纯化或检测靶蛋白的方法

专利名称：纯化或检测靶蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及纯化和检测蛋白质的领域。具体地，本发明涉及使用适体特异性地纯 化或检测介质(特别是溶液)中的目的蛋白，在所述介质中也可能包含与目的蛋白同源的 蛋白。
背景技术：
用于纯化和检测目的蛋白(也可被称为“靶蛋白”)的方法通常包括将可能包含 目的蛋白的待测介质与能结合所述目的蛋白的化合物接触的步骤。可结合靶蛋白的这些化 合物可具有各种性质。它们可以是(i)包含具有与蛋白结合的性质的化学基团的有机化合 物(例如DEAE、季铵、烷基链、硅烷醇)；(ii)或蛋白(例如抗体)、糖胺聚糖(肝素)、染料 (汽巴蓝F3GA)或核酸(例如适体)。用于纯化或检测靶蛋白的方法的有效性依赖于例如结合靶蛋白的 化合物的亲和 力和特异性。对于某些具有复杂组成的起始介质，尤其是包含很多不同蛋白质的起始溶液，纯 化和检测目的靶蛋白仍很困难。当在复杂的起始介质中待纯化或检测的靶蛋白与一种或多 种不同但彼此高度同源的蛋白共存时，这尤其是事实。实际上，当靶蛋白和一种或多种与这 种靶蛋白同源的蛋白存在于溶液中时，开发通过使用常规纯化或检测方法能高水平地区分 感兴趣的靶蛋白与不需要的同源蛋白的纯化或检测工具变得困难。即使抗体——已知它们 对靶蛋白具有高特异性，也常常遭遇交叉反应，包括与很多和靶蛋白具有结构同源性的蛋 白的交叉反应。难于特异性地纯化或检测彼此同源的蛋白质的这种困难是许多应用领域中的缺 陷，包括目的在于特异地研究靶蛋白(不管是否将与靶蛋白潜在同源的任何其它蛋白质) 的学术研究领域，以及工业领域中，例如为了开发新的更有效的纯化或检测工具，以便与已 知的纯化或检测工具相比和管理或行政要求更为相容。当蛋白以重组形式(本文中称为转基因蛋白)在天然也表达所述转基因蛋白的同 源蛋白的转基因生物或微生物中产生时，难于特异性地纯化或检测彼此同源的蛋白质的困 难就会出现。这尤其包括，从固有地在其基因组中具有所谓的“直系同源”基因(编码与转 基因编码的重组蛋白高度同源的蛋白)的生物中获取重组蛋白时的情况。在转基因动物中表达的人或动物转基因蛋白常常与在该转基因动物中天然表达 的内源性蛋白同源。在应该避免转基因蛋白与该天然的内源性同源蛋白的共提取或共检测 的情况下，该天然内源性同源蛋白的产生构成一个技术问题。当转基因重组蛋白是待用于制备药物的治疗性蛋白时，重组蛋白纯化制品中存在 的任何与该转基因蛋白同源的内源性蛋白都可能在服用该药物的患者中产生不想要的副 作用，包括诱导对该污染性天然蛋白的不想要的免疫应答，这种免疫应答可能损害医学治 疗的有效性，并且甚至有时会导致可能对患者健康潜在有害的自身免疫反应。随着在转基 因动物中生产的治疗性转基因蛋白的越来越多的使用，这些问题也越来越多地出现。因此，为了获得高度安全的治疗性产品，应当特异性地纯化转基因蛋白，使之存在非常少量的不想要的同源蛋白，并且如有可能，完全缺乏不想要的同源蛋白。确实，用于检测感兴趣的靶 蛋白的方法应该是特异的、敏感的和有效的。根据称为SELEX的方法选择的RNA型适体(单链核糖核酸分子)，可与目的蛋白特 异地结合。在Liu等，RNA aptamers specific for bovinethrombin (对牛凝血酶有特异 性的RNA适体)，J. Mol. Recognit.，2003 16，23-27中，作者给出了与牛凝血酶结合但不与 人凝血酶结合的RNA型适体。尽管单独地该文献显示通过SELEX法可以选择能辨别溶液中 的同源蛋白质的高特异性RNA适体，但是至今为止尚无文献描述过使用高特异性适体区分 同源蛋白的工业方法。高特异性适体的使用带来了很多技术问题。首先，适体通过SELEX法在溶液中选 择。为了适用于纯化或检测法，适体应该被固定在固相支持体上。有很多出版物显示，当
适体被固定化时，适体的结合性质(亲和力、特异性......)会受到损害。此外，RNA型适
体_在现有技术中描述的唯一高特异性适体类型——是非常不稳定的分子，其在室温会发 生改变。因此，RNA适体与工业纯化或检测方法并不相容。化学修饰的RNA可能是一个可 选方式，但是此类分子的目前合成成本无可争议地与工业规模应用不相容。因为抗体对目的蛋白的强亲和力以及它们的相对高特异性，抗体被广泛地用于蛋 白质的纯化和检测方法中。然而，抗体并不总是适用于靶蛋白的纯化或检测。事实上，在生物系统中制备抗体 具有所有的固有缺陷，包括污染病原体的风险、或纯化工程抗体的难度。此外，抗体通常是 免疫原性的，当对患者施用时可能诱导强免疫反应。因此，当抗体用于纯化治疗性蛋白时， 存在抗体或抗体片段留在含治疗性蛋白的溶液中并由此在服用这种溶液的患者中引起不 想要的反应的风险。这就是为什么在纯化方法中使用抗体难于与某些行政要求相容的原 因，特别是在农业-食品和医药工业中。而且，还得指出用于抗体的消毒方式是有限的，这 是因为抗体的敏感性蛋白性质，尤其是⑴在变性条件下(例如在尿素、DMSO等存在下)、 ( )使用高酸或碱PH值时、(iii)使用某些有害的有机溶剂时，或(iv)在高温下。最后， 值得提醒的是，抗体的选择是一个持久的过程(约6个月)，而获得纯化抗体是一项复杂的 工作，这导致相对高的选择和制备成本。因此，需要开发新的目的蛋白纯化或检测工具，其应该是有效的、容易实现的，并 且与已知方法相比应该更可靠。当溶液也可能包含与靶蛋白同源的蛋白质时，该改良方法 应该能选择性地纯化或检测存在于溶液中的靶蛋白。更特别地，需要开发新的纯化或检测 工具，其能提高自转基因生物生产治疗性转基因蛋白获得的产品的人用安全性。发明概述本发明的目的是提供用于纯化或检测存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包 括在进行该检测或纯化步骤之前，使所述溶液接触通过间隔区(spacer)固定在固相支持 体上的DNA适体的步骤，所述固定化适体与所述靶蛋白特异性结合，但不与也可能存在于 该溶液中的、与所述靶蛋白同源的任何蛋白结合。因此，本发明还涉及通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体的用途，所述固 定化适体与靶蛋白特异性结合，所述用途为用于纯化或检测存在于溶液中的所述靶蛋白， 其特征在于所述固定化适体不结合与所述靶蛋白同源的蛋白并且所述溶液可包含至少一种与所述靶蛋白同源的蛋白。本发明还涉及从包含所述靶蛋白且可能包含与所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中 特异性纯化靶蛋白的方法，其包括步骤(i)提供固相支持体，该固相支持体包括通过间 隔区固定在所述固相支持体上的DNA适体，其特征在于所述固定化适体与所述靶蛋白特 异性结合，但不结合与所述靶蛋白同源的蛋白，(ii)将所述固相支持体接触所述溶液，和 (iii)回收与所述适体结合的靶蛋白。本发明进一步涉及从包含所述靶蛋白且可能包含与所述靶蛋白同源的蛋白的溶 液中特异性检测靶蛋白的方法，其包括步骤(i)将所述溶液接触通过间隔区固定在固相 支持体上的DNA适体，所述固定化适体与所述靶蛋白特异性结合，但不结合与靶蛋白同源 的所述蛋白，和(ii)检测在所述适体与所述靶蛋白之间形成的复合物。附图简述

图1显示特异性结合人因子VII的适体与人血浆来源的FVII (HP FVII)之间的结 合。图1的曲线说明人抗-FVII适体与HP FVII之间随时间的结合，其中HP FVII浓度范 围为50至400nM。图2显示固定在芯片上的适体与HP FVII之间的相互作用的特异性。图2表明 在存在或不存在多克隆抗-FVII抗体时，固定在芯片上特异性结合人因子VII的适体与HP FVII之间随时间的结合。图3显示与人因子VII特异性结合的适体和兔血浆来源的FVII之间缺乏结合。图 3的曲线说明特异性结合人因子VII的适体与兔血浆来源的因子VII之间随时间的结合，其 中兔因子VII的浓度范围为50至400nM。图4显示特异性结合人因子VII的适体与HP FVII、兔因子VII或转基因人因子 VII之间的亲和力的差异。图4曲线说明特异性结合人因子VII的适体与HP FVII、兔因子 VII或转基因人因子VII之间随时间的结合，其中每种FVII的浓度为400nM。发明详述本发明提供用于纯化或检测存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括在进 行检测或纯化步骤之前，将所述溶液接触通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体的步 骤，所述固定化适体与所述靶蛋白特异性结合，但不与也可能存在于该溶液中的任何与所 述靶蛋白同源的蛋白结合。本发明进一步涉及通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体的用途，所述固定 化适体与靶蛋白特异性结合，用于纯化或检测存在于溶液中的所述靶蛋白，其特征在于所 述固定化适体不结合与所述靶蛋白同源的蛋白并且所述溶液可包含至少一种与所述靶蛋 白同源的蛋白。在用于纯化感兴趣的靶蛋白的方法中，当靶蛋白包含于起始介质(通常是起始溶 液)中时，在⑴特异性识别该给定的靶蛋白的适体和(ii)所述靶蛋白之间选择性地形成 复合物。之后，通过使所述适体与前面形成的复合物解离，回收待纯化的靶蛋白。在用于检测感兴趣的靶蛋白的方法中，当靶蛋白包含于起始介质(通常是起始溶 液)中时，在⑴特异性识别给定靶蛋白的适体和(ii)所述靶蛋白之间选择性地形成复合 物。之后，检测尤其是(i)在所述适体与所述感兴趣的蛋白之间形成的复合物、或(ii)与 所述适体复合的、或在之前形成的复合物解离后为游离形式的、感兴趣的靶蛋白。
本发明的另一目的是，提供从包含靶蛋白且可能包含与所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特异性纯化靶蛋白的方法，其包括以下步骤a)提供固相支持体，其包括通过间隔区固定在所述固相支持体上的DNA适体，特 征在于所述固定化适体与所述靶蛋白特异性结合，但不结合与所述靶蛋白同源的蛋白，b)将所述固相支持体接触所述溶液，和c)回收与所述适体结合的靶蛋白。本发明的进一步目的是，提供从包含靶蛋白且可能包含与所述靶蛋白同源的蛋白 的溶液中特异性检测靶蛋白的方法，其包括以下步骤a)将所述溶液接触通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体，所述固定化适体 与所述靶蛋白特异性结合，但不结合与所述靶蛋白同源的蛋白，和b)检测在所述适体与所述靶蛋白之间形成的复合物。如本文所用，“适体”旨在指单链核酸分子，其能够与蛋白特异性结合。适体通常包 括5至120个核苷酸，并且可通过称为selex (通过指数富集系统进化配体)的方法体外选 择。适体具有很多优点。因为它们的寡核苷酸性质，所以适体具有低免疫原性，并且对苛刻 的物化条件(存在尿素、dms0、强酸或碱ph值，使用有机溶剂或高温)具有高抵抗力，当其 用作亲和配体时，这使得多种消毒(sanitization)策略可以实施。此外，它们具有高度选 择性。最后，适体的生产具有相对适中的成本。如本文所用，“dna适体”旨在指由脱氧核糖核苷酸组成的适体，与由核糖核苷酸组 成的rna适体相对。dna适体在溶液中有利地稳定，因此可工业应用在靶蛋白的纯化或检测 中。如本文所用，“蛋白”是指氨基酸的聚合物。这包括蛋白、蛋白片段、遗传修饰 的蛋白、寡肽及其类似物。蛋白可以是抗体、抗病毒蛋白、激素、生长因子、凝血因子例如 因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因子 XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子II (凝血酶)、抗凝血酶III (AT III)、肝素辅因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白 S(PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和组织因子途径抑制剂(TFPI)。优选该蛋白为天然或修饰的因子VII或其片段。如前所述，“通过间隔区固定在固相支持体上的dna适体”(之后也称为“适体”) 用于本发明的方法，其能与给定靶蛋白选择性结合，所述适体对所述给定靶蛋白的“同源” 蛋白具有降低的结合能力或无结合能力。这意味着，根据本发明，仅使用如下适体该适体 能够显著地区分感兴趣的靶蛋白和不同于所述靶蛋白但与所述靶蛋白结构接近的蛋白。在本发明的某些实施方案中，用于区分靶蛋白与靶蛋白的“同源”蛋白的适体具有 这样的能力，即，所述适体对感兴趣的靶蛋白具有亲和力，通过解离常数值(Kd)(以摩尔浓 度表示)定义的该亲和力与所述适体对最接近的已知“同源”蛋白的解离常数值相比低至 少一个数量级。在本发明的一些其它实施方案中，适体不与感兴趣的靶蛋白的“同源”蛋白结合。 根据本发明，当通过常规测量方法(例如根据biacore 型检测和结合测量技术)不能检 测到适体与同源蛋白的结合时，该适体不与同源蛋白结合。作为举例，在实施例中已经证 实，当使用结合测量系统Biacore 时，与人因子vii选择性结合的seq id no. ι的适体不 以可检测的方式与兔因子vii结合。
适体选择性结合的“靶蛋白”可以是任何类型的蛋白。靶蛋白尤其可以是治疗性蛋白。“同源蛋白”或“与靶蛋白同源的蛋白”是指与靶蛋白具有显著的结构同源性的蛋 白。如本文所用，“同源”旨在主要指两种同源，分别是⑴由靶蛋白与同源蛋白之间 的氨基酸序列差异引起的同源，和(ii)由共价结合在氨基酸侧链上的附加化学基团的差 异(包括糖链(chaines osidiques)的差异)引起的同源。对本领域技术人员来说清楚 明显的是，感兴趣的靶蛋白和“同源”蛋白可以彼此不同于氨基酸序列的差异和糖链的差 异。作为举例说明，当氨基酸序列的差异发生在靶蛋白或同源蛋白的糖基化位点的氨基酸 上时，可能碰上两种类型的结构差异。根据本发明，给定的靶蛋白和相应的同源蛋白可以包含彼此具有至少50%氨基酸 同一性的序列。根据本发明，两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的同一性百分比 可通过使用具有缺省参数的Emboss匹配器-EBL0SUM62来计算，其中Gap_罚分为10. 0和 Extend_ 罚分为 0. 5。优选，靶蛋白与同源蛋白之间的氨基酸序列同一性为至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。如前所示，感兴趣的靶蛋白与同源蛋白之间的差异可能产生于两种蛋白之间的糖 基化差异。糖基化的差异涉及具有相同的氨基酸序列或具有相似的氨基酸序列但是不同的 聚糖结构的两个蛋白。聚糖结构为被移植到蛋白的氨基酸共有序列上的糖链。糖基化差异 可涉及N-或0-糖基化以及在N-或0-糖基化后发生的糖苷分支。糖基化的差异不仅可以 涉及有或没有这些链或支链，而且可以涉及有或没有某些糖(例如岩藻糖、甘露糖、葡糖胺 或半乳糖胺残基)。可用许多方法分析蛋白的糖基化。一种糖基化分析方法包括使用一种 或多种酶(PNGaseF、N-糖苷酶)或通过化学途径(胼解、消除)将蛋白脱糖基化，然后 直接分析在凝胶、毛细管电泳或HPLC上获得的聚糖(用紫外、荧光或MS检测)或在酶介导 的解聚(神经氨酸酶和半乳糖苷酶)或化学诱导的解聚(胼解，消除)之后分析以 便对所述聚糖定序。另一种分析方法为对全蛋白使用质谱法，这些技术被称为MALDI (基 质辅助激光解吸/电离)、MALDI-T0F (飞行时间)、ESI (电喷雾离子化)。在本发明的某些实施方案中，根据本发明的适体为与凝血因子特异性结合的适 体，所述凝血因子选自因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)、因子X(FX)、因子IX(因子IX)、 因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子II (凝血酶)、抗凝血酶III (AT III)、肝素辅因子II (HCII)、蛋白C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白S(PS)、因子V(FV)、von Willebrand因子(FvW)和组织因子途径抑制剂(TFPI)。有益地，适体与FVII特异性结合。 优选，根据本发明的适体与人因子VII特异性结合，但不与兔因子VII结合。反过来，根据 本发明的适体可以与兔因子VII结合，但不与人因子VII结合。与人因子VII特异性结合但不与兔因子VII结合的适体可以是包含与序列SEQ ID No. 1具有至少80%核苷酸同一性的核苷酸序列的适体。有益地，本发明的适体以如下解离常数值(Kd)表征的亲和力与靶蛋白结合，该解 离常数值为IpM至10 μ M、优选为IOnM至10 μ Μ。有益地，适体对靶蛋白的亲和力与适体对 同源蛋白的亲和力相比高1000至10000倍。
在根据本发明的纯化或检测方法中，DNA适体通过间隔区固定于固相支持体上。固定于固相支持体上的适体特别适合于检测或纯化存在于溶液中的靶蛋白。如本文所用，“间隔区”是指在适体与固相支持体之间插入的分子。有益地，该间隔 区与适体的一个末端以及与固相支持体结合。有益地，包括间隔区的这些结构不直接固定 适体在固相支持体上。间隔区的性质可根据本领域技术人员的知识选择；优选该间隔区为 非特异性寡核苷酸序列或聚乙二醇(PEG)。当其为非特异性寡核苷酸序列时，所述序列优选 含有至少5个核苷酸、优选5个至15个核苷酸。为了固定适体在间隔区上，适体可用各种化学基团进行化学修饰，例如能共价固 定适体的基团，例如硫醇、胺或任何其它能与存在于支持体上的化学基团反应的基团，或能 非共价固定适体的基团，例如生物素-链霉亲和素系统。这些技术也可用于固定间隔区到 固相支持体上。一旦通过间隔区固定在固相支持体上，有利地适体在其自由端(即不与间隔区结 合的末端)被修饰，包括但不限于化学修饰的核苷酸(例如2’ -氧甲基或2’ -氟嘧啶、 2’ _核糖嘌呤、亚磷酰胺)、反转核苷酸(reversednucleotide)、或化学基团(PEG、聚阳离 子、胆固醇)。这些修饰能保护适体免遭酶促降解。固相支持体可以是亲和色谱柱，包括源于琼脂糖或纤维素的凝胶或合成凝胶，例 如丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯或苯乙烯衍生物；芯片，例如适于表面等离子共振的芯片；膜， 例如聚酰胺、聚丙烯腈或聚酯膜；磁性或顺磁性珠。有益地，包含靶蛋白且可包含与所述靶蛋白同源的蛋白的溶液是生物溶液，例如 体液、细胞、细胞勻浆物、组织、组织勻浆物、器官或整个生物体。优选溶液是获自动物的液 态生物溶液，例如血、血源性产品、哺乳动物乳或哺乳动物乳来源的产品。可以是血浆、血浆 冷冻沉淀物、澄化的乳(clarified milk)或其衍生物。根据本发明的动物是没有叶绿体的、 活的多细胞的、非人真核生物。在特别优选的实施方案中，该溶液从转基因动物获得。有益 地，该溶液是哺乳动物乳或转基因哺乳动物乳来源的产品。根据本发明，转基因动物是哺乳 动物，例如奶牛、山羊、雌兔、猪、猴、大鼠、小鼠、或鸟、或昆虫例如蚊、蝇或蚕。在优选的实施 方案中，转基因动物是转基因哺乳动物，优选为转基因雌兔。有益地，该转基因哺乳动物在 能使所述转基因蛋白在所述转基因哺乳动物的乳中表达的特异性启动子控制下，在乳腺中 产生转基因蛋白。在转基因动物的乳中产生转基因蛋白的方法可包括以下步骤将包含编码转基因 蛋白的基因的DNA分子注射到非人哺乳动物的胚胎中，其中所述基因在编码天然分泌于乳 中的蛋白的基因的启动子(例如酪蛋白启动子、酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、乳 球蛋白或乳清酸性蛋白启动子(WAP))的控制下。然后将胚胎插入到相同物种的哺乳动物 雌性中。在胚胎来源的哺乳动物充分发育后，在该哺乳动物中诱导泌乳，之后收集乳。该乳 包含所述转基因蛋白。在EP 0527063中给出在非人哺乳动物雌性的乳中生产蛋白的方法的实例，可重 复该实例的教导以制备本发明的蛋白。含WAP启动子的质粒可以通过引入包含WAP基因启 动子的序列而获得，制备这种质粒以便接收外源基因置于WAP基因启动子的控制下。使用 含启动子以及编码本发明蛋白的基因的质粒，通过显微注射到雌兔胚胎的雄性原核中，获 得转基因雌兔。然后将该胚胎转移至激素预备的雌体的输卵管中。转基因的存在可以基于由出生的转基因幼兔提取的DNA，通过DNA印迹法揭示。通过特异性放射免疫试验可以确定 哺乳动物乳中的浓度。其它文献也描述了在非人哺乳动物雌性的乳中获得蛋白的方法。可以提及的文献 包括，但不限于，US 7，045，676 (转基因小鼠)和EP 1739170 (转基因哺乳动物中生产von Willebrand 因子)。因此，本发明的再一目的是，提供通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体的 用途，所述固定化适体与人因子VII特异性结合，用于纯化或检测存在于转基因雌兔乳中 的所述人因子VII，特征在于所述固定化适体不与兔因子VII结合，并且所述转基因雌兔 乳中可包含兔因子VII。本发明的进一步目的是，提供通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体的用 途，所述固定化适体与兔因子VII特异性结合，用于检测可能存在于转基因雌兔乳中的所 述兔因子VII，特征在于所述固定化适体不与人因子VII结合，并且在所述转基因雌兔乳 中包含人因子VII。人因子VII和兔因子VII具有约75%的氨基酸序列同源性(通过BLAST确定的)。本发明的进一步目的是，提供选择与靶蛋白特异性结合但不结合 与所述靶蛋白同 源的蛋白的适体的方法，其包括以下步骤a)在有利于结合的条件下将适体混合物接触与靶蛋白同源的所述蛋白，并回收不 与同源蛋白结合的那些适体，b)在有利于结合的条件下将步骤a)中所得的适体混合物接触所述靶蛋白，c)将那些未结合的适体从那些与所述靶蛋白结合的适体中分离，d)解离适体-靶蛋白对，e)扩增解离的适体以获得富含适体的混合物，其与靶蛋白结合但不结合与靶蛋白 同源的蛋白，和f)按需重复步骤幻、13)、(3)、(1)、6)多个循环，直至获得与靶分子特异性结合但不 结合与所述靶蛋白同源的蛋白的适体。用于选择本发明适体的方法与现有技术中所述的SELEX法有不少相同之处，但是 其额外地包括所谓的“扣除”步骤(步骤a)。因此，本发明的方法称为“扣除SELEX”。适体选择SELEX法为将蛋白接触DNA或RNA核酸组合文库(通常为1015分 子)，去除不与靶结合的核酸，分离并扩增与靶结合的核酸。重复该方法直至溶液充分地 富含对目的蛋白具有良好亲和力的核酸(Tuerk和Gold，“通过指数富集系统进化配体 噬菌体 T4DNA 聚合酶的 RNA 配体(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment :RNA ligandsto bacterioph age T4 DNA polymerase)，，(1990)Scien ce, 249(4968) 505-10以及Ellington和Szostak，“体外选择结合特异性配体的RNA分子 (In vitroselection of RNA molecules that bind specific ligands)，，(1990)Nature Aug30 ；346 (6287) :818_22)。SELEX 法的其它实例在 EP 0786469,EP 66893UEP 1695978、 EP 1493825中给出，其教导可被重新用于实施本发明的适体选择方法。可通过任何能从不与靶蛋白结合的适体中分离出与靶蛋白结合的适体(称为适 体-靶蛋白对)的方法，实现分离步骤(步骤C)。可通过很多现有技术已知的方法进行该 分离。因此，适体-靶蛋白对可被保留在硝酸纤维素滤膜上，而游离适体则不被保留。特异性保留适体-靶蛋白对的柱也可用于该分离步骤。也可使用其它方法，如液-液萃取、凝胶迁移检测或密度梯度离心。分离方法的选择将取决于靶蛋白的性质以及适体-靶蛋白对， 可以基于本领域技术人员已知的原则作出决定。解离步骤(步骤d)可通过任何能使所述化学物解离的方法实现。有益地，解离可 通过离子强度的增加或PH值的变化而发生。可通过任何能增加适体拷贝的量或数目的方法，实现步骤e)的扩增。有益地，适 体的扩增通过PCR(聚合酶链反应)来进行。有益地，扩增通过用于DNA的PCR或通过用于 RNA的RT-PCR来实现。“扣除SELEX”法的特征在于称为“扣除”的步骤(步骤a)，其能去除结合与靶蛋白 同源的蛋白的适体。在进行包括步骤a)、b)、c)、d)和e)的一个循环后，以下循环可重头 包括步骤a)、b)、c)、d)和e)，或者可用在之前循环的步骤e)中扩增的适体合并物从步骤 b)直接开始。因此，可以在每个新循环的开始执行扣除步骤a)，或者可以在完成至少一个 无步骤a)的循环后执行扣除步骤a)，直至获得与靶蛋白特异性结合但不结合与靶蛋白同 源的蛋白的适体。有益地，每二个或每三个循环进行一个步骤a)。以下实施例举例说明本发明，但不限制本发明的范围。
实施例实施例1 适体(SEQ No. 1)与人因子VII的结合包含SEQ ID No. 1的适体由Sigma-Proligo公司合成。SEQ No. 1 5’ PGGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGAGCCUAUGUAACAGAUGCAGAUCCCUAGUC⑶CCCAACACCAUA AC-3’ -生物素该适体通过嫁接生物素在其3'-端被修饰。粗体的核苷酸碱基(SEQNo. 1)被 2’ -氧甲基化，这可以通过使适体对核酸酶更具有抵抗力而使适体稳定。然后将该适体固 定在含有亲和素的SA芯片(Biacore GE)上。由此，以2700RU的固定率(其中IRU约相当 于Ipg固定化产品/mm2)，通过适体的3'-端，定向固定该适体。将纯化的人血浆来源的因子VII (HP FVII，纯度99 % )用运行缓冲液Ofepes 20mM pH = 8，NaCl 50mM, CaCl2 2mM和BSA 0. 01% )稀释，从而获得其中该人血浆来源的 因子VII的浓度水平为50、100、200和400nM的四个样品。将每个样品相继注射到相同的 含通过生物素-链霉亲和素相互作用固定的适体的芯片中。通过注射仅含有运行缓冲液的 空白而获得对照。在以20μ Ι/min的流速注射运行缓冲液到芯片240秒后，以相同的流速 进行所有注射120秒。然后以30 μ Ι/min的流速注射洗脱缓冲液(NaCl，5M)达60秒，以将 人血浆来源的因子VII与适体解偶联。一式两份进行每次注射(样品和空白)。芯片使得 可以通过表面等离子共振(RPS)实时观察人血浆源因子VII与固定化适体之间的相互作用 的产生和破坏。与固定化适体的结合导致由该装置记录的以共振单位(RU)表达的信号的 增加(图1)。用RPSBiacore TlOO装置(GE)实施这些测量。借助于Biaevaluation软件 (GE)，对所记录的相互作用进行建模。根据别构结合建模，估计适体与HP FVII的结合的Kd 值为1.4μΜ。为了证实与固定化适体结合的产品实际上为因子VII，在相同的芯片上进行包括(i)人血浆源因子VII 200nM和(ii)抗-FVII多克隆抗体IOOnM(Abcam)的注射序列。注 射和分析条件如上文所述的那些相同。如果适体实际上保留FVII，那么抗-FVII多克隆抗 体注射应该在抗体与结合适体的FVII结合之后引起信号增加(RU)。抗体单独被注射作为 对照。以RU表达的信号增加清楚地显示所述适体识别FVII (图2)。此实施例显示固定化后的适体可以以显著的亲和力与人血浆来源的因子VII特 异性结合。实施例2 适体(SEQ No. 1)与兔因子VII的结合将兔血浆来源的因子VII (American Diagnostica)在如实施例1相同的缓冲液中 稀释成50、100、200、400nM的浓度水平，之后在如实施例1相同的条件下注射到包含固定化 适体的相同芯片中。图3中所示的记录的RU信号说明，完全不存在适体与兔血浆来源的FVII的结合， 尽管兔血浆来源的FVII与人血浆来源的FVII之间存在高氨基酸序列同源性(氨基酸序列 同源性约为75% )。此实施例显示，该适体与人血浆来源的FVII特异性结合，但不与兔因子VII结合。实施例3 适体(SEQ No. 1)在人血浆源因子VII、转基因因子VII和兔血浆源因子 VII之间的亲和力差异在与实施例1相同的条件下，将人血浆源因子VII、兔血浆源因子VII和人转基因 因子VII相继注射到相同的芯片中。所得的数据(图4)显示，适体与HP FVII和转基因 FVII结合——具有不同但仍强的亲和力，但该适体不与兔因子VII结合。
权利要求
用于纯化或检测存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括在进行检测或纯化步骤之前，将所述溶液接触通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体的步骤，所述固定化适体与所述靶蛋白特异性结合，但不与所述靶蛋白的任何同源蛋白结合，该同源蛋白也可存在于该溶液中。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述靶蛋白与所述同源蛋白具有超过50%、优 选超过60 %、优选超过70 %、优选超过80 %、优选超过90 %的氨基酸序列同一性。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述靶蛋白与所述同源蛋白具有糖基化 同源性。
4.根据权利要求1 3中任一项的方法，其特征在于所述靶蛋白为凝血因子，其选 自因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因 子XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子II (凝血酶)、抗凝血酶III (AT III)、肝素辅因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白 S (PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和组织因子途径抑制剂(TFPI)。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于所述靶蛋白为人因子VII或兔因子VII。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述同源蛋白为兔因子VII或人因子VII。
7.根据权利要求5或6的方法，其特征在于所述适体包括与SEQIDNo. 1具有至少 80%同一性的核苷酸序列。
8.根据权利要求1 7中任一项的方法，其特征在于所述固相支持体选自芯片、亲和 色谱柱、磁性或顺磁性珠和膜。
9.根据权利要求1 8中任一项的方法，其特征在于所述间隔区选自非特异性寡核 苷酸序列或聚乙二醇(PEG)类型的序列。
10.根据权利要求1 9中任一项的方法，其特征在于所述溶液为体液，尤其是乳、乳 源产品、血或血源产品。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于所述溶液为转基因哺乳动物乳或转基因哺 乳动物乳来源的产品。
12.用于从包含靶蛋白且可包含与所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特异性纯化靶蛋白 的方法，其包括以下步骤a)提供固相支持体，其包括通过间隔区固定在所述固相支持体上的DNA适体，特征在 于所述固定化适体与所述靶蛋白特异性结合，但不结合与所述靶蛋白同源的蛋白，b)将所述固相支持体接触所述溶液，和c)回收与所述适体结合的靶蛋白。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于所述靶蛋白与所述同源蛋白具有超过50%、 优选超过60 %、优选超过70 %、优选超过80 %、优选超过90 %的氨基酸序列同一性。
14.根据权利要求12或13的方法，其特征在于所述靶蛋白为凝血因子，其选自 因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因子 XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子11(凝血酶)、抗凝血酶III(AT III)、肝素辅因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白 S(PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和组织因子途径抑制剂(TFPI)，优选人或兔因子VII。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于所述适体包括与SEQIDNo. 1具有至少80%同一性的核苷酸序列。
16.根据权利要求12 15中任一项的方法，其特征在于所述固相支持体选自芯片、 亲和色谱柱、磁性或顺磁性珠和膜。
17.根据权利要求12 16中任一项的方法，其特征在于所述间隔区选自非特异性寡 核苷酸序列或聚乙二醇(PEG)类型的序列。
18.根据权利要求12 17中任一项的方法，其特征在于所述溶液为体液，尤其是乳、 乳源产品、血或血源产品。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于所述乳为转基因哺乳动物乳或转基因哺乳 动物乳来源的产品。
20.用于从包含靶蛋白且可包含与所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特异性检测靶蛋白 的方法，其包括以下步骤a)将所述溶液接触通过间隔区固定在固相支持体上的DNA适体，所述固定化适体与所 述靶蛋白特异性结合，但不结合与所述靶蛋白同源的所述蛋白，和b)检测在所述适体与所述靶蛋白之间形成的复合物。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于所述靶蛋白与所述同源蛋白具有超过50%、 优选超过60 %、优选超过70 %、优选超过80 %、优选超过90 %的氨基酸序列同一性。
22.根据权利要求20或21的方法，其特征在于所述靶蛋白为凝血因子，其选自 因子 VII (FVII)、因子 VIII (FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI (FXI)、因子 XII (FXII)、因子XIII (FXIII)、因子11(凝血酶)、抗凝血酶III(AT III)、肝素辅因子 II (HCII)、蛋白 C(PC)、凝血调节蛋白(TM)、蛋白 S(PS)、因子 V(FV)、von Willebrand 因子 (Fvff)和组织因子途径抑制剂(TFPI)，优选人或兔因子VII。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于所述适体包括与SEQIDNo. 1具有至少80% 同一性的核苷酸序列。
24.根据权利要求20 23中任一项的方法，其特征在于所述固相支持体选自芯片、 亲和色谱柱、磁性或顺磁性珠和膜。
25.根据权利要求20 24中任一项的方法，其特征在于所述间隔区选自非特异性寡 核苷酸序列或聚乙二醇(PEG)类型的序列。
26.根据权利要求20 25中任一项的方法，其特征在于所述溶液为体液，尤其是乳、 乳源产品、血或血源产品。
27.根据权利要求26的方法，其特征在于所述乳为转基因哺乳动物乳或转基因哺乳 动物乳来源的产品。
全文摘要
本发明涉及用于纯化或检测存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括在进行检测或纯化步骤之前，将所述溶液与和所述靶蛋白特异性结合的适体接触的步骤，其中所述适体不与也可能存在于溶液中的与所述靶蛋白同源的任何蛋白结合。
文档编号G01N33/68GK101821282SQ200880111453
公开日2010年9月1日 申请日期2008年8月13日 优先权日2007年8月14日
发明者A·施图鲁, F·戴诺, G·佩雷, L·塞列特 申请人:Lfb生物技术公司