本发明涉及基因工程领域，更具体地涉及一种产5-酮果糖的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法以及应用。
背景技术：
目前，世界范围内的肥胖、糖尿病、高血压和高血脂症等体重过度增加相关疾病的患病率和发病率显著增加，而高脂肪高热量是导致这种情况的主要原因。在中国这一现象尤为严重，肥胖患者与糖尿病患者数量已接近2亿，并呈现出低龄化趋势。在这一环境下，人们越来越重视食品的安全性和对人体健康的影响。低热量甜味剂对消费者的身心都有益处。例如，低热量甜味剂能有效保持体重、减少蛀牙、降低血糖、改善肠道菌群。不仅如此，它们也是有益于健康的一种生活方式。目前市面上常见的低热量甜味剂主要包括阿斯巴甜、安赛蜜、糖醇、d-塔格糖、甜菊糖苷及枫叶糖浆等。近年来，阿斯巴甜、安赛蜜等产品的食用安全性问题屡被提出。此外，一些天然来源的低热量甜味剂存在不良后味及异味，例如从植物甜叶菊中提取的甜味剂甜菊糖苷具有类似甘草的味道，因此它们的适用性不是很广泛。所以，无不良后味及异味、不能被肠道菌群代谢、食用安全的低热量甜味剂成为研究的热点。
德国专利de102007026713公开了一种可以作为天然甜味剂的5-酮果糖，5-酮果糖由纯化的5-酮基果糖脱氢酶生成。新型天然甜味剂5-酮果糖因其不能被肠道菌群代谢使其具有低热量的优点，同时它还具有与果糖一般的天然甜味，也具有与果糖相当的高甜度，具有相当高的开发价值。5-酮果糖也可以作为合成吡咯烷亚氨基糖的初始原料，吡咯烷亚氨基糖作为一种糖苷酶抑制剂被广泛应用于医药行业(baxterandreitz(1994)j.org.chem.59:3175-3185)。
已报道的5-酮果糖合成方法主要是生物酶法和微生物发酵法。例如，2012年有研究者利用纯化的吡喃糖-2-氧化酶催化l-山梨糖生产5-酮果糖，产量可达180g/l(schneideretal.biotechnol.bioeng.2012109:2941-2945)。但是，该方法的生产周期较长，原料l-山梨糖价格较高，生产过程中使用的是纯化的酶来生产5-酮果糖，酶的制备成本高，该方法的商业化应用价值不大。美国专利us3206375a公开了利用多种野生型醋酸杆菌发酵果糖生产5-酮果糖的方法，但是这些微生物的生产效率很低，转化100g/l的果糖，仅产生10～16g/l的5-酮果糖。uwedeppenmiere等在2018年报道，利用gluconobacteroxydans621h工程菌连续流加底物的方式发酵果糖生产5-酮果糖，产物5-酮果糖浓度可达489g/l、时空产率为8.6g/l/h，产率为98％。之后osaoadachia等在2020年报道，以d-甘露醇为原料，利用gluconobacterfrateuriichm43发酵或静息细胞催化生产5-酮果糖的方法，分别实现65％和近100％的产率，但是底物投料仅为50g/l。由此可见，以上生产5-酮果糖的生产效率还有待提高，不适合于5-酮果糖的工业化生产。因此，一种能够在高底物浓度下高效生产5-酮果糖的菌株的获得，具有很好的应用前景和商业开发意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种产5-酮果糖的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法以及应用，从而解决现有技术中用于制备5-酮果糖的生物酶法存在生产周期长、制备成本高的缺陷，微生物发酵法又存在底物投料率低导致生产效率低下，因而无法满足当前5-酮果糖的大量工业化生产需求的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种产5-酮果糖的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌是通过将含有果糖脱氢酶基因fdh的重组载体转化氧化葡萄糖酸杆菌构建而成，所述果糖脱氢酶基因fdh的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述氧化葡萄糖酸杆菌的保藏号为dsm2003。
所述的果糖脱氢酶基因fdh来源于日本葡萄糖酸杆菌(gluconobacterjaponicuscgmcc1.15609.)。
本发明中，较佳地，所述的重组载体含有saci、xbai、bamhi、ecori等酶切位点。较佳地，所述重组载体还含有强启动子tufb。
本发明所述的重组载体为本领域常规的重组载体，能够导入而含有上述的果糖脱氢酶基因fdh即可。
较佳地，所述含有果糖脱氢酶基因fdh的重组载体的构建所采用的是pbbr1mcs5质粒。
较佳地，所述的重组载体为将上述的强启动子tufb通过saci和xbai两个酶切位点连接到质粒载体pbbr1mcs5而得到质粒pbbr1mcs5-ptufb；然后将所述的果糖脱氢酶基因fdh导入质粒pbbr1mcs5-ptufb而得的质粒pbbr1mcs5-ptufb-fdh，所述果糖脱氢酶基因fdh的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明的创造性主要在于，首次发现将来源于日本葡萄糖酸杆菌(gluconobacterjaponicuscgmcc1.15609)的果糖脱氢酶fdh异源表达在氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacteroxydansdsm2003)中，果糖脱氢酶的催化效率有了巨大的提升；其次，发明人还进一步发现，通过在发酵罐中利用上述基因工程菌发酵或者静息细胞催化均能实现高浓度底物转化，得到高的转化率和高的时空产率，为进一步实现工业化应用奠定了基础。
根据本发明的第二方面，提供一种如上所述的产5-酮果糖的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：1)以保藏号为cgmcc1.15609日本葡萄糖酸杆菌(gluconobacterjaponicus)的基因组dna为模板，pcr扩增获得如seqidno.1所示的果糖脱氢酶基因fdh；2)将质粒pbbr1mcs5以saci、xbai酶切，然后与同样经过saci、xbai酶切的tufb启动子连接，得到重组表达质粒pbbr1mcs5-ptufb；3)将所述扩增获得的果糖脱氢酶基因fdh以bamhi、ecori酶切，然后与同样经bamhi、ecori酶切的pbbr1mcs5-ptufb载体连接，得到重组表达质粒pbbr1mcs5-ptufb-fdh；4)将所述重组表达质粒pbbr1mcs5-ptufb-fdh三亲本转化至保藏号为dsm2003的氧化葡萄糖酸杆菌中，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌株。
根据本发明的第三方面，提供一种采用上面所述的产5-酮果糖的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌生产5-酮果糖的方法，所述方法包括：微生物发酵法和微生物细胞转化法。
采用微生物发酵法时，将所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌按8％～12％的比例转接于发酵罐中，分批次投入底物果糖，最终果糖的总投料量为350～450g/l，温度为28～32℃，ph为5.8～6.2，压缩空气进气量恒定在7～9l/min，溶氧do设定为28～32％，通过所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的发酵催化实现5-酮果糖的制备。
最优选地，425g/l果糖在65h完全消耗，体系中5-酮果糖的产量达到404.3g/l，时空产率为6.2g/l/h，产率为96.2％。
采用微生物细胞转化法时，包括以下步骤：a：以上述氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌株为菌种制备静息细胞；b：制备含有果糖的转化液；c：向所述含有果糖的转化液中加入步骤a中制备的所述静息细胞进行转化，所述静息细胞的加入量为20～40g/l，反应中再补加一定量的果糖，使所述果糖的总投料量为550～600g/l，即得5-酮果糖。
步骤a中，所述静息细胞的制备是将所述菌种通过发酵培养至对数末期，冷冻离心，pbs缓冲液洗涤两次，收集菌体，从而获得去除营养成分的静息细胞。
优选地，步骤c中，所述转化的温度为28～32℃，时间为58～62h。
优选地，所述果糖的总投料量为560～580g/l，所述静息细胞的加入量为28～32g/l。
最优选地，在570g/l总果糖浓度分批补料催化实验中，570g/l果糖在56h左右完全消耗，产物5-酮果糖浓度可达563g/l，时空产率为9.7g/l/h，产率为99％以上。
经过对比，根据本发明提供的两种5-酮果糖的制备方法，微生物细胞转化法相对于微生物发酵法具有更高的底物投料率(570g/l)，更高的时空产率(9.7g/l/h)以及更高的产率(99％以上)，因此本发明解决了现有技术中5-酮果糖生产效率不足的问题，更适用于5-酮果糖的工业化生产。
应当理解的是，本发明中的静息细胞是指将在生长培养基上培养至一定时间后、用适当的方法收集并用缓冲液进行洗涤的微生物细胞，是去除营养成分，终止生长的微生物细胞。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：通过将seqidno.1所示核苷酸序列的果糖脱氢酶基因fdh导入氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacteroxydansdsm2003)，获得一种能高产5-酮果糖的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌。此外，根据本发明提供的一种利用氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌产5-酮果糖的方法，操作简便，反应稳定可靠，能够利用于大规模的工业化生产，具有很好的应用价值和商业开发意义；所得的5-酮果糖能够安全地用于新型功能性甜味剂，前景良好。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明中所采用的微生物菌株为一株氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌，该基因工程菌是指异源表达了果糖脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌。
实施例1氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建
氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建包括以下步骤：
1)基因fdh的克隆：将日本葡萄糖酸杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌培养18～22h，离心收集对数中后期的菌体，使用tiangen公司的细菌基因组提取试剂盒，按照说明书上针对革兰氏阴性菌的步骤进行操作，提取日本葡萄糖酸杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌基因组dna。并以其为模板，pcr扩增fdh基因和tufb启动子。反应体系：primestardnapolymerase10μl，dna模板1μl，引物(10μmol/l)各0.75μl，加ddh2o至总体积20μl。引物设计：根据果糖脱氢酶，即seqidno.1所述的基因序列，设计扩增果糖脱氢酶基因(fdh)的pcr引物fdh-f和fdh-r。根据文献报道的氧化葡萄糖酸杆菌的ptufb启动子的核苷酸序列，分别设计引物ptufb-f和ptufb-r(引物由上海派森诺生物科技股份有限公司合成)。引物序列如下：
fdh-f：5′-cgggatcctcaggagaaggccaatggaaaaaat-3′
fdh-r：5′-ggaattcaaagacttacccctgtttcagg-3′
ptufb-f：5′-actgagctccgatggtaagaaatccactgc-3′
ptufb-r：5′-atatctagaccaaaaccccgctccacc-3′
2)表达载体的构建：将质粒pbbr1mcs5以saci、xbai酶切，然后与同样经过saci、xbai酶切的tufb启动子连接，得到重组表达质粒，命名为pbbr1mcs5-ptufb。将回收的fdh基因片段以bamhi、ecori酶切，然后与同样经bamhi、ecori酶切pbbr1mcs5-ptufb载体连接，得到重组表达质粒，命名为pbbr1mcs5-ptufb-fdh。得到的重组表达质粒pbbr1mcs5-ptufb-fdh经酶切鉴定，符合预期结果。最后对鉴定为正确的重组表达质粒pbbr1mcs5-ptufb-fdh进行测序，测序结果显示，克隆入表达载体的果糖脱氢酶基因fdh的序列与seqidno.1所示序列一致。
3)基因工程菌的构建：将获得的重组质粒pbbr1mcs5-ptufb-fdh三亲本转化方法转化至氧化葡萄糖酸杆菌，获得基因工程菌，通过测序验证该重组质粒构建正确。
实施例2微生物发酵法制备5-酮果糖
在本实施例中，采用微生物发酵法将实施例1制备得到的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌用于5-酮果糖的制备。
培养基配方(g/l)：果糖20、酵母粉20、kh2po41、无水硫酸镁0.3、谷氨酰胺0.1，蒸馏水1000ml。培养基于115℃灭菌30min后备用。
具体方法如下：
从固体培养基平板上挑取氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的单菌落接种于含有25μl/ml的硫酸庆大霉素的液体培养基试管中，培养一段时间后再转接至摇瓶中，在30℃，200rpm的摇床上培养至对数生长期(20-24h)作为种子液，然后按10％的比例转接于发酵罐中，直至发酵结束，获得发酵的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌。
实施例3微生物细胞转化法制备5-酮果糖
在本实施例中，采用微生物细胞转化法将实施例1制备得到的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌用于5-酮果糖的制备。
培养基配方(g/l)：果糖20、酵母粉20、kh2po41、无水硫酸镁0.3、谷氨酰胺0.1，蒸馏水1000ml。培养基于115℃灭菌30min后备用。
具体方法如下：
1)从固体培养基平板上挑取氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的单菌落接种于含有25μl/ml的硫酸庆大霉素的液体培养基试管中，培养一段时间后再转接至摇瓶中，在30℃，200rpm的摇床上培养至对数生长期(20-24h)作为种子液，然后按10％的比例转接于含有同样培养基的发酵罐中培养，ph5.0-6.0，30℃，300～600rpm，培养至对数末期。
2)将发酵罐培养的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，通过冷冻离心机，4℃，8000rpm离心10min收集起来。用20mm的ph6.0的pbs缓冲液洗涤两次，再次收集菌体，获得后续催化反应用的静息细胞。
实施例4：
在3l发酵罐中，按10％的比例接入实施例2制备的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的种子培养液，采用分三次补料的方式，在反应的初始阶段投入100g/l的果糖，待体系中的果糖快要耗尽时(约28h)再向体系中投入175g/l果糖，以及在第一次补料后体系中的底物果糖又快要耗尽时(约42h)第二次再向体系中投入150g/l果糖，最终果糖的总投料量为425g/l。其它反应条件为：温度控制在30℃，ph稳定在在6.0左右，压缩空气进气量恒定在8l/min，溶氧do设定为30％。
最终425g/l果糖在65h内完全消耗，体系中产物5-酮果糖的产量达到404.3g/l，时空产率为6.2g/l/h，产率为96.2％。
实施例5：
在3l发酵罐中，初始转入含有300g/l的果糖的水溶液，加入实施例3制备的静息细胞30g/l，在30℃、空气通气量8l/min，搅拌转速600rpm的条件下反应，在20h这个时间点进行补料再向体系中投入270g/l果糖，最终果糖的总投量为570g/l。
最终在570g/l总果糖浓度补料分批催化实验中，570g/l果糖在56h左右完全消耗，体系中产物5-酮果糖的产量达到563g/l，时空产率为9.7g/l/h，产率为99％以上。
以上实施例中，果糖和5-酮果糖的测定采用高效液相色谱(hplc)分析方法，hplc的操作条件如下：
色谱工作站：安捷伦1260；
色谱柱：有机酸色谱柱87h3；
流动相：0.01n硫酸；
流速：0.6ml/min；
检测温度：55℃。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
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<120>一种产5-酮果糖的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法以及应用
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<213>日本葡萄糖酸杆菌（gluconobacterjaponicus）
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