一种重组角蛋白分离纯化方法与流程

1.本发明涉及角蛋白分离技术领域，尤其是涉及一种重组角蛋白分离纯化方法。


背景技术：

2.角蛋白是一类具有缔结和保护功能的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于动物的毛发、羽毛和蹄中；由于角蛋白具有良好的生物活性高和组织相容性，能够起到消炎、止血、神经修复、减少创面渗出和促进创伤组织再生，修复、愈合的作用；由于角蛋白具有高抗性的理化性质和特殊的生物学作用，再加上现有的角蛋白分离需要复杂的化学工艺才能实现，并且分离过程中容易造成角蛋白结构的破坏，分离的效率也较低，分离得到得角蛋白的纯度较低；由于上述限制使得角蛋白目前只在化妆品领域应用较为广泛；无法在对角蛋白纯度要求更高的医疗产品领域内使用。
3.现在市场上为了避免从动物中提取角蛋白的提取工艺对角蛋白造成的各种不利的影响，现在市场上逐步开始研究重组角蛋白，然后通过将重组的角蛋白在大肠杆菌中表达和培养；但是现在还没有针对就重组角蛋白进行分离纯化的方法。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种重组角蛋白分离纯化方法，解决了现在针对就重组角蛋白还没有有效的分离纯化方法等技术问题。
5.为了实现前述发明目的，本发明提供了一种重组角蛋白分离纯化方法，包括如下步骤：
6.1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于缓冲液后进行高压匀浆后，再进行离心收集上清液，最后对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；收集到的菌泥通过低温高压匀浆可使细菌充分破碎，重组角蛋白分散于溶液中，便于后续充分回收蛋白质。
7.2)采用ni亲和层析柱对步骤1)中得到含有重组角蛋白的滤液进行分离，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；角蛋白序列构建时末端添加了his标签，而镍柱里面的琼脂糖微球体与ni
2+
发生螯合，螯合后的ni
2+
能与his上的咪唑环发生特殊的相互作用，使重组角蛋白挂柱而杂质流出，然后再用亲和能力更强的咪唑置换出柱子上的重组角蛋白，从而实现重组角蛋白的分离。亲和层析操作简便，并能将大部分重组角蛋白进行分离纯化。
8.3)采用阴离子层析柱对步骤2)得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集二次洗脱缓冲液。阴离子交换基质通过离子交换作用结合带有负电荷的重组角蛋白，使得重组角蛋白被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，利用带负电荷更多的溶液进行置换将吸附在柱子上的重组角蛋白洗脱下来。阴离子层析柱分辨率高、工作容量大且简单易操作，可对重组角蛋白进行进一步纯化。
9.优选地，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris ph7.0。
10.优选地，所述步骤1)中高压匀浆的压力为800～2000bar，高压匀浆3～5次。
11.优选地，所述步骤1)中采用冷冻高速离心机收集上清液，所述冷冻高速离心机的分离转速为8000～12000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min。
12.优选地，所述步骤1)中采用0.22um中空纤维或者滤膜过滤上清液。
13.优选地，所述步骤2)的具体操作为：取装有ni亲和层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5m naoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
14.优选地，所述步骤3)的具体操作为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，最后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5mnaoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
15.优选地，所述步骤2)中ni亲和层析柱中的介质为ni smart beads 6ff、ni nta beads 6ff、ni
‑
ted purose 6fast flow、ni
‑
ted purose 6ff或ni sepharose 6fast flow中的一种；
16.所述步骤2)中平衡缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris+8m ureaph8.0；
17.所述步骤2)中清洗缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris+8m ureaph8.0；
18.所述步骤2)中洗脱缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris+8m urea ph8.0+50
‑
500mm咪唑；
19.所述步骤2)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致。
20.优选地，所述步骤3)中阴离子层析柱中的介质为q bestarose high performance、q sepharose high performance、q beads 6ff、deae bestarose high performance、q bestarose big beads、q sepharose big beads、diamond q、capto q、diamond q mustang、capto q mustang、capto deae、diamond deae或diamond deae mustang中的一种；
21.所述步骤3)中平衡缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或tris ph7.0；
22.所述步骤3)中清洗缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或tris ph7.0；
23.所述步骤3)中洗脱缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或tris+0.1
‑
0.5m nacl ph7.0；
24.所述步骤3)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的ph和电导均与平衡缓冲液的ph和电导保持一致。
25.优选地，所述步骤1)中、步骤2)中和步骤3中均需要进行蛋白指标检测；所述蛋白指标检测采用sds
‑
page凝胶电泳检测法和高效液相色谱检测法进行检测。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
27.本发明针对重组角蛋白提出了一种有效的分离纯化方法，对重组角蛋白进行二次分离，首先使得重组角蛋白的分离过程简单，操作方便，更重要的是整个分离过程不会对重组角蛋白结构造成破坏，保证重组角蛋白的分离效率，使得重组角蛋白的分离纯度能够达到90～95％，确保分离的重组角蛋白的纯度能够满足在医疗产品领域内使用；使得重组角蛋白的应用领域更加广泛。
具体实施方式
28.下面将结合本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
29.需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
30.在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本发明的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
31.本发明提供了一种重组角蛋白分离纯化方法，包括如下步骤：
32.1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于缓冲液后进行高压匀浆后，再进行离心收集上清液，最后对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
33.2)采用ni亲和层析柱对步骤1)中得到含有重组角蛋白的滤液进行分离，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；
34.3)采用阴离子层析柱对步骤2)得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集二次洗脱缓冲液。
35.优选地，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris ph7.0。
36.优选地，所述步骤1)中高压匀浆的压力为800～2000bar，高压匀浆3～5次。
37.优选地，所述步骤1)中采用冷冻高速离心机收集上清液，所述冷冻高速离心机的分离转速为8000～12000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min。
38.优选地，所述步骤1)中采用0.22um中空纤维或者滤膜过滤上清液。
39.优选地，所述步骤2)的具体操作为：取装有ni亲和层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5m naoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
40.优选地，所述步骤3)的具体操作为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，最后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5mnaoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
41.优选地，所述步骤2)中ni亲和层析柱中的介质为ni smart beads 6ff、ni nta beads 6ff、ni
‑
ted purose 6fast flow、ni
‑
ted purose 6ff或ni sepharose 6fast flow中的一种；
42.所述步骤2)中平衡缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris+8m ureaph8.0；
43.所述步骤2)中清洗缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris+8m ureaph8.0；
44.所述步骤2)中洗脱缓冲液为5
‑
100mm pb缓冲液或者tris+8m urea ph8.0+50
‑
500mm咪唑；
45.所述步骤2)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致。
ureaph8.0+50
‑
500mm咪唑缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5m naoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱；
60.3)取装有deae bestarose high performance介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用tris ph7.0缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的ph和电导均与平衡缓冲液的ph和电导保持一致；再用tris ph7.0缓冲液清洗杂质，最后用tris+0.1
‑
0.5m nacl ph7.0进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5mnaoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
61.实施例3
62.1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于5
‑
100mm pb缓冲液后进行高压匀浆后，设置高压匀浆的压力为1600bar，高压匀浆4次；再采用冷冻高速离心机收集上清液，设置冷冻高速离心机的分离转速为10000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min，进行离心处理收集上清液；最后对上清液用0.22um中空纤维对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
63.2)取装有ni
‑
ted purose 6fastflow介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用5
‑
100mm pb缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致；再用5
‑
100mm pb缓冲液清洗杂质，用5
‑
100mm pb缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5m naoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱；
64.3)取装有q sepharose big beads介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用5
‑
100mm pb缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的ph和电导均与平衡缓冲液的ph和电导保持一致；再用5
‑
100mm pb缓冲液清洗杂质，最后用5
‑
100mm pb缓冲液和tris+0.1
‑
0.5m nacl ph7.0进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5m naoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
65.实施例4
66.1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于tris ph7.0缓冲液后进行高压匀浆后，设置高压匀浆的压力为2000bar，高压匀浆5次；再采用冷冻高速离心机收集上清液，设置冷冻高速离心机的分离转速为11000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min，进行离心处理收集上清液；最后对上清液用0.22um中空纤维对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
67.2)取装有ni
‑
ted purose 6ff介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用tris+8m ureaph8.0缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致；再用tris+8m urea ph8.0缓冲液清洗杂质，用tris+8m ureaph8.0+50
‑
500mm咪唑缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5mnaoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱；
68.3)取装有diamond deae mustang介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用tris ph7.0缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的ph和电导均与平衡缓冲液的ph和电导保持一致；再用tris ph7.0缓冲液清洗杂质，最后用5
‑
100mm缓冲液和tris+0.1
‑
0.5m nacl ph7.0进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5m naoh溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
69.通过对实施例1
‑
4中步骤1)、步骤2)、步骤3)操作后的重组角蛋白进行检测得到表1。
70.表1为各实施例中蛋白的浓度测定表
[0071][0072]
从表中可以看出，通过本发明对重组角蛋白能够进行有效的分离，并且本发明对重组角蛋白的分离纯度完全能够达到90
‑
95％，使得分离后的重组角蛋白的纯度完全满足用于医疗产品等领域的要求，使得重组角蛋白的应用范围更广。
[0073]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。