm的适当小分子诱导剂(雷帕霉素(frb：fkbp12)或西米普韦(hcv ns3/4a pr：prsim))或媒剂对照处理孔，并在添加nano-glo活细胞底物(普洛麦格公司)后立即使用envision读板仪对发光进行量化。
[0545]
转录调节测定
[0546]
idimerize调节转录系统(宝生物公司(takara))用于测试基于prsim的cid调节基因表达的能力。它基于分拆式转录因子的重建，其中dna结合结构域(dbd)和激活结构域(ad)分开，因此不会发生转录。dbd和ad分别与cid的两个蛋白组分融合，这样，只有在小分子诱导剂存在的情况下，ad才会紧密接近dbd，将转录机构募集到包含dbd识别位点的启动子。idimerize调节转录系统(宝生物公司)提供两种载体，phet-act1-2和pzfhd1-萤光素酶。phet-act1-2载体编码两种融合蛋白，代表阳性对照：一种是frb(t82l突变体；dmrc)和来自人p65的激活结构域(ad)(seq id no：42)之间的融合物；另一种是由与fkbp12(dmra)的三个串联拷贝融合的dna结合结构域(zfhd1)(seq id no：43)构成的融合蛋白。这些序列
前面有cmv启动子，并由内部核糖体进入位点(ires)分开。zfhd1载体编码萤光素酶，其前面是诱导型启动子，该启动子由最小il-2启动子上游的zfhd1 dbd识别序列的12个拷贝组成。dbd与其识别序列的结合和ad对转录机构的募集启动了萤光素酶报告基因的转录。编码hcv ns3/4a pr(s139a)的dna序列作为dna串从geneart购买并克隆到phet-act1-2载体中作为与激活结构域(替换frb)的n末端融合配偶体(seq id no：44)或作为与dna结合结构域(替换fkbp12)的c末端融合配偶体(seq id no：45)，其中在融合配偶体之间具有柔性接头(分别为tggggsggggs(seq id no：185)和sa)。随后，编码一组12个prsim分子(表2)的一个拷贝的序列作为dna串从geneart购买，并使用gibson组装克隆到上述含hcv ns3/4a pr(s139a)的phetact1-2构建体中，分别作为与dbd(seq id no：46-56)或ad(seq id no：57-67)的融合配偶体。生成了等效构建体以用fkbp12的单个拷贝替换phet-act1-2中的三个fkbp12拷贝。编码激活结构域和dna结合结构域融合蛋白的构建体的序列通过整个编码区的桑格测序得到证实。
[0547]
编码nanoluc-pest(普洛麦格公司)(seq id no：68)的dna序列作为dna串从geneart购买，并使用gibson组装克隆进行克隆到pzfhd1-2载体(宝生物公司)中的zfhd1诱导型启动子下游。通过测序确认最终构建体的核苷酸序列。
[0548]
编码medi8852的dna序列(seq id no：237和seq id no：238，由内部核糖体进入位点(ires)序列分隔)作为dna串从geneart购买并使用gibson组装克隆进行克隆到pzfhd1-2载体(宝生物公司)中的zfhd1诱导型启动子下游。通过测序确认最终构建体的核苷酸序列。
[0549]
编码三个hcv ns3/4a pr(s139a)突变体(表6)的序列作为dna串从geneart购买，并使用gibson组装作为与ad(seq id no：211-216)的融合配偶体克隆到上文中描述的phetact1-2hcv ns3/4a pr(s139a)-prsim_23(3串联拷贝)构建体中。
[0550]
所有转录调节测定均在384孔板中培养的贴壁hek293细胞中进行。对从组织培养瓶中酶解的细胞进行计数并以7.5x103个细胞/孔接种在384孔板中。将板在37℃用5％co2孵育过夜，使细胞粘附。在第2天，将细胞用phet-act1-2质粒(含有frb：fkbp12对照融合蛋白(克隆科技公司(clontech))或hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim融合蛋白)和pzfhd1质粒(编码萤光素酶(克隆科技公司)或nanoluc-pest(如上所述))使用lipofectamine ltx(赛默飞世尔公司)进行共转染。在第3天，用不同浓度的a/c异二聚体(对于frb：fkbp12对照)、西米普韦或媒剂对照处理孔，24小时后，在添加steadyglo萤光素酶底物(普洛麦格公司)或nano-glo vivazine萤光素酶底物(普洛麦格公司)后立即用envision读板仪对发光进行定量。可替代地，在第1天进行反转染，在第2天添加二聚体，并在24小时后在第3天对发光进行定量。
[0551]
通过将存在西米普韦时的信号除以不存在西米普韦时的信号，将发光读数转换为倍数变化。
[0552]
为了使用转录调节测定法定量抗体表达(medi8852)，将细胞与phet-act1-2质粒(含有hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23)和pzfhd1质粒(编码medi8852)共转染；24小时后，用不同浓度的西米普韦处理孔。在添加西米普韦后48小时，使用msd试剂盒(单重人/nhp igg同种型试剂盒(singleplex human/nhp igg isotyping kit)(麦索斯盖尔公司(mesoscale)))测定上清液中的抗体浓度。
[0553]
分拆式嵌合抗原受体激活测定
[0554]
嵌合抗原受体(car)是t细胞受体的合成的基因工程改造版本，可以通过靶特异性识别结构域(例如单链可变抗体片段(scfv))响应用户定义的靶引导免疫细胞激活。这些多结构域合成蛋白通常是通过将靶识别结构域与跨膜结构域、t细胞受体共刺激结构域和c末端cd3ζ细胞质激活结构域融合而构建的。可以通过将靶识别/跨膜/共刺激结构域和cd3ζ激活结构域表达为两个单独的蛋白来生成分拆式car。将适当的异二聚化开关组分添加到相应的蛋白，这然后将允许在靶蛋白存在的情况下通过化学诱导的异二聚化激活car。
[0555]
使用frb：fkbp12或hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23异二聚化组分生成了两个编码分拆式car的构建体。对于两个分拆式car，产生了三顺反子构建体。编码的三种融合蛋白是1)从n末端到c末端，信号肽序列，识别靶抗原的scfv片段，来自人igg4的铰链结构域，来自cd28的跨膜结构域，共刺激蛋白4-1bb激活结构域的胞内结构域和fkbp12或hcv ns3/4a pr(s139a)，2)从n末端到c末端，信号肽序列，来自人igg4的铰链结构域，来自cd28的跨膜结构域，共刺激蛋白4-1bb激活结构域的胞内结构域，frb或prsim_23，然后是cd3ζ结构域和3)用作针对转染的细胞的标志物的绿色荧光蛋白(gfp)(图15a)。融合蛋白1和2通过p2a自切割肽连接，蛋白2和3通过另一个t2a自切割肽连接。编码基于frb：fkbp12和hcv ns3/4a pr(s129a)：prsim_23的分拆式car的三顺反子dna序列购自geneart(生命技术公司(life technologies))并克隆到pcdh表达慢病毒载体(系统生物科学公司(systems bioscience))中，并通过桑格测序验证序列。frb：fkbp12分拆式car(不含识别靶抗原的scfv片段)的三顺反子dna序列作为seq id no：132提供并且hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23(也没有识别靶抗原的scfv片段)的三顺反子dna序列作为seq id no：133提供。编码识别靶抗原的scfv片段的dna序列分别插入在seq id no：132和133的核苷酸位置66和67之间。
[0556]
根据制造商的方案，使用ppackh1 hiv慢病毒包装试剂盒(系统生物科学公司)生成编码每个分拆式car的慢病毒颗粒。在存在8μg/ml聚凝胺的情况下，用慢病毒颗粒转导jurkat细胞24小时，然后将细胞更换进入新鲜的生长培养基(rpmi-1640+10％胎牛血清)并使其生长5天。分拆式car转导的jurkat细胞池基于gfp荧光进行facs分选，以在功能测试之前实现fkbp12：frb和hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23car的等效表达水平。表达分拆式car的jurkat细胞的激活可以通过car刺激后产生的白细胞介素2(il-2)来测量(smith-garvin，koretzky和jordan 2009)。采用共培养测定促进car激活，其中表达car的jurkat细胞与hepg2(抗原阳性)或a375(抗原阴性)细胞以1∶1的比例混合。将不同浓度的西米普韦或媒剂对照(dmso)添加到细胞混合物中并孵育24小时。孵育后，通过离心使细胞沉淀，并根据制造商的方案通过市售的il-2elisa(r&d系统公司(r&d systems))测试上清液的il-2表达。
[0557]
aav转导测定
[0558]
aav表达载体是通过将特定启动子和转基因元件亚克隆到源自paav-cmv(宝生物公司)的中间载体(其中去除了5’itr下游的cmv启动子，并在3’itr上游插入了wpre元件和sv40聚a序列)中产生的。
[0559]
为了生成编码诱导型萤光素酶转基因的aav，通过pcr从idimerize调节转录系统(宝生物公司)中提供的pzfhd1-萤光素酶扩增zhfd1-萤光素酶盒，并亚克隆到中间aav载体中。为了生成编码组成型表达的huil-2的aav，将编码人il-2的基因(seq id no：210)亚克
隆到中间aav载体中cag启动子的下游(图18a)。为了在分拆式转录因子的背景下生成编码prsim_23cid的aav，将编码两个由将p2a自切割肽(seq id no：208)分隔的融合蛋白(zfhd1 dna结合结构域融合至prsim_23的3个拷贝以及hcv ns3/4a pr(s139a)融合至ad)的盒亚克隆到中间aav载体中杂合ef1α-htlv-1启动子的下游。为了产生除prsim_23cid分拆式转录因子外还编码诱导型il-2转基因的aav，人il-2被亚克隆以代替pzfhd1-萤光素酶载体中的萤光素酶转基因，并zfhd1-huil-2盒通过pcr扩增并紧接编码prsim_23cid分拆式转录因子构建体的aav载体中5’itr的下游插入(图18c)。所有构建体均通过桑格测序验证。
[0560]
重组aav(raav)是通过使用标准无辅助方法对含有80％汇合度的hek293 t-17细胞的40个t-175cm2烧瓶进行三次转染而产生的。简而言之，每个烧瓶用15μg辅助质粒(含有腺病毒e2a和e4的质粒)、7.5μg携带aav itr并且编码转基因的质粒以及7.5μg aav衣壳质粒(含有aav8衣壳和相应的rep基因)使用90μg 40kd线性聚乙烯亚胺(pei)进行转染。转染后五天，从所有烧瓶中收集培养基，用2000单位benzonase核酸酶处理并在37℃孵育1小时。然后将培养基通过0.22μm过滤器过滤并使用切向流过滤(tff)浓缩至80ml的体积。在加载到逐步碘克沙醇梯度(15％/25％/40％/60％)上并在超速离心机上在ti70转子中以69000rpm在18℃下旋转1.5小时之前，使用amicon-15ml-100kda过滤器进一步浓缩该体积并用pbs进行缓冲液交换。通过在代表病毒的透明带下方的60％层中用19号注射器刺穿管，从超透明离心管中取出级分，通过每个级分的sds-page和随后的sypro ruby分析评估每个级分的纯度。合并纯级分，在amicon-15ml-100kda过滤器中用pbs进行缓冲液交换并浓缩至最终体积150μl并以等分试样在-80℃储存以避免任何重复的冷冻/解冻。使用数字液滴pcr和针对itr的taqman探针对病毒进行滴定。典型的滴度范围为1-3x10
13
个基因组拷贝(gc)/ml。
[0561]
所有raav转导测定均在96孔板中培养的贴壁hek293细胞中进行。对从组织培养瓶中酶解的细胞进行计数并以2.5x104个细胞/孔接种在96孔板中。将板在37℃用5％co2孵育过夜，使细胞粘附。在第2天，用相关的raav的2.5-5x109个gc/ml(对应于1-2x105的感染复数(moi))转导细胞。孵育48-72小时后，将细胞用不同浓度的西米普韦或媒剂对照处理并再孵育24小时。对于发光测定，添加steadyglo萤光素酶底物(普洛麦格公司)并用envision读板仪定量发光。通过将存在西米普韦时的信号除以不存在西米普韦时的信号，将发光读数转换为倍数变化。对于il-2测定，按照制造商的方案，收集上清液并使用v-plex人il-2试剂盒(麦索斯盖尔发现公司(meso scale discovery))定量il-2。
[0562]
内源基因调节测定
[0563]
为了证明基于prsim的cid的内源基因调节，采用了激活型crispr(crispra)方法。crispra依赖于使用没有核酸内切酶活性的死cas9酶(dcas9)以通过单指导rna与内源基因启动子区域内的靶位点结合。在募集转录激活剂后，内源基因的转录开始。
[0564]
对于这种方法，dcas9和vpr激活结构域(ad)是分开的，因此不会发生转录。dcas9和ad分别与cid的两种蛋白组分融合，这样，只有在小分子诱导剂存在的情况下，ad才会紧密接近dcas9，从而允许通过单指导rna(sgrna)将转录机构募集到内源基因的启动子区域。在本实例中，生成了由两个功能单元组成的激活质粒；ad与hcv ns3/4a pr(s139a)融合(seq id 226)以及dcas9与prsim-23的三个串联拷贝融合(seq id 228)。这些序列前面有cmv启动子，并由内部核糖体进入位点(ires)分开。grna质粒是通过金门(golden)组装利用
bsai产生的。grna质粒编码人u6启动子、白细胞介素-2(il-2)靶序列(gttacattagcccacactt；seq id no：229)和支架rna序列以允许cas9结合(图19a)。
[0565]
转录调节测定均在96孔板中培养的贴壁hek293细胞中进行。对从组织培养瓶中酶解的细胞进行计数并以2.5x104个细胞/孔接种。将板在37℃用5％co2孵育过夜，使细胞粘附。在第2天，使用lipofectamine 3000(赛默飞世尔公司)，使用grna∶激活质粒dna比例为2∶1，将细胞与激活质粒和grna质粒共转染。在第3天，将孔与300nm西米普韦或媒剂对照一起孵育。处理后72小时(第6天)，根据制造商的方案，收集细胞上清液并使用v-plex人il-2试剂盒(麦索斯盖尔发现公司)定量il-2。
[0566]
分子模拟以鉴定预测会降低针对丙型肝炎病毒(hcv))的西米普韦对ns3/4a蛋白酶的亲和力的突变
[0567]
hcv与西米普韦复合的共晶结构首先使用蛋白制备向导(sastry等人，2013)制备，以添加氢原子，填充缺失的侧链，为生理ph值下的氨基酸和西米普韦两者分配适当的电离状态。然后使用带有opls3e力场的薛定谔2019-2(moraca等人，2019)版本中的fep+(模块)来预测hcv ns3/4a pr中残基h57、k136、s139和r155突变后的相对结合自由能。预计会降低hcv蛋白酶对西米普韦的亲和力的突变列于表4。
[0568]
产生在分拆式转录因子控制下表达gfp-pest的稳定细胞系
[0569]
根据制造商的说明，使用crispr介导的敲入系统在aavs1基因座(origene)处进行转基因整合，生成单克隆细胞系(图26b)。最初，通过用先前线性化的phet-zfhd1-gfp-pest质粒瞬时转染获得在诱导型启动子(最小il-2启动子)控制下表达gfp-pest(seq id no：232、233)的hek293细胞。通过将800ug/ml遗传霉素添加到生长培养基(dmem+10％胎牛血清+1％非必需氨基酸)中来筛选转染的细胞。随后，用phet-act1-2-hcv ns3/4a pr(s139a)-prsim23(3个串联拷贝)质粒转染多克隆细胞，并基于应答于西米普韦处理的gfp荧光强度进行facs分选以分离单细胞克隆。最终的单克隆细胞系用作进一步产生在分拆式转录因子prsim_23 hcv ns3/4 pr wt和突变体控制下表达gfp-pest的hek293细胞的基础。
[0570]
aavs1安全港crispr介导的敲入系统采用两种质粒：crispr多合一载体、pcas-指导物-aavs1载体和具有aavs1同源臂的供体载体(paavs1-dnr-嘌呤霉素)(seq id no：234、235)。aavs1靶向序列(seq id no：236)先前已克隆到pcas-指导物质粒中。供体载体是通过gibson组装添加sbfi和hpai限制性酶切位点来设计的，以能够进一步亚克隆hcv ns3/4a pr(s139a)和突变体：prsim_23异二聚化组分。随后，phet-act1-2-hcv ns3/4a pr(s139a)-prism23(3个串联拷贝)质粒用sbfi和hpai限制性酶(新英格兰生物实验室)消化，以获得hcv ns3/4a pr(s139)-prism23 dna，将其进一步通过gibson组装亚克隆到供体载体中。hcv ns3/4a pr变体(包括hcv ns3/4pr(k136d)(seq id no：211)、hcv ns3/4pr(d168e)(seq id no：213)和hcv ns3/4pr(k136n)(seq id no：215))通过gibson组装使用sbfi和afei限制性酶切位点从phet-act1-2-hcv ns3/4pr(k136d/d168e或k136n)-prism23亚克隆到paavs1-hcv ns3/4a pr(s139a)-prism23-嘌呤霉素质粒中。通过桑格测序确认核苷酸序列。
[0571]
在单独的诱导型启动子控制下表达gfp-pest的稳定细胞用paavs1-hcv ns3/4a pr(s139a；k136d；d168e；k136n)-prism23-嘌呤霉素供体载体和pcas-指导物-aavs1进行共转染以能够靶向整合到aavs1基因座中。通过在转染后48小时向生长培养基(dmem+10％胎
牛血清+1％非必需氨基酸+800ug/ml遗传霉素)中加入1ug/ml嘌呤霉素来筛选转染的细胞。在14天筛选期后，用500nm西米普韦诱导多克隆细胞系，并根据gfp荧光强度分选facs，以分离单细胞克隆。最终的单克隆细胞系(图26c)基于应答于500nm西米普韦处理的gfp信号进行facs表征。
[0572]
流式细胞术确定来自西米普韦诱导开关的gfp-pest表达的动力学
[0573]
在分拆式转录因子系统的控制下表达gfp-pest的单克隆细胞系被酶促地从组织培养瓶中去除并接种到96孔胶原涂覆板中。第二天，细胞用100nm西米普韦处理。处理后24小时，将细胞在不含西米普韦的生长培养基中洗涤两次，并将细胞进一步维持在不含西米普韦的培养基中。在fortessa流式细胞仪(bd生物科学公司(bd biosciences))上使用流式细胞术测定去除西米普韦后不同时间点的细胞gfp荧光。对于分析，从所有实验值中减去未处理细胞的gfp荧光(相对荧光单位＝rfu)。rfu值进一步标准化为时间点“0h”，在去除西米普韦时获取。
[0574]
hcvns3/4a pr(s139a)的结构确定：prsim 57复合物
[0575]
单链hcv蛋白酶构建体——源自病毒ns4a蛋白的11个残基肽融合至具有s139a突变的ns3蛋白酶的n末端——被重新设计为具有n末端六组氨酸(6his)，然后是烟草蚀刻病毒(tev)蛋白酶切割位点(分别能够实现亲和纯化和去除标签)(seq id no：218)。设计第二构建体以表达具有指导周质分泌的n末端pelb前导序列和c末端tev位点和6his标签的prsim_57 scfv(seq id no：221)。两个序列都作为线性dna串(geneart)购买，并使用gibson组装克隆到pet-28a载体(用于细菌表达)中。最终构建体的序列通过整个编码序列的桑格测序进行验证。
[0576]
对于表达，将pet-28a质粒转化到bl21(de3)大肠杆菌细胞中，并在含有卡那霉素(50μg/ml)的板上进行筛选。对于每个表达，使用单个菌落接种5ml 2xty+50μg/ml卡那霉素培养物，该培养物在37℃生长过夜。该培养物用于接种500ml的1∶500稀释的tb自诱导培养基(formedium，补充有10ml/l甘油和100μg/ml卡那霉素)。培养物在37℃生长至od600为1.3-1.5，然后转移到25℃(hcv ns3/4a pr(s139a))或30℃(prsim_57)20小时以诱导表达。通过离心收获细胞并将沉淀储存在-80℃。
[0577]
对于hcv ns3/4a pr(s139a)的蛋白纯化，将来自500ml培养物的每个细菌沉淀解冻并重新悬浮在50ml裂解缓冲液(50mm hepes、500mm nacl、1mm tcep，ph 8.0)中。经由以30,000kpsi通过细胞破碎器来裂解细胞，并经由在4℃以50,000g离心30分钟来澄清裂解物。将澄清的上清液以5ml/min的流速加载到5ml histrap hp柱(通用健康医疗集团(ge healthcare))上。用洗涤缓冲液(50mm hepes、500mm nacl、1mm tcep、20mm咪唑、ph 8.0和50mm hepes、500mm nacl、1mm tcep、40mm咪唑、ph 8.0)依次洗涤柱并用40-400mm咪唑的咪唑梯度洗脱超过5个柱体积。通过sds-page分析级分，合并那些富含正确蛋白的级分，并用hiprep26/10脱盐柱(通用健康医疗集团)进行缓冲液交换到50mm hepes、200mm nacl、0.3mm tcep、10μm zncl2，ph 7.5(储存缓冲液)中。脱盐的蛋白级分在4℃以1∶100w/w用带有his标签的tev蛋白酶处理过夜。经由将样品通过histrap hp柱来去除tev蛋白酶，并且经由加载在superdex 75 26/600柱(其在储存缓冲液中平衡)上来精制所得的流过材料。
[0578]
prsim-57his标记的scfv样品通过细胞沉淀的渗透休克从周质中释放出来：细胞首先重新悬浮在300ml 50mm tris、1mm edta、20％蔗糖、ph 8.0中，然后沉淀并重新悬浮在
水中以施加渗透休克并释放周质内容物。通过加载到histrap excel柱上并使用与用于hcv ns3/4a pr(s139a)构建体的相同缓冲液洗涤和洗脱来纯化样品。洗脱的蛋白通过加载到hiprep 26/10脱盐柱上进行缓冲液交换在50mm hepes、200mm nacl、ph 7.5中，并在4℃以1∶50w/w用tev蛋白酶处理过夜。tev消化的材料用imac和尺寸排阻步骤进一步纯化(关于该蛋白酶)并储存在50mm hepes、200mm nacl、ph 7.5中。
[0579]
为了形成hcv ns3/4a pr(s139a)、prsim_57和西米普韦的三元复合物，将50μm浓度的hcv ns3/4a pr(s139a)与1.1倍过量的prsim_57混合，然后添加西米普韦到最终溶液中最终浓度为100μm以及3％dmso。将样品在室温孵育60分钟以达到平衡，然后在20mm hepes、200mm nacl，ph 7.5中以0.75ml/min加载到superdex75 16/600柱上。合并含有复合物的级分，浓缩至12mg/ml，分成等份试样并在液氮中快速冷冻，然后在-70℃储存。在结晶之前，将一个复合物等份试样解冻并在hp-sec柱上运行以验证复合物的完整性和单分散性。
[0580]
三元复合物使用沉滴蒸气扩散法结晶。许多专有的结晶筛选被设置在277k和293k。视情况使用沉滴和悬滴蒸气扩散实验优化来自这些筛选的命中。最终晶体在293k从由20-25％(w/v)peg 8000、100-300mm氯化镁和hepes缓冲液(ph 7.0-8.0)构成的储存溶液中获得。将晶体暴露于补充有20％(v/v)乙二醇的储存器的冷冻保护剂溶液中，然后直接在液氮中冷冻。
[0581]
在钻石光源(diamond light source)、光束线i04、低温下进行数据收集。ccp4和autobuster软件包用于解析和优化结构，程序coot用于手动构建模型。使用蛋白数据库中的hcv ns3/4a(s139a)模型通过分子置换解析结构。
[0582]
hcvns3/4a pr(s193a)突变体稳定性的计算机模拟预测
[0583]
使用薛定谔残基扫描(schroedinger residue scanning)工具(薛定谔版本2020-2：sitemap，薛定谔公司(llc)，纽约，纽约州2020)计算突变后hcv蛋白稳定性的变化。
[0584]
具有隐式溶剂项的prime mm/gbsa能量函数用于计算(li等人.，2011)。的截止值用于突变周围的蛋白细化。稳定性变化的负值与增加的突变稳定性有关。
[0585]
基于prism的杀伤开关克隆
[0586]
编码prsim23、hcv ns3/4a pr和δcard半胱天冬酶9(在三个片段之间具有短gggsg)的杀伤开关融合蛋白的序列(seq id no：223)作为载体pcdna3.1中的克隆基因从geneart(生命技术公司)购买。使用gibson组装克隆将融合蛋白亚克隆到ecori/noti消化的慢病毒载体pcdh-ef1α-mcs-(pgk-gfp-t2a-puro)(系统生物科学公司)中。为了产生半胱天冬酶9s196a突变，将通过geneart合成的将杀伤开关构建体中等效ser371改变为ala的dna片段克隆到clai/noti切割的杀伤开关载体(seq id no：230)中。通过dna测序确认基因序列。
[0587]
基于prism的杀伤开关细胞系生成
[0588]
根据制造商的说明，使用ppackh1 hiv慢病毒包装试剂盒(系统生物科学公司)生成编码杀伤开关融合蛋白(seq id no：223)或杀伤开关s196a突变融合蛋白(seq id no：230)的慢病毒颗粒。hek293细胞在8μg/ml聚凝胺存在下被转导24小时，然后将细胞更换进入新鲜生长培养基(dmem+10％胎牛血清+1％非必需氨基酸)。24小时后，通过添加2μg/ml嘌
single-cell printer)(赛特娜公司(cytena))的柱中。将细胞以每孔1个细胞接种在基质胶或玻连蛋白包被的96孔板中，其包含200μl的ml新鲜mtesr(干细胞技术公司(stemcell technologies))或含有1x revitacell(生命技术公司)的stemflex培养基。培养基在scp的第二天更换为新鲜的stemflex培养基。
[0598]
回收五个单细胞克隆，从96孔板扩增至玻连蛋白包被的24孔板，并进一步扩增并维持在玻连蛋白包被的6孔板中。对于每个单细胞克隆，收集了大约5x105个细胞。使用dneasy血液和组织试剂盒(dneasy blood&tissue kit)(凯杰公司(qiagen))分离基因组dna。使用以下引物并且使用superfi dna聚合酶(生命技术公司)扩增人b2m基因的靶向区域。pcr产物加载入1.2％琼脂糖凝胶进行电泳。凝胶可视化以通过扩增子的大小鉴定单细胞克隆的基因敲入状态(图33b)。克隆1b7、1d12、1g8和2d8在b2m基因座显示为双等位基因，并用于杀伤开关活性的功能分析。
[0599]
b2m_lha_pf2gggaggaacttcttggcaca(seq id no.：246)b2m_rha_pr2aggagagactcacgctggat(seq id no.：247)
[0600]
杀伤开关细胞活力和半胱天冬酶3功能测定
[0601]
将稳定表达基于prsim的杀伤开关融合蛋白(seq id no：223)的hek293、hct116或ht29细胞或稳定表达prsim杀伤开关s196a突变融合蛋白(seq id no：230)的hek293细胞接种到胶原包被的96孔板并且24小时后用100nm西米普韦处理。在incucyte zoom(埃森生物科学公司(essenbioscience))上使用10x或20x物镜在不同时间点获取相衬图像。
[0602]
功能性半胱天冬酶9激活半胱天冬酶3，可以通过将非荧光底物devd-amc切割为切割产物devd和荧光amc来确定这种蛋白水解活性，这样430nm处的amc荧光信号与半胱天冬酶3活性成比例。对于半胱天冬酶3测定，将细胞一式两份接种到6孔组织培养处理过的板上。24小时后，用10nm西米普韦处理重复孔之一3小时。根据制造商的说明，使用来自bd生物科学公司的半胱天冬酶3测定法一式三份分析细胞裂解物，其中进行了修改，即通过bca测定法(生命技术公司)将总蛋白输入标准化为50μg。在envision读板仪(珀金埃尔默公司(perkinelmer))上测定荧光，ex：380nm，em：430nm。为了定量，从所有来自测定样品的rfu中减去仅含有测定底物的孔的rfu(原始荧光值)。结果标准化为未转导的、经西米普韦处理的细胞。使用单向方差分析在prism(graphpad)中进行分析，然后进行多重比较。
[0603]
esc细胞中基于prsim的杀伤开关活性
[0604]
为了测试sa121 es细胞中杀伤开关的诱导，细胞以3.5x105/cm2接种，两天后通过用浓度为10nm到1um的西米普韦处理来诱导杀伤开关活性。使用incucyte s3(埃森生物科学公司)以10-20分钟的间隔对细胞进行成像；通过汇合度的图像分析来量化杀伤开关效率。
[0605]
实时细胞分析(rtca)测定以检测ips细胞中西米普韦诱导的杀伤开关活性
[0606]
将上述每个单细胞克隆的细胞以每孔40,000个细胞的密度接种在玻连蛋白包被的96孔电子微量滴定板(96，acea生物科学公司(acea biosciences inc.))中。将板与xcelligence模块连接并在37℃在5％co2的加湿培养箱中孵育，以便可以在不中断细胞正常生长的情况下监测细胞增殖指数。在24小时内每15分钟测量并记录细胞增殖指数。然后添加不同浓度的西米普韦，在8小时内每5分钟测量细胞增殖指数，然后在另外的40小时内每15分钟测量。对于每个克隆和每个条件，所有实验以一式三份孔进行。使用
xcelligence rtca software pro(acea生物科学公司)量化平均细胞指数
[0607]
实例2-鉴定作为二聚化化学诱导剂(cid)模块基础的西米普韦和hcvns3/4a pr
[0608]
为了生成从头二聚化化学诱导剂模块，我们采用了一种方法，即小分子诱导剂是临床批准的小分子，并且其中一种蛋白组分是该小分子的靶标(靶蛋白)。第二个蛋白组分(结合成员)来自结合分子库(tn3或scfv)，与小分子结合的靶蛋白与未结合的靶蛋白相比表现出极好的选择性(图1)。通过专注于已批准的小分子，我们推断，考虑到小分子在适当剂量下已被认为对人使用是安全的，因此获得监管批准的道路会更加顺畅。我们没有使用靶向人蛋白的小分子，而是决定专注于与非人蛋白结合的小分子，例如抗病毒化合物。我们推断这种方法的优点是小分子不会引起任何可能有害的中靶药理学，并且由于(未感染的)患者中不存在靶蛋白，因此不存在与小分子结合的竞争，该竞争可能会影响其药代动力学。为了确定优选的小分子/靶蛋白对，我们考虑了以下标准：
[0609]
理想的小分子标准：
[0610]
·
已批准的
[0611]
·
适用于长期给药(每天给药＞6个月)
[0612]
·
可渗透细胞
[0613]
·
口服给药
[0614]
·
不用作抗病毒药物的一线治疗
[0615]
理想的靶蛋白标准：
[0616]
·
单体
[0617]
·
小(≤30kda)
[0618]
·
靶蛋白(或其结构域)的过度表达是无毒的，或者靶蛋白可以失活但保留sm结合
[0619]
·
可以在细胞质中表达(即不与膜结合或与不dna结合)
[0620]
小分子：靶蛋白复合物标准：
[0621]
·
有理由相信结合的靶蛋白将具有与未结合的靶蛋白不同的表位
[0622]
进行了广泛的分析，鉴定的首选小分子/靶蛋白配对之一是西米普韦及其靶标，来自丙型肝炎病毒的ns3/4a蛋白酶(hcv ns3/4a pr)。西米普韦是一种口服小分子，其具有细胞渗透性，并且具有支持每日一次给药的药代动力学(pk)谱。它已与利巴韦林和聚乙二醇化干扰素联合长期(长达39个月)使用用于治疗hcv感染，并被列入who基本药物清单，表明它是一种耐受性良好且广泛使用的药物。hcv ns3/4a pr是单体，大小相对较小(21kda)，可以在细胞质中表达，并且未发现与dna相关联。此外，复合物的三维x射线晶体学(pdb代码：3kee)显示，西米普韦结合在hcv ns3/4a pr的浅底物结合槽中，暴露表面积为(图2)；我们推断这个相对较大的暴露区域与未结合的hcv ns3/4a pr有很大不同，可以鉴定复合物特异性结合分子。
[0623]
实例3-突变型hcv ns3/4a pr(s139a)保留与西米普韦的结合，尽管活性显著降低
[0624]
hcv ns3/4a pr是一种酶，其可在hcv多蛋白前体的四个连接处切割，并且已知其切割有限数量的内源性人靶标(li，sun等人，2005；li，foy等人，2005)。为了限制人细胞内的这种活性，我们推断有必要鉴定一种酶促失活但保留与西米普韦结合的hcv ns3/4a pr突变形式。hcv ns3/4a pr(s139a)的活性位点突变体先前已被证明其活性明显低于其野生型对应物(sabariegos等人2009)。为了证实这一点，并研究突变型hcv ns3/4a pr是否会保
留与西米普韦的结合，重组蛋白在大肠杆菌中表达并纯化至均质。具有n末端六组氨酸和avitag的hcv ns3/4a pr(wt(seq id no：3)和s139a突变体(seq id no：4)两者)在通过自诱导而诱导的bl21(de3)的1升培养物中分开表达。收获培养物并使用固定化金属亲和色谱和尺寸排阻色谱的组合来纯化蛋白。通过sds-page评估最终合并的样品，表明纯度水平＞99％(图3a)。使用bira酶在avitag处对纯化蛋白的等分试样进行位点特异性生物素化，并通过尺寸排阻色谱重新纯化；经质谱法验证，wt和s139a hcv ns3/4a pr都具有100％的生物素化掺入。
[0625]
在荧光肽切割测定中测试了这些重组hcv ns3/4a pr wt和s139a蛋白的酶活性，其中证实了hcv ns3/4a pr s139a突变体的活性显著降低。在大多数测试浓度下都没有检测到酶活性，只有在高nm到μm浓度下才观察到最小的活性(图3b)。
[0626]
进行等温量热法以评估西米普韦对wt和s139a hcv ns3/4a pr蛋白的结合亲和力。两种蛋白给出了非常相似的结果，获得相同的化学计量(约0.6sim/ns3结合位点)和δh值(约22kcal/mol)(图3c)。计算出的解离常数非常低(约1pm)，但相关误差非常高(10nm)，表明亲和力太高，无法在不使用竞争性配体的情况下使用该技术进行精确测量。然而，由于化学计量和δh值相同，wt和s139a hcv ns3/4a pr蛋白之间的结合亲和力很可能没有重大差异。
[0627]
基于这些数据，我们选择继续基于s139a突变蛋白的hcv ns3/4a pr：西米普韦复合物特异性结合(prsim)分子的筛选。
[0628]
实例4-hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦复合物特异性结合(prsim)分子的筛选
[0629]
在西米普韦存在下，对生物素化的hcv ns3/4a pr(s139a)进行了四轮噬菌体展示筛选。从第3轮和第4轮筛选输出中，在存在和不存在西米普韦的情况下对生物素化hcv ns3/4a pr(s139a)进行噬菌体elisa，并通过测量的荧光信号确定结合(图4a和图4b)。将噬菌体elisa结合数据与来自相同克隆的dna序列数据进行比较，一组34个scfv和28个tn3克隆(其具有在西米普韦存在下显示与生物素化hcv ns3/4a pr(s139a)选择性结合的独特序列)被选择表达用于进一步的生化研究(表1a和表1b)。此外，还选择了在西米普韦存在和不存在的情况下均显示与生物素化hcv n3/4a蛋白酶(s139a)结合的一个scfv克隆(prsim_51)和3个tn3克隆(prsim_54、prsim_55和prsim_85)用于进一步的生化研究。
[0630]
表1a
[0631]
[0632][0633]
表1b
[0634]
[0635]
[0636][0637]
*除括号中的数据是在不存在西米普韦的情况下确定的外，所有数据均在存在西米普韦的情况下报告。
[0638]
实例5-一组prsim分子对hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦复合物具有特异性
[0639]
从噬菌体展示筛选中鉴定为复合物特异性的prsim结合蛋白被大规模表达和纯化，为进一步分析提供足够的材料。对所有hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦复合物特异性prsim分子进行了均相时间分辨荧光(htrf)结合筛选(图5)并且一组8个基于tn3的分子和14个基于scfv的分子被证实为复合物特异性的，与单独的hcv ns3/4a pr(s139a)蛋白没有可检测的结合(表1(粗体)，图6)。
[0640]
为了进一步表征prsim结合分子，选择了5个scfv分子(prsim_4、prsim_57、prsim_67、prsim_72和prsim_75)和5个tn3分子(prsim_23、prsim_32、prsim_33、prsim_36、prsim_47)，并使用biacore 8k确定存在或不存在西米普韦时hcv ns3/4a pr(s139a)蛋白酶结合的动力学(表2)。所有测试的prsim结合分子都显示出对西米普韦结合的hcv ns3/4a pr(s139a)的选择性，只有三个显示出与单独的hcv ns3/4a pr(s139a)的轻微非特异性结合。选择prsim_57(图7a)和prsim_23(图7b)进行进一步表征。hcv ns3/4a pr(s139a)对prsim_57(scfv)的亲和力为15.0nm，对prsim_23(tn3)的亲和力为6.3nm。还评估了西米普韦浓度对hcv ns3/4a pr(s139a)/prsim_57/23复合物形成的影响(图7c)。西米普韦对与hcv ns3/4a pr(s139a)复合的prsim_57和prsim_23的ec
50
几乎相等；分别为4.57和4.03nm。
[0641]
表2：在西米普韦存在或不存在的情况下针对hcv ns3/4a pr(s139a)与prsim结合分子的结合测量的结合和动力学常数。存在西米普韦情况下的bsa用作对照。
[0642][0643]
n.d.＝表示由于缺乏可检测的结合而无法确定值
[0644]
#＝无结合
[0645]
*＝最小的非特异性结合
[0646]
斜体数据表示高缔合速率和/或低于预期r
max
[0647]
$＝bsa对照仅在10nm西米普韦存在时测量
[0648]
实例6-基于prsim的cid可以调节分拆式蛋白的重建
[0649]
分离出特异性结合西米普韦：hcv ns3/4a pr(s139a)复合物的prsim结合分子后，我们推断该系统可用于调节分拆式蛋白的重建。通过提供细胞内蛋白二聚化的时间和空间调节，cid可以应用于翻译后环境中，以控制期望的蛋白-蛋白相互作用或活性。存在许多在重建后获得活性的分拆式蛋白的示例，其中之一是nanobit系统(普洛麦格公司)中提供的分拆式纳米萤光素酶(图8)。我们通过hcv ns3/4a pr(s139a)融合至smbit以及prsim结合成员融合至lgbit，将该系统应用于基于prsim的cid。进行了筛选，测试了噬菌体筛选过程
中产生的五个tn3和六个scfv prsim结合模块，其中使用与lgbit的n末端和c末端融合物以及与smbit融合的hcv ns3/4a pr(s139a)的等效n末端和c末端融合物。用适当的质粒转染细胞，孵育24小时，然后用100nm西米普韦或媒剂对照(或如果是试剂盒提供的frb：fkbp12对照则100nm雷帕霉素)处理。测量发光，并计算存在西米普韦时的信号相对于不存在西米普韦时获得的信号的倍数变化(图9)。观察到总体趋势，发光的显著倍数变化通常仅在lgbit与prsim结合模块的c末端融合时观察到。对于以下prsim结合模块，在此上下文中观察到高于背景的显著信号：prsim_23(31倍)、prsim_33(9倍)、prsim_01(16倍)、prsim_06(11倍)、prsim_57(14倍)和prsim_75(51倍)。结果表明，在西米普韦存在下，许多分离的prsim结合模块可以特异性诱导来自nanobit系统的分拆式nanoluc的二聚化。
[0650]
实例7-基于prsim的cid可以通过分拆式转录因子的重建来调节基因表达
[0651]
已经证明基于prsim的cid能够通过将hcv ns3/4a pr(s139a)和prsim分子融合至分拆式nanoluc酶的不同组分来重建分拆式蛋白的活性，我们推断相同的cid可以通过与分拆式转录因子的两个结构域融合来调节转基因的表达。为了证明这一点，我们使用了idimerize调节的转录系统(宝生物公司)，其中提供了两个单独的载体；一个载体(phet-act1-2)编码与激活结构域(ad)p65融合的frb，以及与fkbp12的3个拷贝融合的dna结合结构域(dbd)zfhd1，其由ires序列分隔并且前面是组成型启动子cmv；另一个载体(pzfhd1_萤光素酶)编码在诱导型启动子控制下的萤光素酶，该启动子包含最小il-2启动子上游的12个拷贝的zfhd1识别序列。两种质粒转染进入细胞时，表达frb-ad和dbd-fkbp12蛋白；dbd在诱导型启动子上识别其靶位点，但由于没有ad紧密接近启动子，因此不会发生转录起始。只有当添加rapalog诱导剂“a/c异二聚体”时，ad才会被募集到dbd，该dbd与萤光素酶基因上游的启动子结合并开始表达。
[0652]
我们将frb和fkbp12编码序列交换为编码一个hcv ns3/4a pr(s139a)拷贝和下述11个prsim分子之一的序列，其中prsim分子融合至激活结构域的n末端或dna结合结构域的c末端(图10)。在用phet-act1-2(prsim)和pzfhd1_萤光素酶构建体转染细胞后，我们评估了基于prsim的cid在增加浓度的西米普韦的情况下调节萤光素酶基因表达的能力。不同的基于prsim的cid构建体显示了剂量依赖性基因表达调节范围为1.4到146倍(图11a和图11b，表3)，其中6个基于tn3和5个基于scfv的prsim分子显示基因表达增加了10倍以上。基于与激活结构域融合的prsim_23，基于tn3的克隆实现的最高倍数变化为106倍。有趣的是，大多数prsim克隆显示出偏好与ad或dbd融合；prsim_23的独特之处在于它能够在两个取向上提供强大的基因表达调节(与ad融合时106倍，与dbd融合时88倍)。prsim_23还显示出最低的ec50(2nm)，这意味着激活转录需要较低浓度的西米普韦。添加西米普韦后显示最高倍数变化的克隆是与dbd融合的基于scfv的prsim_57，达到146倍诱导和低ec50值(3nm)。
[0653]
表3：分拆式转录因子测定中基于prsim的cid的ec50和倍数变化值。
[0654][0655][0656]
当基于hcv ns3/4a pr(s139a)-ad和dbd-prsim_23或dbd-prsim_57的构建体在西米普韦存在下调节萤光素酶表达的能力直接与frb：fkbp12：rapalog阳性对照进行比较时，基于prsim的cid(增加100倍)优于基于frb：fkbp12的cid(增加30倍)(图12a)。在不存在诱
导剂(即西米普韦或rapalog)的情况下获得的发光值分析显示基于frb：fkbp12：rapalog的cid的水平更高，表明渗漏水平在基于prsim的cid中有所改善(图12b)
[0657]
实例8-增加与dbd融合的prsim的串联拷贝改善基因调节
[0658]
为了评估融合至dna结合结构域的靶蛋白拷贝数的影响，我们生成了基于phet-act1-2的构建体，其编码frb-ad或hcv ns3/4a pr(s139a)-ad和dbd-fkbp12或dbd-prsim_23，其中融合至dbd的蛋白作为单拷贝或作为由短肽接头分隔的三个串联拷贝被包含(图13)。当基于prsim_23的cid在西米普韦存在下调节nanoluc-pest蛋白表达的能力与frb：fkbp12：rapalog阳性对照进行比较时，我们发现当使用dbd融合配偶体的一个拷贝(55倍相比于13倍)或三个拷贝(100倍相比于55倍)时，基于prsim_23的cid表现优于frb：基于fkbp12的cid(图14a)。
[0659]
此外，当通过相同的分拆式转录因子测定评估融合至dbd的prsim_23的一个、两个或三个串联拷贝的影响并测量萤火虫萤光素酶表达的诱导时，观察到分级应答；prsim_23的一个拷贝导致最大倍数变化为364.5，而两个串联prsim_23分子导致最大倍数变化为2436，三个串联prsim_23分子进一步增加到4862倍(图14b)。
[0660]
该数据表明，可以通过募集更多的激活结构域拷贝来改善诱导型启动子对基因表达的调节，这是一种普遍现象，与所使用的cid无关。
[0661]
实例9-基于prsim的cid可以调节分拆式嵌合抗原受体(car)的活性
[0662]
通过化学诱导的异二聚化调控car活性以前被证明是调控car功能的有效方法(wu等人，2015)；(hill等人，2018)。我们假设将异二聚化prsim组分应用于car将以类似的方式促进car调节。之前描述的fkbp12：frb系统(wu等人，2015)被用作调节car功能的比较器。为了测试这一点，我们工程改造了jurkat t细胞来使用慢病毒表达系统表达prsim和fkbp12：frb调节的car(图15a)。在雷帕霉素类似物ap2196(fkbp12：frb二聚体)或西米普韦(prsim二聚体)存在的情况下，抗原结合后car的激活将导致il-2以剂量依赖性方式分泌(图15b)。il-2表达可以通过il-2特异性elisa(r&d系统公司)快速定量。这些系统的设计应该仅在适当的二聚体存在下和抗原结合后促进t细胞的激活。在prsim和fkbp12：frb调节的car系统中，分别添加西米普韦或ap2196，导致表达car的jurkats细胞在抗原阳性hepg2细胞存在的情况下发生剂量依赖性激活，如通过il-2产生所测量的(图16)。重要的是，在抗原阴性a375细胞存在的情况下，未观察到任一car的激活(图16)。虽然fkbp12：frb和prsim系统都表现出剂量依赖性激活，prsim系统表现出对car活性的更严格控制，这可以通过更低的背景il-2水平和更大的car激活动态范围来证明(图16)。两种系统都表现出可比较的最大il-2表达水平。这些数据表明，prsim异二聚化系统可用于西米普韦介导的由car启动的细胞信号通路的调节/调控。
[0663]
实例10-基于prsim的cid可以调节抗体(medi8852)的基因表达
[0664]
除了使用基于prsim的cid证明两种重组细胞内蛋白(萤光素酶(实例7)和nanoluc-pest(实例8))的基因调节之外，也研究了分泌型抗体(medi8852；seq id no：205和seq id no：206)的基因表达调节。生成了基于phet-act1-2的编码hcv ns3/4a pr(s139a)-ad和dbd-prsim_23(三个串联拷贝)的构建体以及编码pzfhd1_medi8852的构建体。当用这两种构建体转染细胞时，如使用单重人/nhp igg同种型试剂盒(singleplex human/nhp igg isotyping kit)(麦索斯盖尔公司)(图17)所测量的，medi8852的表达显示
依赖于西米普韦的剂量。
[0665]
实例11-基于prsim的cid可以通过腺相关病毒调节蛋白的基因表达
[0666]
重组腺相关病毒(faav)载体是经过充分研究的平台，其可用于将编码基于prsim_23/hcv ns3/4a pr(s139a)的cid的dna递送至细胞以控制基因治疗。一个这样的应用是调节外源转基因与实例7中描述的基于prsim_23/hcv ns3/4a pr(s139a)的分拆式转录因子组分一起或在单独的aav颗粒中递送至细胞。在这里描述的系统的上下文中，aav的包装能力将可以在同一aav载体中递送的转基因大小限制为约550bp，或者将可以在单独的aav颗粒中传递的转基因大小限制为约3.6bp。
[0667]
为了证明cid编码dna和“反式”诱导型转基因的递送，产生了两种不同的aav载体，一种编码基于prsim_23/hcv ns3/4a pr(s139a)的分拆式转录因子组分，其表达由组成型ef1/htlv杂合启动子驱动，和第二种编码在诱导型zfhd1启动子的控制下的萤火虫萤光素酶基因(图18a)。aav颗粒由这些载体产生，在用两种单独的aav8制备物转导hek293细胞后，我们观察到在添加了两种aav8颗粒制备物时基于prsim_23/hcv ns3/4a pr(s139a)的cid对萤光素酶基因表达的西米普韦剂量依赖性调节，其中萤光素酶活性诱导228倍(图18b)。
[0668]
为了证明cid和诱导型转基因可以“顺式”递送，生成了编码基于prsim_23/hcv ns3/4a pr(s139a)的转录因子组分和诱导型il-2转基因的aav8载体(图18c)。在用使用该aav载体生成的aav8颗粒转导hek293细胞后，我们观察到基于prsim_23/hcv ns3/4apr(s139a)对il-2基因表达的西米普韦剂量依赖性调节，其中观察到的最大水平为约3500pg/ml il-2(图18d)。由基于prsim_23/hcv ns3/4a pr(s139a)的cid在测试的最高浓度西米普韦诱导的il-2表达水平(3506+/-817pg/ml)与编码在组成型cag启动子控制下的il-2转基因的对照aav8载体所达到的(2606+/-189pg/ml)相当(图18e)。
[0669]
因此，使用基于单或双aav的系统证明了基于prsim的cid通过aav转导控制基因表达的能力。
[0670]
实例12-基于prsim的cid可以调节内源基因的转录
[0671]
已经证明基于prsim的cid可以通过融合至分拆式转录因子的两个结构域来调节转基因的表达，我们推断基于prsim的cid也可以调节内源基因的表达。使用化学诱导的异二聚化系统来调节内源基因活性以前已被证明是调控基因调节的有效方法(foight等人，2019)。因此，我们假设将异二聚化prsim组分应用于激活型crispr(crispra)系统可以以类似的方式促进内源基因调节。
[0672]
为了证明这一点，化脓性链球菌cas9酶(dcas9)的非活性形式和由三个转录激活因子(vp64、p65和rta；vpr)的融合物组成的激活结构域(ad)分别融合至cid的两个蛋白组分(分别为prsim_23和hcv ns3/4a pr(s139a)的三个拷贝)，这样，只有在小分子诱导剂存在的情况下，ad才会紧密接近dcas9。基于prsim的cid和靶向白细胞介素2(il-2)启动子的指导rna(grna)的共转染允许dcas9与il-2启动子上的靶位点结合。在施用prsim二聚体(西米普韦)后，ad和相关转录机构随后被募集到内源il-2基因的启动子区域，从而启动转录(图19a)。因此，系统的激活可以通过il-2的产生进行测量，并通过il-2特异性细胞因子测定(msd)进行量化。
[0673]
在瞬时表达prsim调节的分拆式dcas9/ad盒和靶向il-2的grna的hek293细胞中，西米普韦的添加导致il-2的分泌。(图19b)。重要的是，在仅表达系统的一部分(仅grna或仅
prism-dcas9)或表达非il-2靶向的grna的细胞中未检测到il-2。
[0674]
该数据表明prsim异二聚化系统可用于西米普韦介导的内源基因表达调节。
[0675]
实例13-hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23和hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_57复合物特异于西米普韦
[0676]
已经证明活性开关复合物的形成依赖于西米普韦的存在，我们想测试这种相互作用相对于hcv蛋白酶的替代小分子抑制剂的特异性。已知有几种小分子抑制剂结合hcv ns3/4a蛋白酶并已获准用于人使用。评估了一组此类小分子诱导hcv ns3/4a pr(s139a)和prsim_23或prsim_57之间复合物形成的能力。它们是格来瑞韦、波普瑞韦、特拉瑞韦、阿舒瑞韦、维卢瑞韦、伐尼瑞韦、那拉瑞韦、戈雷瑞韦和达诺瑞韦。
[0677]
进行均相时间分辨荧光(htrf)结合测定(图20)以确定当西米普韦被替代性hcv pr抑制剂小分子取代时形成的hcv ns3/4apr(s139a)：prsim_23和hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_57复合物的水平。我们发现复合物形成的诱导对西米普韦具有特异性，因为没有一种hcv pr抑制剂可以与hcv ns3/4a pr(s139a)和prsim_23，或hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_57形成复合物。
[0678]
该数据表明，其他hcv ns3/4a pr抑制剂小分子的施用，例如在hcv感染个体的情况下，将无法形成活性hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23复合物，以及hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23复合物对西米普韦具有独特的特异性。
[0679]
实例14-hcv ns3/4a pr中的残基预计会降低对西米普韦的亲和力
[0680]
西米普韦对hcv ns3/4a pr的亲和力非常高(实例3；图3b)，这可能会影响一旦西米普韦给药停止，复合物可以解离的速率。对西米普韦亲和力降低的hcv ns3/4a pr变体的鉴定可以在调控复合物的半衰期方面提供一些灵活性，允许这种基于prsim的cid在必要时更快速地灭活，例如如果遇到不良事件并需要快速逆转活性时。
[0681]
为了鉴定丙型肝炎病毒(hcv)蛋白酶蛋白上降低西米普韦结合的突变，hcv ns3/ns4a与西米普韦复合的共晶结构(pdb：3kee，分辨率：)被首先分析。分析表明，hcv ns3/ns4a：西米普韦界面由25个hcv残基构成，其中6个残基有助于氢键和盐桥相互作用，12个是表面暴露的(图21)。通过根据以下两个标准进行筛选，残基被列入详细突变分析的候选名单：首先，省略了暴露于溶剂的残基，以避免诱变对prsim分子与复合物的结合产生任何负面影响；其次，包括在突变为丙氨酸后表现出预测的自由能变化＞1kcal/mol的那些。然后使用自由能扰动计算来预测这些残基(h57、k136、s139和r155)的相互作用侧链突变后的相对结合自由能。预计会降低hcv蛋白酶对西米普韦的亲和力的突变列于表4。尽管fep+丙氨酸扫描分析仅预测d168的预测结合自由能的相对较小变化，但由于其已公布的在抗西米普韦中的作用，我们还在该位置通过实验评估了3个突变(d168a、d168e和d168q)。
[0682]
表4：关键结合残基突变后，hcv ns3/ns4a蛋白酶对西米普韦的结合自由能的预测变化。
[0683][0684][0685]
实例15-hcv ns3/4a pr中的突变影响hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦：prsim_23复合物的形成
[0686]
鉴定了一组预计会降低hcv ns3/4a pr对西米普韦亲和力的突变体后，我们推断，如果突变如预测地影响了hcv ns3/4a pr对西米普韦的亲和力，这将影响hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦：prsim_23复合物的形成。为了评估这些突变对hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦：prsim_23复合物形成的影响，我们在均质时间分辨荧光(htrf)结合测定(图22)中测量了在增加浓度的西米普韦存在下复合物形成的量。
[0687]
我们发现在r155、h57和s139位置产生的突变是不能容忍的，并且没有形成复合物。在位置k136进行的突变导致能形成复合物的hcv pr变体，复合物形成的程度达到与用hcv pr“wt”观察到的相同最大值。残基d168处的突变也是可以容忍的，但在等效的hcv pr浓度下形成的复合物数量减少。对于西米普韦观察到的ec50随k136n和k136d突变体以及位置d168的所有突变体增加，表明对于这些突变体而言在复合物中存在不同的亲和力。
[0688]
实例16-一些hcv ns3/4a pr突变体显示出对西米普韦的亲和力降低
[0689]
鉴定了位置k136和d168处的突变导致能形成复合物的hcv pr变体后，选择了三个突变体(k136d、k136n和d168e)进行进一步表征。为了评估对西米普韦亲和力的影响，使用octet red384确定了西米普韦与hcv ns3/4a pr
‘
wt’(s139a)蛋白酶和三个突变体结合的动力学(图23，表5)。k136d突变对西米普韦亲和力的影响最大，与hcv ns3/4a pr
‘
wt’(s139a)相比，亲和力降低了约3.5倍。k136n和d168e导致亲和力降低约2倍。亲和力的变化主要是由解离速率(k
off
)的增加驱动的。
[0690]
表5：使用octet red384测量的西米普韦与hcv ns3/ns4a蛋白酶突变体的结合的结合和动力学常数。
[0691][0692]
数据是平均值
±
s.d.。
[0693]
实例17-由hcv ns3/4a pr(s139a)中的突变引起的西米普韦亲和力变化影响hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦：prsim_23复合物的形成
[0694]
为了进一步表征三种突变蛋白酶，还使用biacore 8k评估了西米普韦浓度对突变hcv ns3/4a pr(s139a)/prsim_23复合物形成的影响(图24a，表6)。与西米普韦亲和力降低(表5)一致，hcv ns3/4a pr k136d/西米普韦/prsim_23复合物中西米普韦的ec
50
已增加至131.5nm，高于wt复合物约30倍。与“wt”相比，k136n突变还导致针对西米普韦的ec
50
更高，尽管效果小于k136d突变。然而，d168e突变与“wt”复合物相比具有几乎相等的ec
50
；分别为3.69和4.53nm。
[0695]
hcv ns3/4a pr突变体在存在或不存在西米普韦的情况下与prsim_23结合也使用biacore 8k测定(图24b-e)。测试的所有蛋白酶突变体都显示出与单独prsim_23的类似轻微非特异性结合，如先前针对hcv ns3/4a pr
‘
wt’(s139a)所示(表2，图7b)。由于西米普韦的不同亲和力以及突变对hcv ns3/4a pr/西米普韦/prsim_23复合物形成的不同影响(图24a)，不同固定浓度的西米普韦用于每个hcv ns3/4a pr以在biacore芯片上形成复合物。针对每个突变体的西米普韦浓度被确定为针对西米普韦的各自ec
50
的5-6x(表6)。含有突变hcv ns3/4a pr的复合物都比hcv ns3/4a pr
‘
wt’(s139a)复合物具有更低的亲和力(表7)。hcv ns3/4a pr
‘
wt’(s139a)对prsim_23的亲和力为5.4nm(图24b)，而hcv ns3/4a pr k136d(图24c)和hcv ns3/4a pr k136n(图24d)的亲和力相比于
‘
wt’降低了约6-7倍(表7)。hcv ns3/4a pr d168e对prsim_23的亲和力为14.7nm(图24e)，亲和力比
‘
wt’蛋白酶低约3倍。
[0696]
表6：西米普韦诱导突变hcv ns3/4a pr/prsim_23结合分子异二聚化的西米普韦ec
50
值。
[0697][0698]
表7：在西米普韦存在下针对突变型hcv ns3/4a pr与prsim_23结合分子的结合测量的结合和动力学常数。
[0699][0700]
数据为平均值
±
s.d.，n＝3
[0701]
实例18-hcv pr的小分子抑制剂可以通过与西米普韦竞争结合hcv pr变体而不是hcv pr“wt”来破坏prsim 23复合物
[0702]
证明hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23复合物形成对西米普韦具有特异性(实例13)后，我们继续研究我们的小分子hcv pr抑制剂组是否能够通过与西米普韦竞争结合hcv pr来破坏hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦：prsim_23复合物。我们发现，当在均相时间分辨荧光(htrf)结合测定中与西米普韦一起添加小分子抑制剂时，这些小分子的一个子集能够抑制hcv ns3/4a pr(s139a)：prsim_23复合物形成。然而，当在添加小分子抑制剂之前将西米普韦与hcv ns3/4a pr(s139a)预孵育时，未观察到显著的复合物抑制(图25a)。
[0703]
为了进一步表征对hcv ns3/4a pr进行的突变，我们研究了小分子是否能够破坏预先形成的突变型hcv pr：西米普韦：prsim_23复合物。在位置136处发生突变的情况下，使
用小分子抑制剂的一个子集(阿舒瑞韦、维卢瑞韦、伐尼瑞韦、戈雷瑞韦、达诺瑞韦和格来瑞韦)观察到对突变型hcv pr：西米普韦：prsim_23复合物更显著的抑制，但使用其他小分子抑制剂(那拉瑞韦、波普瑞韦和特拉瑞韦)时没有观察到(图25b)。抑制程度取决于所产生的特定突变。尽管针对西米普韦具有与hcv pr“wt”相似的ec80，但用k136h观察到了大约75％抑制。对于k136n而言观察到几乎完全抑制，对于k136d而言观察到完全抑制。对于在位置168处具有突变的所有hcv pr变体而言观察到hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦：prsim_23复合物的完全抑制。
[0704]
其他小分子抑制剂(阿舒瑞韦、维卢瑞韦、伐尼瑞韦、戈雷瑞韦、达诺瑞韦和格来瑞韦)与西米普韦“竞争”并破坏prsim_23和hcv ns3/4a pr突变版本之间的复合物的能力提供了快速灭活任何基于prsim的cid并关闭转基因表达或治疗活性的机会。此外，其他抑制剂(那拉瑞韦、波普瑞韦和特拉瑞韦)无法与西米普韦竞争hcv ns3/4a pr结合，这为开发由这些小分子诱导的基于正交hcv ns3/4a pr的分子开关提供了机会。
[0705]
实例19-掺入分拆式转录因子系统的hcv ns3/4a pr突变体保留了调节基因表达的能力
[0706]
为了评估hcv ns3/4a pr的突变对基因调节的影响，我们生成了基于phet-act1-2的构建体，其编码hcv ns3/4a pr(s139a)-ad突变体和dbd-prsim_23(三个串联拷贝)。在用这些phet-act1-2(hcv ns3/4a pr(s139a)-ad突变体&dbd-prsim_23(三个串联拷贝))构建体或“wt”构建体(hcv ns3/4a pr(s139a)-ad&dbd-prsim_23(三个串联拷贝))与报告子构建体pzfhd1_萤光素酶转染细胞后，我们评估了基因表达。确定了在增加浓度的西米普韦存在下调节萤光素酶基因表达的能力。所有prsim hcv ns3/4a pr(s139a)-ad突变体均表现出萤光素酶的剂量依赖性基因表达，尽管相对于“wt”hcv ns3/4a pr(s139a)-ad，最大倍数变化略有减少和ec50增加(图26和表8)。
[0707]
来自实例14-19的组合数据表明，在需要通过施用“竞争性”小分子hcv pr抑制剂快速逆转基于cid的活性的情况下，基于包含突变型hcv ns3/4a pr的prsim的cid可以提供基于hcv ns3/4a(s139a)“wt”的cid的替代物。
[0708]
表8：分拆式转录因子测定中针对hcv ns3/4a pr变体的ec50和倍数变化值。
[0709][0710]
为了评估hcv ns3/4a pr(s139a)突变体(k136d、d168e、k136n)的亲和力降低/解离速率增加是否会影响在去除西米普韦后关闭基因表达的速率，使用活细胞时程测定进行基于细胞的测定。生成单克隆稳定细胞系，其中短寿命绿色荧光蛋白(gfp-pest，半衰期约2小时)的表达置于由hcv ns3/4a pr(s139a)-ad变体&dbd-prsim_23(三个串联拷贝)构成的分拆式转录因子的控制之下。通过用西米普韦处理24小时诱导gfp表达，然后去除西米普韦并测定去除后时间点的gfp荧光。“wt”s139a经24小时保持高gfp荧光。这表明一旦以西米普
韦依赖性方式形成，含有hcv ns3/4a pr(s139a)的转录因子复合物会在很长一段时间内保持稳定，以驱动持续的gfp-pest表达，这不需要在培养基中持续存在过量的西米普韦。然而，经同一时间段，所有三个突变体(k136d、k136n、d168e)在去除西米普韦后15-24小时内恢复到天然的非表达状态，这表明使用hcv ns3/4a pr(s139a)-ad突变体&dbd-prsim_23(三个串联拷贝)相比于hcv ns3/4a pr(s139a)-ad
‘
wt’&dbd-prsim_23(三个串联拷贝)形成的转录因子复合物的稳定性降低。
[0711]
该数据表明，通过降低西米普韦对hcv ns3/4a pr突变体的亲和力，有可能改变基因表达的动力学，使得能够与使用基于“wt”hcv ns3/4a pr的cid相比时以分拆式转录形式更快地停止基因表达。
[0712]
实例20-hcv ns3/4a pr(s139a)：西米普韦：prsim_57复合物的晶体结构揭示小分子触发的二聚化的机制
[0713]
西米普韦通过与蛋白酶表面的口袋结合并产生被prsim_57特异性识别的新表位，诱导hcv ns3/4a pr(s139a)和scfv分子prsim_57的异二聚体的形成。为了理解这种异二聚化事件背后的分子机制，确定了蛋白酶、scfv和西米普韦之间复合物的晶体结构。为了推导出结构，蛋白酶的形式和带有烟草蚀刻病毒(tev)可切割his标签的prsim_57 scfv两者在bl21(de3)大肠杆菌中分别表达。使用固定化金属亲和色谱和尺寸排阻色谱的组合将蛋白纯化至均质，并通过tev蛋白酶处理去除标签。为了形成三元复合物，将蛋白酶与过量的prsim_57和西米普韦一起孵育，并使用尺寸排阻色谱法从非复合材料中纯化所得复合物。合并含有纯复合物的级分并浓缩至12mg/ml并进行晶体试验。该复合物通过沉滴蒸气扩散结晶，并以同步加速器x射线源从晶体收集x射线衍射数据。使用分子置换以hcv ns3/4a pr(s139a)的apo形式的结构作为搜索模型解析结构。
[0714]
三元复合物的所有三个组分在电子密度方面都清晰可见(图27a)。西米普韦以相同的姿势和通过先前观察到的相同相互作用(pdb id 3kee)与hcv ns3/4a pr(s139a)结合。该结构表明，prsim_57 scfv产生的大部分相互作用直接针对蛋白酶中的残基，与西米普韦的接触有限。scfv在西米普韦周围形成主要疏水性的口袋(包括phe77、ile74、ile125和trp249的侧链)，夹住它的任一例并与蛋白酶接合。结合由scfv互补决定区(cdr)环hcdr2、hcdr3和lcdr3支配。
[0715]
可以在prsim_57和hcv ns3/4a pr(s139a)之间鉴定以下相互作用(图27b)：1)asp94(hcv ns3/4a pr)的侧链羧基与ile125和thr126(prsim_57)的主链氮原子以及与thr126的侧链羟基相互作用。2)tyr71(hcv ns3/4a pr)的侧链羟基与his251和trp249(prsim_57)的侧链相互作用。3)val93(hcv ns3/4a pr)和trp249(prsim_57)的侧链之间产生疏水相互作用。4)glu254(prsim_57)与gly75和thr76(hcv ns3/4a pr)的主链氮原子之间的水介导的相互作用。prsim_57和西米普韦之间的主要相互作用是西米普韦喹啉部分与hcdr2(prsim_57)中phe77的侧链的相互作用。
[0716]
实例21-基于prrim的cid可以调节凋亡蛋白的活性以控制细胞死亡
[0717]
一旦治疗细胞被施用，在出现不受控制的增殖或不良事件时，“远程控制”治疗细胞的能力提供安全性网。控制这些细胞的一种方法是赋予它们所谓的“杀伤开关”，这样一旦它们完成其功能或构成安全风险，就可以随意愿移除它们。因此，在体外生成并测试了基于prsim的、对西米普韦有应答的基于半胱天冬酶9的杀伤开关。半胱天冬酶9的同二聚化
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