本发明涉及一种肿瘤细胞器中异常微环境激活的荧光诊断化学治疗前药化合物，更具体地说是一种基于靶向高尔基体被ph激活后释放抗癌药物阿霉素的前药分子，同时进行双光子荧光成像配合肿瘤诊断和治疗的前药化合物及制备，属于药物分析化学领域。
背景技术：
过去的研究表明，癌细胞的能量代谢与正常组织明显不同，无论氧气供应是否充足，多数癌细胞都保持着较高的糖酵解速率，催化了二氧化碳和水向碳酸的可逆转化，并从细胞膜中扩散出来，导致h+在癌症微环境中积聚。同时，癌细胞的细胞外ph值比正常细胞低，这种差异性为癌症的选择性治疗提供了基础。根据这种ph值的差异，可以开发对ph敏感的前药来靶向癌细胞，从而增加组织部位的药物浓度，从而提高药物功效。高尔基体的ph稳态影响着许多不同的生理过程，研究表明，肿瘤细胞中跨膜蛋白165（tmem165）的缺乏会通过干扰高尔基体的ph稳态而导致高尔基体糖基化异常。由于缺乏用于实时监测高尔基体ph的有效工具，因此仍然缺乏证明tmem165参与高尔基体中h+转运的证据。
利用药物抑制肿瘤生长的化学疗法，是癌症的主要治疗方式。然而，由于较低的生物利用率和无法特异性的在肿瘤中积累等缺点，常规化学疗法常常造成治疗效率低和毒副作用大的情况。因此，新型癌症化疗的关键性挑战在于增强对肿瘤细胞的选择性并提高治疗效果。解决上述问题的策略之一是使用分子前药，其具有调节药物释放的能力，可以被独特的肿瘤微环境低ph选择性激活。前药通常对正常细胞无毒，并通过特异性激活在肿瘤细胞中具有高毒性。这种方法的另一个好处是，前药可以与荧光报告基因（主要是荧光染料）结合使用，以实现靶向肿瘤的荧光诊断和实时监测前药的活化。目前已经开发了几种基于荧光纳米粒子的ph响应前药系统，以通过foster共振能量转移（fret）监测细胞内阿霉素（dox）的释放。但是，由于对连接长度和刚性的严格要求以及对荧光团的正确匹配，fret方法几乎不能应用于单分子前药系统中以直接监测药物释放，因此我们选择ict机理进行单分子前药系统的构建。
本发明公开了一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药及其制备方法。该前药分子将靶向高尔基体的l-半胱氨酸基团，抗癌药物阿霉素（dox），与双光子荧光团结合，在肿瘤细胞因跨膜蛋白165缺乏而导致高尔基体酸化的情况下，异常变化的ph敏感地触发裂解反应，不仅激活荧光基团在细胞成像中生成双光子荧光，还释放了活性阿霉素用于癌症治疗。优势在于，ph激活的前药为体内癌症诊断和靶向高尔基体抗癌化疗提供了新的平台，成功应用于体内追踪药物的释放以及异种移植肿瘤小鼠模型的治疗。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题：一是提供一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药及其制备方法，所述前药化合物具有对癌症同时进行双光子荧光成像诊断和释放药物治疗的优点。二是提供一种荧光诊断试剂对高尔基体ph进行有效，准确和原位的测量。三是提供一种前药化合物，具有ph激活后进行高效药物释放的优点。四是提供一种在异种移植肿瘤小鼠模型中进行体内追踪药物释放并治疗的应用。
为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下：
本发明提供一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药，具有如下分子结构式：
化合物ngd
本发明还提供一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药的制备方法，步骤包括：
（1）(a)将4-溴-1,8-萘酐（1eq），β-丙氨酸-boc（1-1.5eq）和dmap（1-1.5eq）溶于乙醇溶液中，将反应混合物搅拌并回流加热20-24小时，待冷却至室温，过滤得到白色固体化合物1；(b)将化合物1（1eq）和对苯二胺（9-10eq）溶解在乙二醇甲醚中，搅拌混合物并回流7-10小时，冷却至室温后，柱纯化（二氯甲烷/乙醇）得到黄色固体化合物2；
（2）(c)将化合物2（1eq）与4-（2-n-boc-肼基）苯甲酸（1-1.5eq）溶解在无水乙醇溶液中，加入edc·hcl（1eq）和nhs（0.4-0.6eq）后在室温下反应22-26小时，柱纯化得到固体化合物3；(d)将化合物3溶解在二氯甲烷中，添加tfa后在冰浴中搅拌30-40分钟，以除去boc基团得到化合物4；(e)将盐酸dox（1eq）和化合物4（3-3.2eq）溶于甲醇溶液中，加入三氟乙酸（0.5-1ml），将溶液在室温下避光搅拌22-26小时，浓缩后用乙腈结晶，通过离心分离红色固体，用体积比1：（8-12）甲醇-乙腈混合溶液洗涤，真空干燥后得到化合物5；
（3）(f)将化合物5添加至体积比1：（1-1.5）tfa-dcm的混合溶液中，搅拌2-4小时后加入乙醚，将沉淀过滤并用乙醚洗涤，得到化合物6；(g)在氮气保护下，将化合物6（1eq）溶解在二甲基甲酰胺中，滴加三乙胺（1-1.5ml），加入dcc和dmap后，将混合物搅拌10-20分钟后，加入l-半胱氨酸（1-1.5eq），将混合物搅拌20-24小时，柱纯化（乙酸乙酯/乙醇）得到化合物ngd。
本发明的优点:
本发明的前药分子，具有监测化学药物的生物分布和治疗效果的优势。
本发明的前药分子，包含抗癌药物阿霉素（dox）和双光子荧光团，可用于原位监测高尔基体ph活性和抗肿瘤治疗。
本发明的前药分子，显示出相当高的活性，并且对肿瘤生长具有明显的抑制作用。
本发明的前药分子，集双光子荧光成像辅助癌症诊断、高药物上载量，药物可控释放等优势于一体。
因此，本发明是一种非侵入性，在肿瘤细胞内实现dox持续释放，并伴有连续双光子荧光发射，可以对肿瘤生长进行有效抑制的药物释放和诊断工具。在药物化学分析检测领域具有广阔的应用前景。
1.一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药的制备方法，其特征在于，所述化合物结构如式ⅰ所示：
式ⅰ；
该方法的制备步骤如下：
（1）(a)将4-溴-1,8-萘酐，β-丙氨酸-boc和dmap溶于乙醇溶液中，将反应混合物搅拌并回流加热20-24小时，待冷却至室温，柱纯化得到白色固体化合物1；(b)将化合物1和对苯二胺溶解在乙二醇甲醚中，搅拌混合物并回流7-10小时，冷却至室温后，柱纯化得到黄色固体化合物2；
（2）(c)将化合物2与4-（2-n-boc-肼基）苯甲酸溶解在无水乙醇溶液中，加入edc·hcl和nhs后在室温下反应22-26小时，柱纯化得到固体化合物3；(d)将化合物3溶解在二氯甲烷中，添加tfa后在冰浴中搅拌30-40分钟，以除去boc基团得到化合物4；(e)将盐酸dox和化合物4溶于甲醇溶液中，加入三氟乙酸，将溶液在室温下避光搅拌22-26小时，浓缩后用乙腈结晶，通过离心分离红色固体，用甲醇-乙腈混合溶液洗涤，真空干燥后得到化合物5；
（3）(f)将化合物5添加至tfa和dcm的混合溶液中，搅拌2-4小时后加入乙醚，将沉淀过滤并用乙醚洗涤，得到化合物6；(g)在氮气保护下，将化合物6溶解在二甲基甲酰胺中，滴加三乙胺，加入dcc和dmap后，将混合物搅拌10-20分钟后，加入l-半胱氨酸，将混合物搅拌20-24小时，柱纯化得到化合物ngd
2.根据权利要求1所述的一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）(a)中4-溴-1,8-萘酐，β-丙氨酸-boc和dmap摩尔比范围为1：（1～1.5）：（1～1.5）；4-溴-1,8-萘酐溶于无水乙醇溶液的摩尔浓度范围为0.2～0.5mol·l-1；(b)中化合物1和对苯二胺摩尔比范围为1：（9～10）；化合物1溶于乙二醇甲醚的摩尔浓度范围为0.1～0.15mol·l-1；柱纯化中二氯甲烷和乙醇体积比为（20～10）：1。
3.根据权利要求1所述的一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）(c)中化合物2与4-（2-n-boc-肼基）苯甲酸摩尔比范围为1：（1～1.5）；edc·hcl和nhs摩尔比范围为1：（0.4～0.6）；(d)中化合物3溶于二氯甲烷的摩尔浓度范围为0.0075～0.01mol·l-1；(e)中盐酸dox和化合物4摩尔比范围为1：（3～3.2）；化合物4溶于甲醇的摩尔浓度范围为0.015～0.02mol·l-1；三氟乙酸体积为0.5～1ml；甲醇和乙腈体积比为1：（8～12）。
4.根据权利要求1所述的一种靶向高尔基体ph响应的双光子诊疗前药的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）(f)中化合物5溶于tfa和dcm混合溶液的摩尔浓度范围为0.1～0.15mol·l-1；tfa和dcm积比为1：（1～1.5）；(g)中化合物6和l-半胱氨酸摩尔比范围为1：（1～1.5）；化合物6溶于二甲基甲酰胺的摩尔浓度范围为0.05～0.08mol·l-1；三乙胺体积为1～1.5ml；柱纯化中乙酸乙酯和乙醇体积比为（10～5）：1。