用于检测采收后产品中真菌致病性的装置和方法1.序列表2.本技术包含已经以asciitxt.格式电子地提交的序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ascii副本命名为序列列表(seq.listing)1371-t-21-pct，大小为2kb。
技术领域：
：3.本发明涉及农业领域，且更具体地本发明涉及用于检测采收后果实中处于它们的生命周期潜伏期的真菌的基于cmos的传感器。
背景技术：
：：4.采收后食物损失的问题是一个主要关心的问题，据估计全世界采收作物的40％至50％主要是由于由真菌引起的生理退化和腐烂(参见“marketandtradeimpactsoffoodlossandwastereduction”，okawa，k.，oecdfood，agricultureandfisheriespapers，no.75，oecdpublishing，巴黎，2015)。用于检测采收后病原性真菌的常规技术(即pcr和elisa)灵敏且精确，但成本高，具有复杂的方案并且不是便携式的，使得这些应用对于田地或温室中的农业用途而言不是最佳的。因此，这些应用并不常用于包装厂。此外，虽然上述技术可以指示这些微生物在作物中的存在，但是没有评估它们的致病性状态。来自几个属的真菌可能导致新鲜产品的采收后腐烂(参见“thetop10fungalpathogensinmolecularplantpathology”.dean，r.等人，molecularplantpathology13,414-430，2012；“challengesinpostharvestmanagementoffungaldiseasesinfruitsandvegetables-areview.”rahul，s.n.等人，southasianj.foodtechnol.environ1，126-130，2015和“exploitationofnaturalproductsasanalternativestrategytocontrolpostharvestfungalrottingoffruitandvegetables”，tripathi,p.和dubey,n.k.,postharvestbiologyandtechnology32，235-245，2004)。通常，在渗透入未成熟果实后，真菌保持静止，并且仅在储存和成熟后转换到其致病状态，引发主动攻击。静止感染是微观的，并且在包装或随后的运输期间不能在视觉上检测到(参见“post-harvestbotrytisinfection:etiology，developmentandmanagement，botrytis:biology，pathologyandcontrol.”droby，s.和lichter，a.，springer，第349-367页，2007，2014。“chapter2-penicilliumdigitatum,penicilliumitalicum(greenmold,bluemold),in:bautista-s.(ed.),postharvestdecay.”palou,l.,academicpress,sandiego,第45-102页，2014和“quiescentandnecrotrophiclifestylechoiceduringpostharvestdiseasedevelopment”,prusky,d.,alkan,n.,mengiste,t.,fluhr,r.,annualreviewofphytopathology51，155-176，2013)。5.具有超过470种广泛分布的宿主属(芒果、鳄梨和草莓，仅举几个例子)，胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)是采收后果实中最常见的病害因子之一。在分生孢子萌发后，胶孢炭疽菌(c.gloeosporioides)通常经历三个不同的发育阶段：附着胞(渗透)、静止(潜伏阶段)，和坏死营养阶段，坏死营养阶段导致腐烂。在第一阶段，胶孢炭疽菌(c.gloeosporioides)渗透入果实角质层，然后它保持处于延长的静止状态直至果实成熟。在果实成熟时，真菌病原体转换到坏死营养阶段，导致果实中的炭疽病。在这些不同阶段期间，真菌病原体显著上调阶段特异性转录物(参见“simultaneoustranscriptomeanalysisofcolletotrichumgloeosporioidesandtomatofruitpathosystemrevealsnovelfungalpathogenicityandfruitdefensestrategies”，alkan，n.等人，newphytologist205，801-815，2015)。6.使用生物传感器进行rna检测可能是识别作物中病原体存在的最容易、最便宜和最快的方法。典型的生物传感器由三个部分构建：生物报告器、换能器和接口，后者将第一部分固定在第二部分上。质量平衡、光学和石英晶体微天平是适于dna检测的最常用的测量方法。光学领域中的最新进展已经导致基于互补金属氧化物半导体(cmos)技术的敏感、低成本和小尺寸光电检测器的开发(参见“cmoscircuitdesign，layout，andsimulation”，baker，r.j.，theinstituteofelectricalandelectronicsengineers，2005.，以及“detectionofquiescentfungiinharvestedfruitusingcmosbiosensor：aproofofconceptstudy”，zamir，d.等人，talanta，2020)。基于cmos的生物传感器已经用于环境空气和水样品中的细菌检测以进行毒性评估测试，并且用作pcr过程监测工具(参见“ahighlyintegratedreal-timedigitalpcrdeviceforaccuratednaquantitativeanalysis”，zhou，s.等人，biosensorsandbioelectronics128，151-158，2019)。7.属于jonathanm.rothberg的ep专利文献2304420a4公开了涉及用于分析物检测和尤其是病原体核酸的测量的大规模fet阵列的方法和设备。8.属于maxwiki的美国专利文献8213017公开了一种用于生成和计量光学信号的分析系统和方法。该系统可以包括cmos阵列，并且用于确定化学、生物化学或生物分析物，包括病原体的核酸。9.属于donstraus的ca专利文献2460212c公开了用于快速且灵敏地识别医疗、工业和环境样品中的细胞和病毒靶标的方法。该方法包括结合细菌、病毒和真菌的核酸。10.因此，对于便携式、灵敏、廉价和简单的适于农业用途的应用存在未满足的需求，其不仅将在引起腐烂之前检测作物中微生物的存在，而且还在进行广泛损害之前评估它们在其采收后果实中的静止阶段期间的存在。附图说明11.附图被包括以提供对本发明的进一步理解，并且被并入本说明书中并构成本说明书的一部分，附图图示了本发明的实施例，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。12.图1描绘本发明的系统和测量过程的示意图；13.图2描绘银沉积反应随时间对本发明系统的内表面和外表面上的银固定的影响；14.图3描绘系统对核酸序列的特异性的图形表示；15.图4描绘系统对不同浓度的特定dna序列的响应性的图形表示；16.图5描绘在不同的胶孢炭疽菌感染阶段下系统对总果皮rna的响应性的图形表示；17.图6描绘不同沉积条件对银层形成效率的影响；18.图7描绘用脱脂乳进行阻断处理对银层稳定性的影响；19.图8描绘用牛血清白蛋白(bsa)阻断处理对银层稳定性的影响；20.图9描绘阻断步骤对本系统表面上的dna非特异性吸收的影响；21.图10描绘阻断步骤对本系统的退火过程特异性的影响；22.图11描绘沉积反应持续时间对本系统的银层形成的影响；23.图12描绘沉积反应持续时间对金属增强荧光(mef)放大的影响；24.图13描绘优化步骤对本发明的系统对胶孢炭疽菌真菌的敏感性的影响；25.图14描绘定殖于番茄果实的链格孢、灰葡萄孢和扩展青霉在它们的静止和坏死营养阶段的真菌转录物的相对表达；26.图15描绘系统对不同发育阶段的灰葡萄孢的响应性的图形表示；27.图16描绘系统对不同发育阶段的链格孢菌的反应性的图形表示；以及28.图17描绘系统在不同发育阶段对扩展青霉的响应性的图形表示。技术实现要素：29.因此，本发明的一个目的是公开一种用于检测植物组织中真菌的系统，该系统包括：30.a.测量换能器；31.b.表面；以及32.c.固定到表面上的核酸链；33.其中所述系统与混合物接触，所述混合物包含：34.(i)来自真菌的靶标rna序列；以及35.(ii)与信号产生组分缀合的报告链；36.进一步地，其中来自真菌的靶标rna序列与固定的核酸链退火，报告链与靶标rna序列结合，信号产生组分被配置为产生可检测的反应，进一步地，其中系统被配置为指示真菌的发育阶段。37.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中真菌选自由以下所构成的组：稻瘟病菌、灰葡萄孢、胶孢炭疽菌、柄锈菌属、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、禾白粉菌、禾生球腔菌、炭疽菌属、玉米黑粉菌、蒂腐色二孢菌、链格孢、指状青霉、扩展青霉、鹦鹉热盘孢、果腐链核盘菌、核果链核盘菌、树突新丝核菌、匍匐茎根霉和林氏黑锈菌。38.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中真菌选自由以下所构成的组：灰葡萄孢、链格孢、胶孢炭疽菌和扩展青霉。39.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中所述植物组织是采收后的产品。40.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中测量换能器选自由以下所构成的组：光学装置、电化学装置、声学装置、热装置、质量平衡装置及其任何组合。41.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中，光学装置选自由以下所构成的组：cmos、ccd、pmt、读板器、相机及其任意组合。42.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中电化学装置选自由以下所构成的组：电极，电极单元，具有电导、电流、阻抗或电位成分的丝网印刷电极及其任何组合。43.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中表面选自由以下所构成的组：二氧化硅、金属、玻璃、塑料、有机聚合物、无机聚合物、硫醇化颗粒、纳米材料、改性二氧化硅及其任何组合。44.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中固定到表面上的核酸链通过选自由以下所构成的组的固定技术而固定到表面：吸附、共价键合、包埋、交联、自组装、包封及其任何组合。45.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中固定到表面上的核酸链和报告链选自由以下所构成的组：脱氧核糖核酸、核糖核酸、包含脱氧核糖核酸和核糖核酸的杂交链及其任何组合。46.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中信号产生组分选自由以下所构成的组：酶、基于荧光的分子、基于发光的分子、压电生物传感器、测温生物传感器、光学生物传感器、亲和结合分子、比色材料及其任何组合。47.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中所述酶是辣根过氧化物酶。48.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中所述靶标rna序列是真菌生命周期中不同发育阶段的表征。49.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中发育阶段选自由以下所构成的组：附着胞、静止和坏死营养阶段。50.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中所述靶标rna序列是烯酰-coa-水合酶/异构酶。51.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中所述靶标rna序列是seqidno3。52.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中所述报告链是seqidno1，其在5’端与辣根过氧化物酶缀合。53.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中固定到表面上的核酸链是seqidno2，其包含在5'末端的异硫氰酸荧光素和在3'末端的硫醇基团。54.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中所述系统配置为检测浓度为约3.3nm的来自真菌的靶标rna。55.本发明的另一个目的是公开如上所述的系统，其中，该系统是便携式的。56.本发明的另一个目的是公开一种用于在植物组织中检测真菌和评估真菌接种率的方法，包括以下步骤：57.a.获得权利要求1的系统；58.b.从所述植物组织获得rna样品；59.c.将所述rna样品和报告链加载到权利要求1所述的系统上；60.d.洗涤根据权利要求1所述的系统；61.e.进行反应以检测信号；62.f.测量所述信号；以及63.g.将所述信号与所述真菌的存在或量以及所述真菌所处的发育阶段相关联。64.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中所述植物组织是采收后的产品。65.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中检测信号的反应选自由以下所构成的组：基于荧光的反应、基于发光的反应、酶-底物反应、抗原-抗体反应、基于亲和力的反应及其任何组合。66.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中用于检测信号的反应是由辣根过氧化物酶对底物的氧化。67.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中底物选自由以下所构成的组：鲁米诺、荧光红(amplexred)(10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪)、高香草酸、tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)、opd(邻苯二胺)、aec(3-氨基-9-乙基咔唑)、abts(2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))和dab(3,3'-二氨基联苯胺)。68.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中真菌的发育阶段选自由以下所构成的组：附着胞、静止和坏死营养阶段。69.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中所述真菌选自由以下所构成的组：稻瘟病菌、灰葡萄孢、胶孢炭疽菌、柄锈菌属、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、禾白粉菌、禾生球腔菌、炭疽菌属、玉米黑粉菌、蒂腐色二孢菌、链格孢、指状青霉、扩展青霉、鹦鹉热盘孢、果腐链核盘菌、核果链核盘菌、树突新丝核菌、匍匐茎根霉和单株黑锈菌。70.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中所述真菌选自由以下所构成的组：灰葡萄孢、链格孢、胶孢炭疽菌和扩展青霉。71.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中通过定量或定性手段执行测量。72.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中所述报告链是seqidno1，其在5'末端与辣根过氧化物酶缀合。73.本发明的另一个目的是公开如上所述的方法，其中真菌接种物的评估和真菌生命周期中的发育阶段被配置为与数据挖掘工具和生物信息学工具组合。具体实施方式74.提供以下描述以及本发明的所有章节，以便使本领域任何技术人员能够利用本发明，并阐述由发明人预期的实施本发明的最佳模式。然而，各种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，因为本发明的一般原理已经被具体定义为提供基于测量转导和核酸退火的装置，以及用于检测采收产品中不同发育阶段的真菌的方法。本发明公开了一种系统，其包括与特定mrna序列偶联的基于cmos的传感器，所述特定mrna序列在真菌(诸如胶孢炭疽菌(c.gloeosporioides))中在其静止阶段期间上调。鉴定过程基于夹心方法，其中将与真菌mrna序列互补的链固定在cmos表面上。在靶标分析物(其可以是例如，以非限制性方式，来自采收后产品的样品)的存在下，这些互补链与样品中发现的mrna转录物特异性退火。真菌静止mrna序列的量使用报告链评估，所述报告链进一步添加至该系统并与静止mrna转录物退火。这产生了包含mrna和报告链的表面复合物，其在许多洗涤步骤后保留在cmos表面上。然后通过常规方法评估信号产生，例如与报告链缀合的辣根过氧化物酶(hrp)酶的发光酶促反应。该技术不仅允许在新鲜农产品中检测病原体，而且还在水果进一步发育和坏死农产品之前鉴定水果内未见的静止真菌。75.此外，本公开描述优化和校准步骤，使得本发明的系统更灵敏和更准确，因此能够检测低浓度的真菌核酸(从约3.3nm开始)。76.如本文下文所用，术语“约”是指比所定义的量度低或高至多25％的任何值。77.如本文下文所用，术语“发育阶段”是指真菌生命周期中的任何不同阶段。这可以是例如附着胞、静止或坏死营养阶段。78.如本文下文所用，术语“附着胞(appressoria)”或“附着胞(appressorium)”是指特化的细胞结构，通常在发育早期的各种致病真菌中发现，其感染植物。附着孢是由萌发分生孢子形成的器官，并且专用于允许使用膨压渗透到宿主的表面。79.如本文下文所用，术语“静止”是指真菌生命周期中的阶段。在穿透植物宿主后，真菌可以在植物组织内保持潜伏(或休眠)数周或数月，这在没有复杂设备的情况下难以检测或监测。真菌可以在植物组织内保持无活性，或缓慢发育(取决于果实的成熟阶段)。通常在储存和成熟后，如果条件变得有利于真菌感染，则真菌转换到坏死营养阶段并开始快速生长，在宿主组织中形成病变和腐烂。作为真菌生命周期中的任何不同阶段，独特的mrna转录物在静止阶段期间上调，因此转录地表征它。80.如本文下文所用，术语“坏死营养阶段”是指真菌生命周期中的阶段，其在静止阶段之后。在此阶段期间，真菌感染变得高度活跃，在植物组织内进展并最终引起腐烂和坏死病变。81.如本文下文所用，术语“测量换能器”是指能够捕获信号并将其转换为可测量值的任何部件。测量换能器可以是例如光学换能器、电化学换能器、声学检测器、热检测器、质量平衡装置和本领域已知的任何其他换能器。82.如本文下文所用，术语“光学转换器”是指能够读取或捕获由本发明的系统产生的光信号并将其转换为数值的任何光电检测器或相机，所述数值表示在测试植物样品中发现的真菌mrna转录物的浓度。可以以非结合方式从以下选项中选择光学光电检测器：cmos(互补金属氧化物半导体)、ccd(电荷耦合器件)、pmt(光电倍增管)或任何其他相机、商业读板器或本领域已知的读板器。83.如本文下文所用，术语“cmos”或“互补金属氧化物半导体”是指基于金属氧化物半导体场效应晶体管的制造技术。cmos技术尤其用于产生集成电路芯片，诸如微处理器、微控制器和存储器芯片，并且还用于模拟电路，诸如图像传感器(cmos传感器)。后者由像素传感器单元信元组成，其中每个信元具有光电检测器和一个或多个有源晶体管。该技术能够捕获光信号并将它们转换为可测量的数值。在本公开中，该系统包括基于cmos的传感器和与信号产生组分(例如辣根过氧化物酶(hrp))偶联的核酸链。hrp是可以产生化学发光反应的酶，然后通过cmos传感器检测和评估其所得信号。84.如本文下文所用，术语“信号产生系统/组件”是指其组件以产生可检测信号(诸如光或热)的方式反应并且可以进一步转换为数值、可测量值的任何系统。该系统可以由酶(例如辣根过氧化物酶)、基于荧光的分子(荧光团)、基于发光的分子、光学生物传感器、压电生物传感器、测温生物传感器、比色材料(基于化学反应改变其颜色的化合物)、亲和结合分子和本领域已知的任何其他形式的系统组成。85.如本文下文所用，术语“固定化链”或“表面链”是指任何核酸序列(dna、rna或杂合dna-rna链)，其与本发明系统的表面结合，并与测试样品中发现的特定真菌mrna序列退火。86.如本文下文所用，术语“靶标链”是指从测试样品(“分析物”，其可以是例如怀疑被真菌感染污染的果实)中提取的任何rna序列。将靶标链加载到本发明的系统上，并在一端与固定化链退火，并在另一端与报告链退火。87.如本文下文所用，术语“报告链”是指任何核酸序列(dna、rna或杂合dna-rna链)，其在一侧与信号产生系统的任何组分缀合，并且还可以与测试样品的mrna转录物(靶标链)退火，其与固定化链结合。88.如本文下文所用，术语“表面”是指本发明的系统的基底。该部分结合固定的链，其与测试样品(分析物)的特定mrna序列(靶标链)退火。该表面还连接到测量换能器(诸如cmos传感器)。具有结合核酸能力的各种材料可以集成在该部分中，所述材料包括但不限于银颗粒、金颗粒、铜颗粒、锌颗粒、硫醇化颗粒、二氧化硅、塑料、生物素-链霉抗生物素蛋白、有效结合核酸的另外的有机或无机材料或组分，诸如磁珠、聚合物、纳米材料等。固定化链到本发明系统表面的固定化可以经由本领域已知的许多方法进行，例如吸附、共价键合、包埋、交联、自组装、包封等。89.在本发明的一个优选实施例中，该系统被设计成当真菌感染仍然处于低浓度并且肉眼不可见时，检测采收后产品中真菌的静止阶段。90.在本发明的另一个优选实施例中，该系统是便携式的，并且真菌感染的检测在田地或温室中进行。91.还在本发明的另一个优选实施例中，该系统包括固定有核酸链(“固定链”)的表面，该核酸链与来自测试样品(例如可能被真菌感染污染的果实)的mrna转录物特异性退火。然后，将能够与mrna转录物退火的报告链添加到系统中，并且还与信号产生系统或分子(诸如hrp)缀合。随后，添加激活信号产生系统的适当底物(例如，用于hrp的鲁米诺)，并且所产生的发光反应由cmos传感器捕获并转化为指示果实中真菌rna的浓度的数值、可测量的值。由于固定的链是在真菌的特定发育阶段上调的基因的区段，因此本发明的系统可以准确地指示定殖于测试植物组织的真菌的发育阶段。92.还在本发明的另一个优选实施例中，该系统被配置为计算采收后产品中真菌rna的浓度，并且还指示真菌处于其生命周期的发育阶段(附着胞、静止或坏死营养)。93.还在本发明的另一个优选实施例中，链(固定化链、靶标链和报告链)是在真菌的静止阶段特异性上调的基因的转录物(或其片段)。94.还在本发明的另一个优选实施例中，系统的表面被配置为通过常规手段结合核酸链(“固定化链”)，诸如吸附、共价键合、包埋、交联、自组装、包封等。系统的表面可以包含金属、纳米颗粒、无机或有机聚合物，以确保固定链的适当结合。95.还在本发明的另一个优选实施例中，系统的表面与测量换能器耦合。该测量换能器可以是本领域已知的任何光学或电化学检测器/传感器，例如：cmos、ccd、pmt、任何其他相机、商业读板器或本领域已知的读板器、电极、电极单元和使用电导、电流、阻抗或电位方法的丝网印刷电极。96.还在本发明的另一个优选实施例中，可以进一步优化和校准系统，使其能够检测约3nm浓度的真菌mrna转录物的浓度。97.还]在本发明的另一个优选实施例中，所述系统可以与公众可获得的数据挖掘和生物信息学工具组合，从而使所述系统成为用于评估采收后产品的保质期的预测工具。98.实例199.基于dna的传感器开发中的主要挑战之一是用换能器将受体分子(固定化链)固定到固相(表面)。传感器顶部处的生物报告分子不仅需要在固定步骤后保持其活性，而且它们还必须对目标分析物敏感和特异。在本节中，公开了本发明的系统的不同部件的示例。固定在玻璃表面上的dna链必须结合测试样品的互补靶标rna链，然后在其相对末端完成与报告链的杂化过程。现在参考图1，图1示意性地示出本发明的系统(100)和测量过程。所提出的系统基于测量换能器，诸如cmos光电检测器(101)和表面(103)上具有银纳米颗粒的玻璃管(102)，其用固定化的dna链(104)修饰。测试样品(靶标链)中的互补rna序列(105)在一端上与表面固定的dna链(104)特异性退火，并且在另一端上与链接至辣根过氧化物酶(107)的互补报告链(106)特异性退火。在加入适当的底物(108)后，与报告链(106)链接的辣根过氧化物酶(107)产生光。该光由cmos光电检测器(101)检测到并表示为可测量的光值，指示测试样品中真菌rna的浓度。基于固定化链(104)的序列，本发明的系统(100)还能够指示真菌的发育阶段(附着胞、静止或坏死营养阶段)。100.实例2101.如上所述，包括本发明的系统的一些部件可以变化。例如，系统的表面可以包含结合固定化链的各种材料。以下描述公开了本发明系统的活化程序，在具体的非结合实例中，其中表面由玻璃(改性二氧化硅)和银纳米颗粒制成，报告链与hrp缀合，并且测量换能器是光学光电检测器cmos：102.表面活化：103.为了形成传感器表面，将350-μl平底玻璃管(csi，#1025-630)在meoh:hcl溶液(1:1，v/v)中在室温下孵育20分钟。然后，将管浸入双蒸水(ddw)中并在超声浴(jk-ocd30a，mrc，holon，israel)中超声处理20分钟。将管在90℃下暴露于食人鱼溶液(h2o2:h2so4，3:7，v/v)60分钟。然后将它们用ddw冲洗，用n2干燥并在60℃下暴露于3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷60分钟。最后，用双蒸水冲洗管，干燥并进行银沉积程序。104.银沉积：105.如下进行银液相沉积：在快速搅拌下将500μl新鲜的5％(w/v)naoh溶液加入到硝酸银溶液(0.22g于26mlddw中)中。之后形成暗褐色沉淀，向沉积溶液中加入少量低于1ml的氢氧化铵直至沉淀溶解。通过将烧杯置于冰浴中将澄清溶液冷却至5℃。将管置于银沉积溶液中，加入新鲜的d-葡萄糖溶液(0.35g于4ml水中)，并将混合物搅拌2分钟。然后，将溶液温热至30℃。将管在沉积溶液中温育直至在玻璃表面上形成银层，然后用水洗涤并干燥。106.真菌接种和样品制备：107.在m3s上培养从腐烂的鳄梨果实获得的胶孢炭疽菌(分离株cg-14)、从腐烂的苹果获得的灰葡萄孢b05.10和扩展青霉pe-21、以及从柿子果实获得的链格孢菌的单孢子培养物。所有上述真菌具有非常广谱的宿主，宿主之一是番茄果实。将新鲜采收的成熟绿色和红色番茄果实(solanumlycopersicuml.)用于用胶孢炭疽菌接种，用7μl分生孢子悬浮液(5×105个分生孢子ml-1)接种成熟绿色番茄，每个果实50个接种点，其中每个生物学重复有六个不同的果实，并且每次处理有10个生物学重复。分别在成熟绿番茄果实接种后19小时和100小时收集附着胞和静止阶段的rna。对于灰葡萄孢(b.cinerea)、扩展假单胞菌(p.expansum)和交替假单胞菌(a.alteremata)，通过用针刺至1mm深度并用7μl分生孢子悬浮液(5×105个分生孢子ml-1)接种来伤口接种成熟的绿色番茄。对于坏死营养阶段生长，用针将红色果实穿刺至1mm深度，并用7μl任一真菌的分生孢子悬浮液(5×105个分生孢子ml-1)接种。每次生物学重复接种六个不同果实中的每一个上的六个接种点，每次处理10个生物学重复。在接种后48小时通过移除组织至0.5mm深度来收集用于坏死营养阶段评估的rna。将所有收集的组织储存在-80℃直至使用。108.dna固定：109.通过在室温下在黑暗中将银修饰的管暴露于用tris-edta缓冲液稀释的20μl的1μm表面dna溶液1小时，将dna固定在玻璃表面上。然后，将管用tris-edta缓冲液洗涤并暴露于20μl靶标链和报告链。使用veriti96孔热循环仪(appliedbiosystems)以一个热程序循环(在90℃下60秒，然后在75℃下30秒，在65℃下30秒，最后在53℃下30秒)进行常规pcr。在nd-1000分光光度计中测量dna质量和数量。暴露后，将管用tris-edta缓冲液洗涤并置于cmos传感器上或体内成像系统(ivis-100，perkinelmer，waltham，ma，usa)中用于进一步的光监测。110.仪器设置：111.为了监测酶活性，设计了现场可操作的生物传感器。将传感器[cmossensor-ulssolutionkitbyanitoa(paloalto，ca)]置于不透光盒中以防止光干扰。为了接收和分析数据，使用由anitoa开发的特定软件来监测发光信号并实时处理数据。在测量程序过程中防止管移动的特殊保持器与传感器组合。[0112]cmos测量程序：[0113]通过在cmos传感器表面上沉积20μl底物溶液(鲁米诺:h2o2，1:1，v/v)并将管置于其上方来观察来自酶促反应的光活化。[0114]实例3[0115]现在参考图2。直观地描绘了银沉积反应随时间对管的内表面(上面的图)和外表面(下面的图)上的银固定的影响。固定过程的第一步是将dna结合到银改性的玻璃表面。选择管上的两个不同沉积位置(即，内表面和外表面)。首先，测试反应时间对沉积效率的影响。银改性过程是动力学反应，其中层形成取决于玻璃表面暴露于沉积溶液的时间(参见“metal-enhancedfluorescence：anemergingtoolinbiotechnology”，aslan等人，currentopinioninbiotechnology，16，55-62，2005；和“fastandslowdepositionofsilvernanorodsonplanarsurfaces：applicationtometal-enhancedfluorescence”，aslan等人，thejournalofphysicalchemistryb，109，3157-3162，2005)。然而，在沉积时间和内表面上的银均匀性之间没有观察到可见的相关性(图2，上面的图)。这可能是由于在小的内管体积中的玻璃活化和银沉积过程中难以控制表面活化和改性条件(即，洗涤和干燥步骤、暴露温度和时间)。管结构使得难以进行洗涤和干燥步骤，洗涤和干燥步骤对于有效处理是至关重要的。因此，残留的水和化学物质可能干扰进一步的银沉积。不均匀沉积的另一个可能原因是不能控制管内的反应温度。因此，发明人继续测试外表面改性。在这种情况下，外管表面更便于有效干燥和洗涤，并且可以容易地控制溶液温度以进行最佳改性程序。实际上，在这种情况下，并且类似于先前的研究(参见“annealedsilver-islandfilmsforapplicationsinmetal-enhancedfluorescence：interpretationintermsofradiatingplasmons”，aslan等人，journaloffluorescence15,643，2005)，增加暴露时间诱导银沉积和产生更均匀的层(图2，下面的图)。因此，选择外表面改性程序用于进一步的实验。[0116]实例4[0117]现在参考dtt对管表面稳定性和dna固定效率的影响。用银层修饰管，并在没有或有dtt的情况下与硫醇化dna一起孵育。为了优化该过程，评估了沉积方案中的不同参数，诸如沉积温度、固定华过程期间的搅拌强度和化学品浓度的影响。此外，测试了dtt(用作硫醇化dna的还原或“去保护”剂的小分子氧化还原试剂)对表面固定效率的影响。通常将dtt添加到硫醇化dna中以降低或防止末端硫原子之间的偶联自反应，并且其用于化学、生物化学、肽-蛋白质反应和临床医学应用中。在该研究中，向dna孵育溶液中添加dtt不仅改变银的形态(例如，颜色和不透明度)，而且对dna固定效率具有负面影响。与仅用dna处理的玻璃表面相比，没有来自暴露于dna-dtt溶液的管的可见响应。这可能是由于银表面和dtt之间的相互作用，dtt是强还原剂，在ph为7时具有-0.33v的氧化还原电位(参见“coordinationofheavymetalsbydithiothreitol，acommonlyusedthiolgroupprotectant”，krzel等人，journalofinorganicbiochemistry84，77-88，2001)。已知dtt以及其他含sh的化合物与银原子强烈结合。因此，观察到的抑制作用可以通过dtt与银纳米颗粒结合来解释，从而防止进一步的dna固定。具有dtt的样品的银色变化支持该假设。因此，在不向孵育溶液中添加dtt的情况下进行所有进一步的固定化程序。[0118]实例5[0119]使用从胶孢炭疽菌分离的在静止阶段期间上调的mrna序列评估基于cmos的系统的特异性。为了获得rna序列，从在m3s板上生长10天的50mg(鲜重)cg-14菌丝体或100mg来自三个不同阶段(附着胞、静止、坏死营养阶段)的接种番茄果实组织中提取rna。使用研钵和研杵将所有样品在液氮中研磨成细粉。使用norgenbiotekplant/fungitotalrnapurificationkit(thorold，canada)根据以下方法从cg-14菌丝体中提取rna：根据制造商的方案，每个分离株50mg研磨的菌丝体作为起始材料。对于从接种的番茄果实中提取rna，使用spectrumtm植物总rna试剂盒(sigmaaldrich，strn250-1kt)，按照制造商的方案，在三个阶段中的每一个阶段从100mg接种的番茄果实中分离总rna。[0120]对于每个实验，本发明的系统用三种不同的链操作，即表面(固定化链)、靶标(来自测试样品)和与hrp缀合的报告链。该测量技术基于固定化dna探针在系统上的特异性核酸杂化。其原理是仅在样品中存在靶标分析物的情况下产生信号，所述靶标分析物将从一端退火至表面dna链并在其相反方向上退火至报告链。通过特异性试验证实了传感器区分在静止阶段上调的胶孢炭疽菌mrna和其他测试链的能力。现在参考图3。显示本发明对(a)非特异性dna序列(cgl_00010698；果胶酸裂解酶{pl}的非互补dna链)、(b)静止特异性dna序列(cgl_00014454；烯酰辅酶a水合酶/异构酶{e-coa-h}的互补链)和(c)非特异性dna序列(cgl_00010395；分泌脂肪酶{sl}的非互补dna链)的特异性。阴性对照(n.c.)示出本发明的系统对无dna样品的响应。结果以图形方式图示于图3中，示出与其他阶段的转录物相比，响应于静止阶段上调的转录物(cgl_00014454)的互补dna序列检测到高得多的信号，使得能够精确区分特异性和非特异性传感器响应。[0121](p《0.005通过anova。rlu＝相对光单位)。[0122]实例6[0123]通过将经修饰的管(系统的表面)暴露于具有固定浓度(100nm)的静止阶段报告链和表面链以及不同浓度的靶标rna链的混合物来评估本发明的灵敏度。现在参考图4a，其示了系统对不同浓度的特定序列cgl_00014454(烯酰-coa-水合酶/异构酶)的响应，并且图4b描绘了暴露于不同浓度的cgl_00014454(1000nm、100nm、10nm、5nm和阴性对照[n.c])的管表面上的光活性的可视化。[0124]图4显示系统区分高于靶标序列的5nm阈值的溶液中不同浓度的靶标rna链分子的能力。传统的pcr技术使得能够实现更灵敏的dna检测，但是cmos应用提供了与许多其他基于下述的生物传感器类似或更高的灵敏度以便在植物中进行病原体检测：基于光学的(参见“chemiluminescentdnaopticalfibresensorforbruxellensisdetection”，cecchini等人，journalofbiotechnology157，25-30，2012；和“surfaceplasmonresonanceimmunosensorforearlydiagnosisofasianrustonsoybeanleaves”，mendes等人，biosensorsandbioelectronics24，2483-2487，2009)、基于电化学的(参见“developmentofanelectrochemicalimmunosensorforphakopsorapachyrhizidetectionintheearlydiagnosisofsoybeanrust”，mendes等人，journalofthebrazilianchemicalsociety20，795-801，2009；和“diagnosisofsugarcanewhiteleafdiseaseusingthehighlysensitivednabasedvoltammetricelectrochemicaldetermination”，wongkaew，p.，和poosittisak，s.，americanjournalofplantsciences5，2256，2014)和基于质量平衡的(参见“detectionoftwoorchidvirusesusingquartzcrystalmicrobalance-baseddnabiosensors”，eun等人，phytopathology92，654-658，2002；以及“bacteriamurmur:applicationofanacousticbiosensorforplantpathogendetection”，papadakis等人，plosone10，e0132773，2015)。[0125]本发明的基于cmos的应用的另一个优点是有源像素传感器技术，其中每个图片元件(像素)具有光电检测器和有源放大器。这不仅增加了传感器的灵敏度，而且在测量过程期间提供了对管表面上的光活动的更好的可视化。这种效果可以在图4b中看到，在图4a中管表面上方具有更亮的区域及它们的量化。此外，在所有较高的测试浓度(高达10nm)下，通过管表面上方的类似光活性容易地可视化管尺寸。[0126](*p《0.005，通过anova。rlu，相对光单位。n.c.，阴性对照)。[0127]实例7[0128]现在参考图5。以图形方式呈现了本系统在不同的胶孢炭疽菌感染阶段对总番茄皮rna的响应。并行地，将本发明的系统暴露于来自在板上生长的真菌的rna溶液提取物(体外)和无dna样品提取物(rlu＝相对光单位；p.c.＝阳性对照；n.c.＝阴性对照，*p《0.005，通过anova)。[0129]为了开发基于cmos的传感器来检测果实中的静止阶段的真菌，在不同的胶孢炭疽菌感染阶段评估番茄皮的总rna。将提取自番茄果实的rna暴露于cmos生物传感器，所述番茄果实接种了不同发育阶段的胶孢炭疽菌(c.gloeosporioides)。采收后的真菌病原体通常在采收前渗入果实。然后真菌在未成熟果实中进入长期静止和微观阶段；当果实成熟时，真菌转换到其坏死营养阶段并引起腐烂。对于这种cmos生物传感器概念验证，重点是在其显微镜静止阶段期间检测真菌并寻找在真菌静止期间高度表达的mrna。使用与这些mrna互补的链(表面链和报告链)(它们在静止期间被诱导)的应用允许简单且灵敏地可视化该基因表达。图5显示了系统对体外真菌(即菌丝生长阶段)和番茄果实上三个不同的体内阶段-附着胞(渗透阶段)、静止(潜伏阶段)和坏死营养(致病阶段)的反应。并行地，将本发明的系统暴露于合成的dna序列(作为阳性对照)和不含靶标dna的样品(作为阴性对照)。与附着胞阶段相比，静止和坏死营养阶段诱导传感器响应。因此，当真菌休眠并且它们的代谢和转录组活性显著降低时，基因烯酰-coa-水合酶/异构酶在静止阶段期间被高度诱导(参见“simultaneoustranscriptomeanalysisofcolletotrichumgloeosporioidesandtomatofruitpathosystemrevealsnovelfungalpathogenicityandfruitdefensestrategies”，alkan，n.，newphytologist205，801-815，2015)。有趣的是，当真菌高活性和增殖时，在坏死营养和致病性定殖期间也可见信号。如先前在实例6和图4中所讨论的那样，光强度与样品中的dna浓度之间存在相关性。因此，在静止期间，诱导mrna转录，其中更多的rna与固定的表面和报告序列杂化，因此观察到更强的光发射。在活性致病期间，真菌将生长和增殖，导致类似的光发射。这些结果表明，本系统不仅能够确定新鲜的采收后产品中病原体的存在，而且还能够在它们代谢减少并且肉眼不可见的微观静止阶段期间感测真菌。[0130]实例8[0131]可以通过采取若干附加步骤来进一步优化和校准本发明的系统，从而确保其增强的灵敏度、准确性和特异性。在以下部分和附图中进一步描述这些步骤。[0132]检查了不同参数对银层形成效率的影响，包括银溶液温度和体积、加热模式和罐材料(图6)。比较420nm处的光密度(od)作为银层形成的指示。较高的光密度值相当于沉积在玻璃表面上的银的量增加。从结果来看，通常，在较低沉积溶液体积的情况下，通过用水浴作为加热源将沉积溶液加热到较高温度，银沉积程序更有效。测试了两种银溶液温度，并且35℃的温度(od420nm＝0.638)显示出与30℃(od420nm＝0.254)的温度相比的光学密度增加，指示银的沉积增加为2.5倍。在两个测试的热源中，与板式加热器(od420nm＝0.423)相比，在水浴(od420nm＝0.961)作为热源的情况下沉积的银量增加为2.3倍。此外，检查了4、15和26ml的三种不同的银沉积溶液体积。在测试溶液体积中，与15ml(od420nm＝1.340)和26ml(od420nm＝1.000)相比，4ml(玻璃：od420nm＝2.354和塑料：od420nm＝1.945)分别显示出1.76倍和2.35倍的银沉积增加。可能的解释可以集中在溶液温度周围，因为银沉积过程高度依赖于溶液温度。较高的银沉积溶液体积需要较长的加热时间；因此，在9分钟的恒定沉积时间内，较高的溶液体积可导致较少的银沉积。此外，在4ml银沉积溶液的情况下，与塑料(od420nm＝1.945)相比，当罐材料是玻璃(od420nm＝2.354)时沉积更多的银。可能的原因可能是玻璃(1.82(btu/(hrft°f)))和聚丙烯塑料(0.69(btu/(hrft°f)))之间的导热系数(tcc)的差异。玻璃的较高tcc可能导致银沉积溶液的更快加热，并且因此也可能导致更有效的银沉积过程。总之，在玻璃罐中使用4ml的较低沉积溶液体积，并且通过用水浴将沉积溶液加热到35℃的温度，银的沉积更有效。[0133]总之，图6示出了对于所有测试条件，在具有最低沉积溶液体积的玻璃罐中发生的沉积过程，用水浴加热至最高反应温度(35℃)，显示了更有效的银沉积速率。这可以从较高的光密度值观察到，这指示玻璃表面上沉积的银量更多。[0134]图7和图8显示了阻断过程对银层稳定性的影响。为了确定该因素的显著性，用不同浓度的脱脂乳(1％、2％、3％、4％和5％(w/v))[图7]和bsa(1％、2％、3％和4％(w/v))[图8]处理经修饰的表面。然后，将管洗涤十次，同时在每个洗涤步骤之后测量玻璃表面的光密度。对于所有使用的阻断剂和在所有测试浓度下，观察到洗涤步骤期间银稳定性的增加。与未处理的表面(0％)相比，阻断的管中的光密度仅在第一步之后降低，然后在所有进一步处理期间保持恒定。银表面稳定性的增加可以通过它们上方(在玻璃、银和边缘上)的阻断剂分子的吸收来解释。阻断层的添加可以防止非特异性吸收通过在固定的金属和玻璃表面之间产生额外的连接力来处理和稳定银层。可以通过在阻断步骤之后降低光密度值来观察这种层的产生。[0135]图9以图形方式描绘了阻断步骤对玻璃表面上的dna非特异性吸收的影响。该图呈现了如何通过用不同的阻断剂(脱脂乳和bsa)阻断银改性的玻璃表面来评估固定步骤的非特异性，并将光活性与未阻断的管进行比较。在阻断步骤后，将所有管与100nm的dna-hrp溶液(报告链)一起孵育，洗涤并通过添加hrp底物(h2o2+鲁米诺)进行测量。[0136]图10描绘了阻断步骤对退火过程的影响。表面dna修饰的管用不同的阻断剂(脱脂乳和bsa)阻断，并暴露于具有和不具有靶标分析物(分别为黑色条和白色条)的报告链(与hrp缀合的dna链)。在退火过程后，洗涤管并通过添加hrp底物(h2o2+鲁米诺)进行测量。[0137]该步骤的目的是确定最佳的阻断剂以提高dna杂化效率并防止非特异性dna吸收在本系统的银表面上。由于合理地预测最佳阻断剂是具有挑战性的，因此进行了筛选实验。测试了不同浓度的两种类型的阻断剂(脱脂乳和bsa)。将具有固定化dna的银表面与不同的阻断溶液一起孵育、洗涤、并暴露于报告链。非特异性dna吸收过程可以从未阻断的表面比阻断的表面更高的光活性观察到。对于所有测试的阻断剂，未阻断的管产生比阻断样品高100倍的光活性。这种非特异性吸收可能在进一步测量期间产生假阳性响应，并且因此阻断步骤对于正确的传感器功能是必不可少的。然后，评估阻断剂对mrna退火过程的影响。表面dna修饰的管用不同的阻断剂和浓度阻断，并暴露于具有和不具有靶标分析物的报告物(dna-hrp)链。阻断步骤减少了报告dna对本发明玻璃表面的非特异性吸收，同时观察到对退火过程的任何影响。对于所有测试参数，观察到类似的响应模式。这种一致性表明，在测试浓度下，bsa和脱脂乳都形成类似的阻断层。同时，所有未使用的试剂被洗掉，因此不会干扰进一步的退火过程。[0138]现在参考图11和图12，其描绘了银沉积反应时间对dna固定效率的影响。通过将用不同沉积反应时间改性的玻璃表面暴露于恒定浓度(100nm)的整个核酸复合物(例如，与hrp缀合的表面链、靶标链和报告链)来测试该因子。图11以图形方式显示较长的反应时间使更多的银固定在玻璃表面上。图12以图形方式显示金属增强荧光(mef)对传感器功能的影响。在这种情况下可以观察到两种不同的场景。在第一场景下，来自活性光学分子的等离子体将转移到管表面上的银纳米岛，并且将作为响应刺激光产生。在第二场景下，玻璃表面覆盖有均匀的(整料)银层和转移的等离子体，而不是产生散射在银表面上的光诱导。可以在通过不同银沉积时间改性的表面上观察到沉积时间对信号增强的影响(如图11中可见)。在第一反应时间段，银纳米岛数量的增加提高了固定的dna浓度，并且因此增加了传感器光响应(图11-12的部分1，0-4分钟)，然后进一步的银沉积时间将减少单独(隔离)的纳米岛的数量。因此，可用固定化表面的增加降低了mef增强效果。这种组合产生稳态部分(如图12中可见，部分1，5-8分钟)，其中等离子体散射效应通过固定化dna浓度的增加来补偿。进一步的沉积反应将减少管表面上的银纳米岛数量并产生更整体的银层(图11，部分2)。这种变化将诱导等离子体从光活性分子转移到银表面。然而，为了刺激银层光活性，等离子体将在表面上散射，导致整个系统的光活性降低(图12，部分2)。[0139]最后，为了检查系统对不同浓度的特定mrna序列(cgl_00014454，烯酰-coa水合酶/异构酶)的灵敏度，在上述优化步骤之前和之后(图6-12中描绘)，将本发明的修饰表面暴露于具有固定浓度(100nm)的静止阶段报告链和固定浓度(100nm)的表面链(固定化链)以及来自测试样品的不同浓度的靶标rna链的混合物。现在参考图13a，图13a以图形方式描绘了本发明的系统使用预优化方案区分溶液中高达10nm阈值的不同浓度的靶标rna链分子的能力。现在参考图13b，图13b以图形方式描绘了在实施上述优化的固定方案之后系统的灵敏度。如可以看出的那样，实施优化步骤将系统的灵敏度提高至3.3nm的浓度(对于较低浓度未观察到差异)。[0140]实例9[0141]本发明的系统可用于检测采收后产品中各种真菌菌株的存在，以及真菌所处的发育阶段(附着胞、静止和死体营养)。最初，需要找到每种测试物种(灰葡萄孢、扩展青霉和链格孢)的靶标转录物，其将表征每种真菌的不同发育阶段。[0142]为了找到在几种主要致病真菌的静止阶段期间上调的新靶标基因(其严重影响采收后作物)，将成熟-未成熟(绿色)和成熟(红色)番茄果实用上述真菌的分生孢子伤口接种。分别接种红色和绿色番茄果实后两天和三天，真菌处于坏死营养和静止阶段。从接种区域提取rna，并使用nextseq500(nancyandstephengrandisraelnationalcenter，weizmanninstituteofscience，israel)进行转录组分析。通过将序列引入blast工具，将它们与真菌和番茄基因组两者进行比较，对果实和真菌转录组的所得序列进行生物信息学分析。图14中呈现了在静止阶段(成熟-未成熟的绿色番茄果实的感染)显著上调的几种所选真菌基因。图14a描绘了在链格孢菌的静止阶段期间上调的转录物。图14b描绘了在灰葡萄孢的静止阶段期间上调的转录物。图14c描绘了在扩展青霉的静止阶段期间上调的转录物。基于每种真菌基因组序列鉴定那些感兴趣的基因的序列。[0143]图15-17以图形方式图示了本发明的系统在番茄果实的两个不同体内阶段：静止(潜伏阶段)和坏死营养(致病阶段)对不同真菌菌株(灰葡萄孢、链格孢、扩展青霉)的反应。图15描绘了本系统对灰葡萄孢的反应，图16描绘了本系统对链格孢菌的反应，并且图17描绘了本系统对扩展青霉的反应。[0144]并行地，将本发明的系统暴露于没有靶标链的样品(作为阴性对照)。[0145]表1显示不同的基因在不同的致病真菌菌株中用作特异性静止标记物。在静止期间，诱导mrna转录，其中更多的rna链与固定的表面和报告dna序列杂化，并且因此观察到更强的光发射。在活性致病期间，真菌将生长和增殖，导致相似或不同的光发射(取决于从静止到坏死营养阶段的转化转换进程)。如果从静止阶段和坏死营养阶段的开始提取mrna，则将观察到传感器响应之间的最高差异(即灰葡萄孢，图15)。如果mrna提取物取自经历最新静止阶段并转换到坏死营养阶段的真菌(即链格孢菌，图16)，则将观察到类似的反应。两个不同的参数可以解释传感器响应在坏死营养/静止比率方面的差异。第一个是真菌转化从潜伏阶段到致病阶段的进展，这降低了静止mrna表达，并且因此降低了传感器信号值。第二个参数是将减少mrna表达和装置反应的坏死营养过程的进展(即扩展青霉，图17)。这些结果表明，本发明的系统不仅能够确定新鲜采收后产品中不同病原体的存在，而且能够感测处于它们的各种致病阶段的真菌。[0146]表1：在静止阶段处表达并用作标记物的基因[0147][0148][0149]上述实验(其结果显示在图15-17中)包括生物传感器，其表面由共价固定的链霉亲和素修饰的塑料制成。固定的链与生物素缀合，因此生物素和链霉亲和素之间的链接导致链固定到系统的表面。该实验中的报告链与荧光荧光团荧光素缀合。通过光学光电检测器检测从荧光素缀合的报告链发射的荧光，并将其转换为可测量的值。[0150]实例10[0151]以下序列代表链的非限制性实例，所述链可以并入到本发明中并用于在采收后产品中的静止阶段期间检测真菌：报告链(seqidno1)：hrp——5'-tgaggcgtgggaagcaac-3'，与静止标记物(cgl_00014454；烯酰-coa-水合酶/异构酶)具有反向互补性。表面链(seqidno2)：5’‑atgcaccgtagcgaccagag-3’‑sh硫醇化dna序列，具有缀合的异硫氰酸荧光素(fitc)——5’‑atgcaccgtagcgaccagag-3’‑sh)。该序列用于评估固定效率和dtt对固定过程的影响，如实例4中所示。[0152]静止标记物的阳性靶标(seqidno3)：5’‑cccaagctcataggactgtctaaggcgagccacgtcacgaccactggagacgtgtatcccgtcaccgatccactcgtcaatgggctgttctcaaagttgcttcccacgcctcaacacacagtc-3’[0153]阴性靶标序列(seqidno4,cgl_00010698；果胶酸裂解酶):5’‑tcgtcttgggtctctggtcgctacggtgcatctctcatgcgctcagtctctgtgagacgcgagtgaacttcgttttactggttaaagaacggggaaggaagacaacgaaccacgactatttct-3’以及[0154](seqidno5，cgl_00010395；分泌性脂肪酶)：5’‑tggaagtccggtccatgctcgcgtgtatcctgatatgggacacggccaggttttggaggccgccagggctgatatcgctgcttggatcgccgcgagatttgaaggagttcccgttgagaagac-3’)。当前第1页12当前第1页12