一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式RT-PCR检测的引物组和试剂盒的制作方法

本发明属于病毒分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种用于德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组和试剂盒。

背景技术：

猪德尔塔冠状病毒(pdcov)是一种会造成猪尤其是哺乳仔猪出现腹泻为主要症状的病毒，具有很高的致病力。pdcov为冠状病毒科、δ冠状病毒属，是有囊膜、不分节段的单股正链rna病毒，其病毒粒子与其他冠状病毒相似，呈多形性。pdcov是目前已知冠状病毒家族中最小的，基因组全长约为25.4kb。pdcov可以感染不同生长阶段的猪群，其中以哺乳仔猪感染率最高。因此，建立快速、特异性强确、高灵敏度的检测方法对预防和控制该病毒的发生具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组和试剂盒。采用本发明提供的用于德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组具有特异性强、灵敏度高、检测速度快的优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组，所述引物组包括外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物；所述外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物的核苷酸序列分别如seqidno:1～seqidno:4所示。

本发明提供了一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的试剂盒，包括上述技术方案中所述的引物组。

优选的，所述试剂盒还包括2×one-stepreactionmix和one-stepenzymemix；或者包括anchoredoligo(dt)18、2×tsreactionmix、rt/rienzymemix和2×easytaqpcrsupermix。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

优选的，所述阳性对照品包括猪德尔塔冠状病毒目的片段的阳性质粒；所述阴性对照品包括depc水。

本发明提供了上述技术方案中所述的引物组或上述技术方案中所述的试剂盒在非诊断目的猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组，所述引物组包括外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物；所述外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物的核苷酸序列分别如seqidno:1～seqidno:4所示。本发明提供的用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组通过使用外侧、内侧2对特异性引物进行，大大提高了rt-pcr扩增的特异性，有效避免了非目的片段的扩增；同时，经过2轮扩增反应，灵敏度得到显著提高，大大提高了阳性样本的检出率；另外，本发明提供的引物组检测用时短，非常适于企业生产研发和农业生产的快速检测。因此，本发明提供的用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组具有特异性强、灵敏度高、检测速度快的优势。

附图说明

图1为实施例2猪德尔塔病毒检测结果；

图2为实施例2中猪德尔塔病毒特异性测定结果；

图3为实施例3的第一轮扩增的灵敏度测定结果；

图4为实施例3进行第二扩增的灵敏度测定结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组，所述引物组包括外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物；所述外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物的核苷酸序列分别如seqidno:1～seqidno:4所示。在本发明中，所述外侧上游引物(pdcov-s3w-f)的核苷酸序列如seqidno:1所示，具体核苷酸序列如下：5’-cgtgtgaaaccccttctcaact-3’。在本发明中，所述外侧下游引物(pdcov-s3w-r)的核苷酸序列如seqidno:2所示，具体核苷酸序列如下：5’-actgctcggataaatgattctgcaag-3’。在本发明中，所述内侧上游引物(pdcov-s3n-f)的核苷酸序列如seqidno:3所示，具体核苷酸序列如下：5’-atggacccatcagcgtgtgt-3’。在本发明中，所述内侧下游引物(pdcov-s3n-r)的核苷酸序列如seqidno:4所示，具体核苷酸序列如下：5’-gccaactgcaaggactgtgt-3’。本发明提供的引物组根据猪德尔塔冠状病毒s基因设计，以提取的rna反转录后的cdna为模板进行第一轮pcr扩增反应，再以第一轮pcr扩增产物为模板进行第二轮pcr扩增反应，扩增产物通过琼脂凝胶电泳检测，如果出现大小为337bp的特异性目的片段，则判定检测的病毒为猪德尔塔冠状病毒。本发明所述猪德尔塔冠状病毒的s基因由ncbi获得，登录号为kp757892.1。在本发明中，所述特异性目的片段的核苷酸序列如seqidno:5所示，具体核苷酸序列如下：

atggacccatcagcgtgtgtagtgatggtgcaattgtgggaacatccacattacagaatactcgaccatccatagtttcactatacgatggcgaagttgaaataccatctgcattttctctttctgttcagacggagtacttgcaagttcaagcagagcaagttatagttgattgtcctcagtatgtatgcaatggcaatagccgttgtctacaattactggcacaatacacctcagcttgctctaacattgaagcagctctgcattcctctgcacagttggatagcagagagattataaatatgtttcaaacatcaacacagtccttgcagttggc。

本发明对引物组中各引物的合成没有特殊要求，采用本领域常规合成方法合成即可。

本发明提供的用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组具有特异性强、灵敏度高、检测用时短的优点，能够满足企业生产研发及农业生产的需要，同时为猪德尔塔冠状病毒的监测和防控提供新思路。

本发明提供了一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的试剂盒，包括上述技术方案中所述的引物组。本发明所述引物组根据猪德尔塔冠状病毒s基因设计，具有特异性强、灵敏度高、检测用时短的优点。本发明所述的试剂盒还优选包括2×one-stepreactionmix和one-stepenzymemix；或者优选包括anchoredoligo(dt)18、2×tsreactionmix、rt/rienzymemix和2×easytaqpcrsupermix。本发明所述rt-pcr优选采用一步法或两步法。在本发明中，所述一步法的rt-pcr的反应体系优选每20μl反应体系包括如下组分：rna样品模板2μl，外侧上游引物0.3μl，外侧下游引物0.3μl，2×one-stepreactionmix10μl，one-stepenzymemix0.4μl以及无核酸酶水7μl。本发明所述2×one-stepreactionmix、one-stepenzymemix和无核酸酶水没有特殊要求，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中2×one-stepreactionmix、one-stepenzymemix和无核酸酶水购自北京全式金生物科技有限公司。本发明一步法的rt-pcr的扩增程序优选包括：42℃、30min；94℃、5min；循环94℃、30s，58℃、30s，72℃、60s，共35个循环；再72℃延伸10min。在本发明中，所述两步法优选包括反转录步骤和pcr扩增步骤。在本发明中，所述反转录的反应体系优选每20μl反应体系包括如下组分：rna模板2μl，anchoredoligo(dt)181μl，2×tsreactionmix10μl，rt/rienzymemix1μl和无核酸酶水6μl。本发明对anchoredoligo(dt)18、2×tsreactionmix、rt/rienzymemix和无核酸酶水没有特殊要求，采用本领域常规市售产品即可。在本发明实施例中，所述anchoredoligo(dt)18、2×tsreactionmix、rt/rienzymemix、无核酸酶购自北京全式金生物科技有限公司。在本发明中，所述anchoredoligo(dt)18还可以替换为randomprimer(n9)或基因特异引物(gsp)。在本发明中，所述逆转录的反应程序优选包括：42℃，30min；85℃，5min；4℃，反应结束。逆转录后，得到cdna。本发明优选将得到的cdna为模板，进行第一轮pcr扩增反应。在本发明中，所述pcr扩增体系优选每20μl反应体系包括如下组分：cdna模板2μl，2×easytaqpcrsupermix10μl，外侧上游引物0.5μl，外侧下游引物0.5μl和无核酸酶水7μl。本发明对2×easytaqpcrsupermix没有特殊要求，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中2×easytaqpcrsupermix购自北京全式金生物科技有限公司。在本发明中，所述pcr的扩增程序优选包括：94℃，5min；循环94℃，30s；58℃，30s；72℃，60s；共35个循环；72℃，5min。

采用一步法或者二步法得到第一轮pcr产物后，本发明优选以第一轮pcr产物为模板进行第二轮pcr扩增。在本发明中，所述第二轮pcr扩增的体系优选每20μl反应体系包括如下组分：第一轮pcr扩增产物模板2μl，2×easytaqpcrsupermix10μl，内侧上游引物0.5μl，内侧下游引物0.5μl和无核酸酶水7μl。本发明对2×easytaqpcrsupermix没有特殊要求，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中2×easytaqpcrsupermix购自北京全式金生物科技有限公司。在本发明中，所述pcr的扩增程序优选包括：94℃，5min；循环94℃，30s；58℃，30s；72℃，60s；共35个循环；72℃，5min。

本发明所述试剂盒还优选包括阳性对照品和阴性对照品。在本发明中，所述阳性对照品优选包括猪德尔塔冠状病毒目的片段的阳性质粒；所述阴性对照品包括depc水。本发明对猪德尔塔冠状病毒目的片段的阳性质粒的构建方法没有特殊要求，采用本领域常规构建方法即可。本发明所述阳性对照品和阴性对照品是用来排除假阴性和假阳性，说明试剂盒可以正常使用。

本发明所提供的试剂盒有益效果在于：1))特异性强：由于使用外侧、内侧2对特异性引物，大大提高了rt-pcr扩增的特异性，有效避免了非目的片段的扩增；本发明能够从感染猪塞内卡病毒的样品上扩增到大小为337bp的特异性目的片段，而从其他病毒样品上未扩增到相应的目的片段，说明特异性良好。2)灵敏度高：与普通rt-pcr相比，本发明经过2轮pcr反应，检测灵敏度得到了显著提高。本发明使整个rt-pcr检测灵敏度提高了10⁴倍，这对于猪德尔塔冠状病毒含量低的样品检测具有极其重要的意义。3)检测用时短：本发明检测时间快，能够克服电镜观察和血清学检测方法存在的不足，实现对猪德尔塔冠状病毒的快速、准确和高效检测。由此来看，本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测用时短的优点，能够满足企业生产研发及农业生产的需要，同时为猪塞内卡病毒病的监测和防控提供新思路。

本发明提供了上述技术方案中所述的引物组或上述技术方案中所述的试剂盒在非诊断目的猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测中的应用。本发明优选提取待测样品总rna，以待测样品总rna为模板，进行反转录反应，得到待测样品cdna。本发明对所述待测样品总rna的提取方法没有特殊限制，采用本领域常规提取方法即可。得到cdna后，本发明优选以待测样品cdna为模板，利用上述技术方案中所述的外侧上游引物和外侧下游引物进行第一轮pcr扩增反应，得到第一轮pcr产物。得到第一轮pcr产物后，本发明优选以第一轮pcr产物为模板，利用上述技术方案中的内侧上游引物和上述技术方案中的内侧下游引物进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr产物。得到第二轮pcr产物后，本发明优选用琼脂糖凝胶电泳对第二轮pcr扩增产物进行检测，在337bp处出现扩增条带表示待测样品中含有猪赛内卡病毒；在337bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含有猪赛内卡病毒。本发明提供的引物组和试剂盒用于非诊断目的的猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测中具有灵敏度高、特异性强。耗时短的特点。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供一种用于德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组和试剂盒进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组，由外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物组成；

外侧上游引物pdcov-s3w-f的核苷酸序列如seqidno:1所示，具体核苷酸序列如下：5’-cgtgtgaaaccccttctcaact-3’。

外侧下游引物pdcov-s3w-r的核苷酸序列如seqidno:2所示，具体核苷酸序列如下：5’-actgctcggataaatgattctgcaag-3’。

内侧上游引物pdcov-s3n-f的核苷酸序列如seqidno:3所示，具体核苷酸序列如下：5’-atggacccatcagcgtgtgt-3’。

内侧下游引物pdcov-s3n-r的核苷酸序列如seqidno:4所示，具体核苷酸序列如下：5’-gccaactgcaaggactgtgt-3’。

上述引物由上海生工生物工程有限公司合成得到。

对比例1

一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组，由外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物组成；

外侧上游引物的核苷酸序列如seqidno:6所示，具体核苷酸序列如下：5’-tgctacctctccgattccca-3’。

外侧下游引物的核苷酸序列如seqidno:7所示，具体核苷酸序列如下：5’-atcctgtttgtctgctggca-3’。

内侧上游引物的核苷酸序列如seqidno:8所示，具体核苷酸序列如下：5’-gacactgagaagacgggtatgg-3’。

内侧下游引物的核苷酸序列如seqidno:9所示，具体核苷酸序列如下：5’-tagttggtttggtaggtggctc-3’。

对比例2

一种用于猪德尔塔冠状病毒rt-pcr检测的引物对，由上游引物和下游引物组成；

上游引物的核苷酸序列如seqidno:10所示，具体核苷酸序列如下：5’-ggacaacccggctacgg-3’。

下游引物的核苷酸序列如seqidno:11所示，具体核苷酸序列如下：5’-taggtttgcaagggcaaagtgg-3’。

实施例2

猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组的特异性测定

采用人工合成序列的方式得到实施例1的引物组，上述引物由上海生工生物工程有限公司合成得到。采用该引物组对猪德尔塔冠状病毒的阴性样品和阳性样品进行巢式rt-pcr扩增。

rt-pcr扩增体系如下：rna样品模板2μl，外侧上游引物0.3μl，外侧下游引物0.3μl，2×one-stepreactionmix10μl，one-stepenzymemix0.4μl以及无核酸酶水7μl，总体积为20μl。2×one-stepreactionmix、one-stepenzymemix和无核酸酶水购自北京全式金生物科技有限公司。

rt-pcr扩增程序：42℃、30min；94℃、5min；循环94℃、30s，58℃、30s，72℃、60s，共35个循环；再72℃延伸10min。

第二轮pcr扩增体系如下：第一轮pcr扩增产物模板2μl，2×easytaqpcrsupermix10μl，内侧上游引物0.5μl，内侧下游引物0.5μl和无核酸酶水7μl。

第二轮pcr扩增程序：94℃，5min；循环94℃，30s；58℃，30s；72℃，60s；共35个循环；72℃，5min。

检测的样品：对阴性对照样品、阳性对照样品和携带有猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪德尔塔冠状病毒的样品，考察本发明的猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组的特异性。其中，猪细小病毒的毒株购自福建农业科学院，猪圆环病毒2型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的毒株购自兆丰华生物科技有限公司，猪德尔塔冠状病毒购自派生特生物科技有限公司。

得到扩增产物后，进行凝胶电泳检测，检测结果见图1和图2。

图1为本发明实施例2猪德尔塔病毒检测结果；从左向右依次为：marker，阳性对照样品、携带有猪德尔塔冠状病毒的样品、阴性对照样品和空白对照。

图2为本发明实施例2中猪德尔塔病毒特异性测定结果；从左向右依次为：marker，阳性对照样品、携带有猪德尔塔冠状病毒样品、猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、阴性对照样品和空白对照。

由图1的结果可知，空白对照和阴性对照样品无扩增，阳性对照样品和携带有猪德尔塔冠状病毒样品扩增出了一个337bp的核酸片段，说明扩增正常，可以用于猪德尔塔冠状病毒的检测。

由图2的结果可知，猪德尔塔冠状病毒有对应扩增，猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒无扩增，说明该引物特异性强，可以应用于区分猪德尔塔冠状病毒与其他病毒的pcr的扩增和检测。

实施例3

猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组的灵敏度测定

将提取的德尔塔冠状病毒的rna反转录为cdna，然后再用ddh2o做梯度稀释，每个稀释度的模板进行pcr反应，考察本发明的引物组的灵敏度。

反转录反应体系如下：

rna模板2μl；anchoredoligo(dt)181μl；2×tsreactionmix10μl；rt/rienzymemix1μl；无核酸酶水6μl；总体积20μl。anchoredoligo(dt)18、2×tsreactionmix、rt/rienzymemix、无核酸酶水购自北京全式金生物科技有限公司。

将配置好的体系瞬时离心混匀，于pcr仪上进行反转录，反转录的条件为：

①42℃，30min；②85℃，5min；③4℃，反应结束。

pcr体系：

稀释好的cdna模板2μl；2×easytaqpcrsupermix10μl；上、下游外侧引物各0.5μl；无核酸酶水7μl；总体积20μl。2×easytaqpcrsupermix购自北京全式金生物科技有限公司。

将配置好的体系瞬时离心混匀，于pcr仪上进行扩增，pcr扩增条件为：

①94℃，5min；②94℃，30s；③58℃，30s；④72℃，60s；②～④35个循环；⑤72℃，5min；反应结束。

将pcr产物分别取5μl进行凝胶电泳，结果如图3。图3为实施例3的第一轮扩增的灵敏度测定结果；从左向右依次为：marker，cdna原液，10倍稀释，10²倍稀释，10⁴倍稀释，10⁵倍稀释，阴性对照。由图3的结果可知，本发明的引物最低检测限为：10⁴倍稀释。取cdna原液的pcr产物进行梯度稀释，进行第二轮pcr反应。

第二轮pcr体系：

稀释好的第一轮pcr产物模板2μl；2×easytaqpcrsupermix10μl；上、下游引内侧物各0.5μl；无核酸酶水7μl；总体积20μl。2×easytaqpcrsupermix购自北京全式金生物科技有限公司。

将配置好的体系瞬时离心混匀，于pcr仪上进行扩增，pcr扩增条件为：

①94℃，5min；②94℃，30s；③58℃，30s；④72℃，60s；②～④35个循环；⑤72℃，5min；反应结束。

将第二轮pcr产物分别取5μl进行凝胶电泳，结果如图4。图4为实施例3进行第二扩增的灵敏度测定结果；从左向右依次为；marker，cdna原液，10²倍稀释，10⁴倍稀释，10⁶倍稀释，10⁸倍稀释，10¹⁰倍稀释，阴性对照。由图4的结果可知，本发明的引物最低检测限为：10^-8倍稀释。

从图3和图4结果可见，第二轮pcr反应的检测灵敏度比第一轮提高了10⁴倍，即巢式rt-pcr使检测灵敏度提高了10⁴倍，表明本发明引物具有很高的灵敏度。

实施例4

猪德尔塔冠状病毒的临床样本评价

以80份来自不同猪场的粪便样本为材料，使用本发明的引物组进行巢式rt-pcr检测，与对比例1的根据衣壳蛋白n基因进行设计的巢式rt-pcr引物组、对比例2采用普通rt-pcr方法进行检测做对比，并将检测阳性的产物做测序比对，以确保准确性。结果表明，采用本发明从80份样品中检测出德尔塔冠状病毒36份(45％的阳性率)，比现有巢氏检测方法高检出率高5％，比普通pcr检测方法检出率高15％(表1)。

表1临床血液样本的检测结果

上述实施例的结果表明，本发明提供的用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组具有特异性强、灵敏度高、检测速度快的优势。本发明针对猪德尔塔冠状病毒s基因设计的巢式rt-pcr检测试剂盒，弥补了国内外在该病毒检测的空白。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110>派生特（福州）生物科技有限公司

<120>一种用于猪德尔塔冠状病毒巢式rt-pcr检测的引物组和试剂盒

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgtgtgaaaccccttctcaact22

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

actgctcggataaatgattctgcaag26

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atggacccatcagcgtgtgt20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gccaactgcaaggactgtgt20

<210>5

<211>337

<212>dna

<213>猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus)

<400>5

atggacccatcagcgtgtgtagtgatggtgcaattgtgggaacatccacattacagaata60

ctcgaccatccatagtttcactatacgatggcgaagttgaaataccatctgcattttctc120

tttctgttcagacggagtacttgcaagttcaagcagagcaagttatagttgattgtcctc180

agtatgtatgcaatggcaatagccgttgtctacaattactggcacaatacacctcagctt240

gctctaacattgaagcagctctgcattcctctgcacagttggatagcagagagattataa300

atatgtttcaaacatcaacacagtccttgcagttggc337

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tgctacctctccgattccca20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

atcctgtttgtctgctggca20

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gacactgagaagacgggtatgg22

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tagttggtttggtaggtggctc22

<210>10

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ggacaacccggctacgg17

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

taggtttgcaagggcaaagtgg22