一种抗贾第虫作用靶点的锌脂蛋白及医用用途的制作方法

本发明提供了一种抗贾第虫作用靶点的锌脂蛋白，做为一种新的抗贾第虫作用靶点，可用于开发抗贾第虫药物，属于抗寄生虫技术领域。

背景技术：

十二指肠贾第虫（giardiaduodenalis），简称贾第虫（giardia），作为人兽共患寄生虫主要寄生在人和某些哺乳动物的小肠内，引起以腹泻为主要特征的贾第虫病，严重危害人体以及其他动物的健康。目前控制贾第虫病还是主要依靠抗贾第虫药的使用，如：甲硝唑等，但是由于耐药性的产生，迄今尚无理想的控制贾第虫病的药物和疫苗。由于贾第虫可以在体外反复传代出现“永生化”，其调控又与端粒密切相关。端粒是一种特殊核蛋白复合体，位于真核细胞染色体的末端，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。端粒酶是负责端粒延长的一种酶，可将端粒dna加至真核细胞染色体末端，在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性等方面有重要作用。而端粒酶活性调节又与端粒酶相关蛋白有关。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种的抗贾第虫作用靶点--其可调控贾第虫端粒酶活性，进而起到抗贾第虫作用。

本发明公开的一种贾第虫锌脂蛋白（以下缩写：zfd），其基因序列如：seqno1所示，分子式为：c923h1438n274o295s15，相对分子质量为21.6kd，等电点为6.70；应用swiss-model对zfd进行3d结构预测，结果如图1所示。

本发明所述的贾第虫锌脂蛋白作为抗贾第虫药物作用的靶点。

本发明所述的贾第虫锌脂蛋白在制备抗贾第虫药物中的医用用途。

本发明的贾第虫锌脂蛋白靶点是一种贾第虫端粒酶逆转录酶（telomerasereversetranscriptase，tert)中端粒酶rna结合域（telomeraserna-bindingdomain，trbd）结构域的互作蛋白，转入锌脂蛋白的核酶能够显著降低锌脂蛋白的表达，对虫体的繁殖有明显的影响。采用trap法检测核酶对贾第虫端粒酶活性影响，结果发现锌脂蛋白表达水平的降低，下调了贾第虫的端粒酶活性。

本发明采用rt-pcr法检测贾第虫核酶实验组以及对照组的端粒长度，结果显示端粒长度低于阴性对照组，表明zfd表达水平的降低影响了端粒的长度。

本发明的积极效果在于：

公开了一种新的贾第虫锌脂蛋白，发现了能显著抑制虫体繁殖的蛋白zfd，其通过作用于贾第虫trbd抑制贾第虫的繁殖，降低端粒酶活性以及影响端粒长度；本发明为贾第虫的治疗提供了新的靶点zfd，为未来药物干预贾第虫病奠定基础。新的端粒酶相关蛋白，找出针对端粒酶的作用靶点是抗贾第虫药物开发的新途径。

附图说明

图1本发明zfd蛋白3d结构预测图；

图2本发明zfd核酶对贾第虫的端粒酶活性的抑制效果（m：dna分子量(dl500dnamarker)；1：hela细胞trap产物（对照）；2：转染正常贾第虫对照组；3：转染含有空载体贾第虫对照组；4：转染含有pc631-snap-ham-gdh载体的贾第虫对照组；5：转染含有pc631-snap-ham-zfd载体的贾第虫组）；

图3本发明zfd端粒电泳验证pcr结果（贾第虫端粒pcr结果：m：50bpdnaladder；1：端粒1引物pcr结果；2：端粒2引物pcr结果；3：内参pcr结果）；

图4本发明zfd核酶对贾第虫的端粒长度的抑制效果（端粒长度检测结果。control：正常贾第虫滋养体端粒长度；zfd-sub：转染含有载体pc631-snap-zfd-sub的贾第虫滋养体端粒长度；ham-gdh：转染含有载体pc631-snap-ham-gdh的贾第虫滋养体端粒长度；ham-zfd：转染含有载体pc631-snap-ham-zfd的贾第虫滋养体端粒长度）；

图5本发明zfd核酶对zfd转录体的切割效果；

图6本发明zfd核酶对贾第虫繁殖的抑制效果（转染核酶的贾第虫虫体计数，control组：未电转组；group1组：空载体电转组；gourp2组：阴性组；group3组：核酶电转组）。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

本发明公开的贾第虫锌脂蛋白（zinc-fingerdomain(zfd)containingprotein，zfd），分子式为：c923h1438n274o295s15，相对分子质量为21.6kd，等电点为6.70，其可调控贾第虫端粒酶活性，进而起到抗贾第虫作用，应用swiss-model对zfd进行3d结构预测，其基因序列如：seqno1所示，结果如图1所示。

实施例2

trap检测zfd核酶对端粒酶活性的影响：

将zfd核酶10μl电转染进入贾第虫滋养体后，采用trap法检测贾第虫核酶转染组、阴性对照组以及空载体组的端粒酶活性。将滋养体通过rnase-freepbs洗涤3次后，取1×10⁷个虫体加200μl裂解液，用高速组织研磨器冰上研磨35次，每次1~2sec。冰浴裂解20min，然后12000g，4℃离心15min，取上清，bca法测蛋白浓度，分装，通过30℃反应30min，95℃灭活5min。然后加入pr引物1μl，rtaq1μl进行pcr扩增。扩增参数为：94℃1min，59℃1min，72℃1min，33cycles。反应结果通过电泳检测。结果显示阴性对照组以及空载体组没有明显区别，而核酶转染组的端粒酶活性低于阴性对照组，表明zfd表达水平的降低下调了贾第虫的端粒酶活性（如附图2所示）。

实施例3

rt-pcr法检测zfd核酶对端粒长度的影响：

提取贾第虫rna，反转录成cdna后，根据贾第虫端粒dna重复序列分别设计端粒引物及内参，进行pcr扩增，94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，重复30循环；72℃10min；降温至4℃后取出，电泳验证pcr结果。

为了检测端粒引物结果是否符合标准，在rt-pcr结束后，取5μlpcr产物用于琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，经过30个循环的扩增后，约从60bp开始出现多个条带，长度一直延伸到500bp以上，端粒检测结果符合预期标准，证明实时荧光定量pcr是一种测定贾第虫基因组端粒长度的可靠的方法，电泳验证pcr结果（如附图3所示）。

采用rt-pcr法检测贾第虫实验组以及对照组的端粒长度。根据端粒长度计算公式：[2ct(telomeres)/2ct(s)]–1=2–δct。结果显示,ham-zfd实验组q-pcr测定端粒长度相对t/s为0.83±0.15；阴性对照组pcr测定端粒长度相对t/s为0.96±0.07，0.93±0.05实验组的端粒长度低于阴性对照组，表明zfd表达水平的降低影响了端粒的长度（如附图4所示）。

实施例4

zfd核酶在贾第虫体内的表达以及对虫体的影响：

为了评估zfd对贾第虫生长繁殖的影响，按照锤头状核酶设计原理，设计zfd序列的核酶ham-zfd。体外切割结果显示核酶对zfd基因的pc631-snap-zfd体外转录体rna的切割效率显著，达到84%，而阴性对照组中pc631-snap-zfd-sub体外转录rna对pc631-snap-zfd影响较小，效率仅为2%，另一阴性对照组pc631-snap-ham-gdh对pc631-snap-zfd无可见影响（如附图5所示）。

当滋养体处于对数期时，收集虫体，pbs清洗3遍。2000r/min常温离心10min，弃去上清液。使用预冷的cytomix电击缓冲溶液重悬滋养体并计数，使细胞浓度达到10⁶-10⁷个/ml并转移至电击杯中。将核酶10μl电击转染进入贾第虫滋养体。电击后冰浴15min，然后将细胞转移至贾第虫培养瓶培养。24h后收集细胞，连续5天分别对没有转染的虫体和转染的虫体进行计数，并用spss软件对所得数据进行统计学分析。结果显示贾第虫滋养体转染zfd核酶5天后，虫体数量只有对照组的41%，阴性对照组影响较小，提示核酶的转入对虫体的繁殖有明显的抑制作用（如附图6所示）。

综合上述实验结果，本发明的贾第虫锌脂蛋白靶点通过作用于寄生虫trbd蛋白，降低端粒酶活性，影响端粒长度，发挥抗贾第虫繁殖的效果，可用于抗寄生虫技术领域的药物研发。

序列表

<110>吉林大学

<120>一种抗贾第虫作用靶点的锌脂蛋白及医用用途

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>582

<212>dna

<213>贾第虫(贾第虫)

<400>1

atgagcatagtgatgcgcaatatggagtcttcccttcggaacgcggagtccctagcggta60

ggccagacgagctcatccacaggagcaaaatacaagactgaattttgtaattgctttgca120

gagtttggtagatgtgattatggggaccgttgccaatttgcccactccatggaggagttt180

cagcataggcgcagaagcaatgtgaaggatatgaaattgtgcacagatttcatcacgcat240

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