一种被动显微注射方法及其在细胞显微注射中的应用

本发明涉及显微操作领域，具体涉及一种无需施加额外压力即可完成显微注射的被动显微注射方法。

背景技术：

显微注射是面向生物医学工程的显微操作的重要内容，由于微米尺度微针内虹吸效应的存在，当微针口径较小时将液体注射出微针并不容易。目前显微注射方法多为主动注射方法，主动利用较大正压来达到将溶液注出注射针管的目的。常用的主动注射方法有脉冲注射、基于平衡压模型注射等。其中，脉冲注射方法通过提供短时间、高压强的脉冲来进行注射，利用这种方法可以在标定后实现大存量条件下的精准显微注射；基于平衡压模型注射是在微针管内吸入少量的溶液使液面位于微针管前端位置，通过增大压强来实现显微注射。但是，在细胞显微注射中，无论是脉冲注射，还是基于平衡压模型注射都会对细胞提供瞬间较大压力，继而对细胞造成潜在的伤害。因此，目前亟需一种无需额外压力即可进行注射的方法。

技术实现要素：

基于现有脉冲注射、平衡压模型注射等主动注射方式存在的上述缺陷，本发明提供了一种被动显微注射方法，该方法无需施加额外压力即可实现定量显微注射，可以有效避免细胞显微注射中，对细胞造成潜在的伤害。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种被动显微注射方法，该方法包括以下步骤：

s1，在开口半径为r的注射微针内装入注射液，通过显微操作系统移动注射微针并刺入注射目标；

s2，向注射微针内施加一定压强的气压以平衡注射针微管内的虹吸效应；

s3，通过快速撤针的方式，将注射微针内的注射液甩入注射目标内，实现被动注射，在这一过程中，通过控制注射微针的移动时间t、注射微针的移动速度u，可实现被动注射方式下的定量注射。

上述方案中，所述注射微针的开口截面呈圆形，开口处设有刺入针尖。

上述方案中，所述步骤s3中，被动注射方式下定量注射的注射体积vinject，可通过以下公式计算得到：

根据纳维斯托克斯方程推导得，在装入液体的微型平管内提供气压以平衡微管内虹吸效应，以移动速度u快速后撤微管时，微管内液体与管壁间的相对速度为：

根据相对速度公式做积分得微管注射出的液体体积为：

其中：u为注射微针的移动速度；r为注射微针的开口半径；t为注射微针移动的时间；v为注射液的运动粘度；r为同一圆平面上，液体质点到注射微针中心的距离；j1(λn)和分别为0阶和1阶贝塞尔函数；λn为是0阶贝塞尔函数等于0的解；n为无量纲自然数；

上述公式中，注射微针移动速度u、注射微针移动时间t以及微针开口半径r与注射体积vinject，存在如下线性关系：固定微针开口半径r和注射微针移动时间t，仅增大微针移动速度u，注射体积viniect随微针移动速度u的增大而增大，vinject与u间呈线性关系；固定微针开口半径r和微针移动速度u，仅增大注射微针移动时间t时，此处t为无量纲量，当t在0～1s之间时，注射体积vinject随微针移动时间t的增大而近似对数曲线增大，当t大于1s时注射体积vinject不再增大；固定注射微针移动时间t和注射微针移动速度u，仅增大微针开口半径r，注射体积vinject随微针开口半径r增大而近似指数曲线增大；通过调节微针移动速度u、微针移动时间t以及微针开口半径r实现定量注射。

进一步地，本发明所述的被动显微注射方法可应用于细胞显微注射中，与现有细胞显微注射方法相比，可以有效减少对细胞造成的潜在伤害。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

本发明所述的被动显微注射方法，通过在装入注射液的注射微针内提供气压以平衡微针管内虹吸效应，并向撤针方向快速移动微针，微针内的液体会被甩进注射目标，达到显微注射的目的，这种被动显微注射方法通过调节注射微针移动速度u、注射微针移动时间t以及微针开口半径r，即可控制注射体积。与传统方法相比，这种被动注射方法仅需要进行压强控制，控制过程极为简便，且在注射过程中不提供额外正压，可应用于细胞的显微注射中，在注射过程中仅需提供与细胞内压大小相适应的平衡压，不提供额外正压，可有效降低注射过程对细胞造成的伤害。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所述被动显微注射方法的步骤流程图。

图2是注射微针疏水处理前后微针的图像；图2(a)是亲水微针内气液交界面图；图2(b)是亲水微针注射出液滴形状图；图2(c)是疏水微针内气液交界面图；图2(d)是疏水微针注射出液滴形状图。

图3是注射体积标定实验中微针注射液滴的图像；图3(a)到(1)是在注射微针内提供平衡压并快速移动微针时注射出液滴的过程拍摄图像。

图4是标定实验获得的注射体积vinject与微针开口半径r、微针移动速度u和微针移动时间t之间的关系回归曲线；图4(a)是固定注射微针移动速度u时，注射体积vinject与微针针开口半径r和微针移动时间t间的回归曲线；图4(b)是固定微针移动速度u时，注射平均流速vinject与微针针尖半径r间的关系曲线。

图5是理论分析的注射体积vinject与微针开口半径r、注射微针移动速度u和微针移动时间t间的关系曲线；图5(a)是固定微针开口半径r和微针移动时间t时，注射体积vinject与微针移动速度u之间的关系曲线，图5(b)是固定微针针尖半径r和微针移动速度u时，注射体积vinject与微针移动时间t之间的关系曲线；图5(c)是固定微针移动时间t时，注射体积vinject与微针开口半径r和微针移动速度u之间的关系曲线。

图6是对斑马鱼卵进行被动注射实验过程的图像。图6(a)是注射微针未刺入斑马鱼卵的图像；图6(b)是将注射微针刺入斑马鱼卵卵黄并提供斑马鱼卵内压大小平衡压的图像；图6(c)是平衡压条件下快速撤针实现被动注射的图像；图6(d)是将微针撤离斑马鱼卵完成注射的图像。

图7是斑马鱼卵注射实验中曝光时间为65ms时，斑马鱼卵的梯度荧光图像，注射过程微针移动速度u固定为1000um/s；图(a)、(b)、(c)是开口半径r＝10um、20um、25um的注射微针；微针移动时间t＝0.5s时被动注射的斑马鱼卵荧光图像。图(d)、(e)、(f)是开口半径r＝10um、20um、25um的微针，微针移动时间t＝1s时被动注射的斑马鱼卵荧光图像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：如图1的步骤流程图所示，一种被动显微注射方法，包括以下步骤：

s1，在开口半径为r的注射微针内装入注射液，通过显微操作系统移动注射微针并刺入注射目标；

s2，向注射微针内施加与注射目标内压大小相适应的气压以平衡注射针微管内的虹吸效应；

s3，通过快速撤针的方式，将注射微针内的注射液甩入注射目标内，实现被动注射，在这一过程中，通过控制注射微针的移动时间t、注射微针的移动速度u，可实现被动注射方式下的定量注射。

本实施例1中，所述注射微针的开口截面呈圆形，开口处设有刺入针尖。

本实施例1中，被动注射方式下定量注射的注射体积vinject，可通过以下公式计算得到：

其中：u为注射微针的移动速度；r为注射微针的开口半径；t为注射微针移动的时间；v为注射液的运动粘度；r为同一圆平面上，液体质点到注射微针中心的距离；j1(λn)和分别为0阶和1阶贝塞尔函数；λn为是0阶贝塞尔函数等于0的解；n为无量纲自然数；

上述公式中，注射微针移动速度u、注射微针移动时间t以及微针开口半径r与注射体积vinject，存在如下线性关系：

(1)固定微针开口半径r和注射微针移动时间t，仅增大微针移动速度u，注射体积vinject随微针移动速度u的增大而增大，vinject与u间呈线性关系；

(2)固定微针开口半径r和微针移动速度u，仅增大注射微针移动时间t时，此处t为无量纲量，当t在0～1s之间时，注射体积vinject随微针移动时间t的增大而近似对数曲线增大，当t大于1s时，注射体积vinject不再增大；

(3)固定注射微针移动时间t和注射微针移动速度u，仅增大微针开口半径r，注射体积vinject随微针开口半径r增大而近似指数曲线增大。

因此，在被动显微注射过程中，通过调节微针移动速度u、注射微针移动时间t以及微针开口半径r，即可实现定量注射。

实施例2：如图2-3所示，为了验证本发明实施例1所述被动显微注射方法的有效性以及式(i)所示计算公式的准确性，本发明采用实施例1所述的被动显微注射方法进行了注射体积vinject的标定实验，具体方法如下：

步骤1：在石蜡油溶液中对开口半径为r的注射微针进行疏水处理；

步骤2：向疏水处理后的注射微针内装入注射液，并在注射微针内提供一定压强的气压以平衡微针管内虹吸效应；

步骤3：向撤针方向以移动速度u＝1000um/s，快速移动微针，微针内液体被甩出实现被动显微注射。

在步骤3中，可通过调节注射微针移动速度u、微针移动时间t以及微针开口半径r来控制注射体积。

本实施例中标定实验使用了微针开口半径r为5um、10um、20um、25um的四种疏水注射微针，记录实验过程中注射液滴随时间变化的视频。

其中，由于注射微针做了疏水处理且注射液和石蜡油不相容，微针甩出的注射液滴呈球形，可通过计算球形液滴的体积，计算实际注射体积vinject。

具体地，本实施例2中：

图2给出了疏水处理前后微针气液交界面形状及微针注射出液滴形状示意图；图2(a)是亲水注射微针内气液交界面图；图2(b)是亲水注射微针注射出液滴形状图；图2(c)是疏水微针内气液交界面图；图2(d)是疏水微针注射出液滴形状。

图3是注射体积vinject标定实验中注射液滴的图像，(a)到(l)是在注射微针内提供平衡压并快速移动微针时注射出液滴的过程。

本实施例2中，注射体积vinject标定实验结果如下：

(1)标定实验中注射体积vinject与微针开口半径r以及微针注射时间t间的关系如图4所示。

其中，图4(a)是四种开口半径的微针注射体积vinject与注射时间t间的关系，图4(b)是被动注射平均注射速度与微针开口半径r之间的关系。

图5是本发明理论分析的注射体积vinject与微针开口半径r、注射微针移动速度u和微针移动时间t间的关系曲线；图5(a)是固定微针开口半径r和微针移动时间t时，注射体积vinject与微针移动速度u之间的关系曲线，图5(b)是固定微针开口半径r和微针移动速度u时，注射体积vinject与微针移动时间t之间的关系曲线；图5(c)是固定微针移动时间t时，注射体积vinject与微针开口半径r和微针移动速度u之间的关系曲线。

通过理论分析及实际验证，可得结论如下：通过调节微针移动速度u、微针移动时间t以及微针开口半径r可以有效控制注射体积；注射体积vinject随微针移动速度u增大而线性增大、随微针移动时间t增大而近似对数曲线增大、随微针开口半径r增大而近似指数曲线增大。

(2)当微针移动速度u＝1000um/s且被动注射时间t＝1s时不同开口半径微针的注射体积vinject如表1所示

表1

其中，标定注射量由计算微针甩出的球形液滴体积得到；理论注射量由将上述三种参数(u、t、r)代入公式(i)计算得到。

实验结果表明，理论注射体积与标定注射体积之间误差很小。理论注射体积与标定注射体积间的误差主要由微针内液体注出时不可瞬间停止导致。后续细胞注射实验中注射量以标定结果为准。

实施例3：如图6、图7所示。本发明将实施例1所述的被动显微注射方法应用于细胞显微注射中。

本实施例3中，所选注射目标为斑马鱼卵卵黄。

具体地，一种斑马鱼卵被动注射荧光溶液实验方法如下：

步骤1：在吸持微针内提供负压固定待注射斑马鱼卵，移动装入荧光溶液的注射微针并刺入斑马鱼卵卵黄；

步骤2：在注射微针内提供鱼卵内压大小3.1kpa的平衡压，向撤针方向以速度u＝1000um/s快速移动微针，微针内荧光液体被甩入斑马鱼卵卵黄，实现显微注射；

步骤3：将注射微针内压强减小为0并将微针撤出细胞完成注射。

本实施例3中，通过调节微针移动速度u、微针移动时间t以及微针开口半径r来控制注射体积。斑马鱼卵注射实验使用了微针开口半径r为10um、20um、25um的三种注射微针，每种微针做了移动时间t为0.5s和1s的两组实验。

根据表1的标定结果可知：当微针移动速度u＝1000um/s，微针移动时间t＝1s，微针开口半径r为10um、20um、25um，斑马鱼卵卵黄中荧光溶液的注射体积vinject分别为130nl、350nl、1015nl。

进一步地，本实施例中斑马鱼卵被动注射实验过程如图6所示，图6(a)是注射微针未刺入斑马鱼卵的图像；图6(b)是将注射微针刺入斑马鱼卵卵黄并提供斑马鱼卵内压大小平衡压的图像；图6(c)是平衡压条件下快速撤针实现被动注射的图像；(d)是将注射微针撤离斑马鱼卵完成注射的图像。

荧光显微镜下曝光时间为65ms时斑马鱼卵的荧光图像如图7所示，其中图7(a)、(b)、(c)是微针开口半径r＝10um、20um、25um的微针，移动时间t＝0.5s时被动注射的斑马鱼卵荧光图像。图7(d)、(e)、(f)是微针开口半径r＝10um、20um、25um的微针，移动时间t＝1s时被动注射的斑马鱼卵荧光图像。注射后鱼卵的荧光强度与被动注射的注射体积一致，可以证明被动注射方法的有效性。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。