一种荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法与流程

1.本发明属于生物分子诊断领域，涉及一种荧光探针中荧光基团的合成方法，具体涉及一种荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法。


背景技术：

2.荧光探针就是以荧光物质为指示剂，在一定波长激发下使荧光物质产生荧光，通过检测所产生的荧光对被检测物质进行定量或定性分析。在生物医学检测方面，荧光探针相对于其他检测法，具有高灵敏度，高选择性，响应快，重复性好，操作简便，成本低等优点，因而在分子诊断，基因检测，抗体免疫分析等方面得到广泛的应用。
3.荧光探针由识别基团、荧光基团和连接体三部分组成，识别基团决定探针的选择性特异性，荧光基团决定探针的灵敏度，连接体部分在探针中起到连接枢纽的作用。荧光染料在荧光探针中都以荧光基团的身份存在，它的光物理性质是探针性能的重要体现。目前，用于标记或衍生的荧光探针主要有罗丹明类、荧光素类、邻苯二甲醛类等，其中荧光素类化合物在生物研究领域中占有及其重要的位置。但是国内关于荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法尚不成熟。


技术实现要素：

4.本技术主要解决了当前还未有关于荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法的问题。
5.基于上述问题，本技术提出了以下解决方案：
6.一种荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法，包括如下步骤：
7.s1、将脱氧核苷充分溶解到第一有机溶剂中，加入4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷，充分反应后分离出化合物2；
8.s2、将步骤s1中的化合物2充分溶解到第二有机溶剂中，加入第一缩合剂、二胺类三氟乙酰胺衍生物，充分反应后分离出化合物3；
9.s3、将步骤s2中的化合物3充分溶解到甲醇溶液中，加入碱性物质，充分反应后分离出化合物4；
10.s4、将步骤s3中的化合物4充分溶解到第三有机溶剂中，加入荧光染料活化酯，充分反应后分离出化合物5；
11.s5、将步骤s4中的化合物5充分溶解到第四有机溶剂中，依次加入酸酐、有机碱，充分反应后分离出化合物6；
12.s6、将步骤s5中的化合物6充分溶解到第五有机溶剂中，依次加入第二缩合剂、固相载体，充分反应后分离出荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体。
13.作为本技术进一步的改进，步骤s1中，所述第一有机溶剂可以为但不仅仅限于吡啶、dmf、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃中的任意一种。
14.作为本技术进一步的改进，步骤s2中，所述第二有机溶剂可以为但不仅仅限于
dmf、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、乙腈中的任意一种。
15.作为本技术进一步的改进，步骤s2中，所述第一缩合剂可以为但不仅仅限于dcc、edc、hobt、hbtu、hatu、pybop中的任意一种。
16.作为本技术进一步的改进，步骤s2中，所述二胺类三氟乙酰胺衍生物可以为但不仅仅限于乙二胺三氟乙酰胺、丙二胺三氟乙酰胺、丁二胺三氟乙酰胺、戊二胺三氟乙酰胺、己二胺三氟乙酰胺中的任意一种。
17.作为本技术进一步的改进，步骤s3中，所述碱性物质可以为但不仅仅限于氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氨水、甲胺中的至少一种。
18.作为本技术进一步的改进，步骤s4中，所述第三有机溶剂可以为但不仅仅限于dmf、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、乙腈中的任意一种。
19.作为本技术进一步的改进，步骤s4中，所述荧光染料活化酯可以为但不仅仅限于fam活化酯、hex活化酯、tet活化酯、花菁染料活化酯、罗丹明染料活化酯中的任意一种。
20.作为本技术进一步的改进，步骤s4中，所述反应的温度为60℃-90℃。
21.作为本技术进一步的改进，步骤s5中，所述第四有机溶剂可以为但不仅仅限于dmf、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、乙腈中的任意一种。
22.作为本技术进一步的改进，步骤s5中，所述有机碱可以为但不仅仅限于三乙胺、吡啶、二异丙基按、二异丙基乙基胺中的任意一种。
23.作为本技术进一步的改进，步骤s5中，所述酸酐可以为但不仅仅限于丁二酸酐、戊二酸酐、二乙醇酸酐中的任意一种。
24.作为本技术进一步的改进，步骤s6中，所述第五有机溶剂可以为但不仅仅限于dmf、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、乙腈中的任意一种。
25.作为本技术进一步的改进，步骤s6中，所述第二缩合剂可以为但不仅仅限于dcc、edc、hobt、hbtu、hatu、pybop中的任意一种。
26.作为本技术进一步的改进，步骤s6中，所述固相载体可以为但不仅仅限于可控玻璃珠粉cpg、氨甲基聚苯乙烯树脂中的任意一种。
27.作为本技术进一步的改进，所述脱氧核苷酸可以为但不仅仅限于腺嘌呤脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸中的任意一种。
28.作为本技术进一步的改进，所述脱氧核苷可以为但不仅仅限于5-(2-羧基乙烯基)-2'-脱氧尿苷。
29.本技术的有益效果在于，本技术提供了一种荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法，方法简便，收益率高，实现了高效的荧光诊断目的。
附图说明
30.图1为荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的合成反应过程。
具体实施方式
31.为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术具体实施例及附图对本技术技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本技术中的实施例，本领域普
通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
32.本技术提供了一种荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法，包括如下步骤：
33.s1、将脱氧核苷充分溶解到第一有机溶剂中，加入4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷，充分反应后分离出化合物2；优选的，所述反应置于室温下进行，所述分离的步骤为充分反应后依次进行第一步减压、第一步萃取，收集第一有机相后去除溶剂，再对残留物经第一步纯化后得到化合物2；更进一步的，所述第一步萃取中应用的萃取液为水和二氯甲烷的混合溶液，该步骤中去除溶剂的工艺为减压蒸除，第一步纯化的工艺可以为但不仅仅限于层析、柱层析等。
34.s2、将步骤s1中的化合物2充分溶解到第二有机溶剂中，加入第一缩合剂、二胺类三氟乙酰胺衍生物，充分反应后分离出化合物3；优选的，所述反应置于室温下进行，所述分离的步骤为充分反应后依次进行第一步淬灭，第二步萃取，收集第二有机相后去除溶剂，再对残留物经第二步纯化后得到化合物3；更进一步的，应用于第一步淬灭的溶液为水，第二步萃取中应用的萃取液为乙酸乙酯，该步骤中去除溶剂的工艺为减压蒸除，第二步纯化的工艺可以为但不仅仅限于层析、柱层析等。
35.s3、将步骤s2中的化合物3充分溶解到甲醇溶液中，加入碱性物质，充分反应后分离出化合物4；优选的，所述反应置于室温下进行，所述分离的步骤为充分反应后浓缩干燥。
36.s4、将步骤s3中的化合物4充分溶解到第三有机溶剂中，加入荧光染料活化酯，充分反应后分离出化合物5；优选地，所述反应在加热条件下进行，分离的步骤为充分反应后去除溶剂，向残留物中加入二氯甲烷，用水洗涤三遍后收集第三有机相，浓缩，最后经第三步纯化后得到化合物5；更进一步的，该步骤中去除溶剂的工艺为减压蒸除，第三步纯化的工艺可以为但不仅仅限于层析、柱层析等。
37.s5、将步骤s4中的化合物5充分溶解到第四有机溶剂中，依次加入酸酐、有机碱，充分反应后分离出化合物6；优选地，所述反应置于室温下进行，所述分离的步骤为依次经第二步淬灭、第三步萃取，收集第四有机相后去除溶剂，得到化合物6；更进一步地，用于第二步淬灭的液体为水，去除溶剂的工艺为减压蒸除。
38.s6、将步骤s5中的化合物6充分溶解到第五有机溶剂中，依次加入第二缩合剂、固相载体，充分反应后分离出荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体；优选的，所述反应置于室温下进行，反应的时间为10h，分离的步骤为过滤，收集固体。
39.上述步骤中淬灭反应的目的：在有机化学反应中，某一反应底物是过量的，当化学反应进行到一定程度，目标产物已经获得，该过量反应底物继续存在会进一步反应生成副产物或者影响后处理操作，所以需要将其淬灭。淬灭是用另一种更易与该过量物质反应的化合物与之反应，通过降低反应速率或者破坏反应体系，将其从体系中除去从而终止反应进行，以达到降低副产物的生成，保证实验后处理安全便捷的目的。
40.本技术中，由于5-(2-羧基乙烯基)-2'-脱氧尿苷是脱氧核苷的一种，因此，以5-(2-羧基乙烯基)-2'-脱氧尿苷为例进行了说明，具体实施例如下：
41.一种荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法，合成反应的整体过程如图1所示，包括如下步骤：
42.s1、将40g化合物1置于干燥的烧瓶中，所述化合物1为：5-(2-羧基乙烯基)-2'-脱氧尿苷，再向烧瓶中加入300ml吡啶溶解，然后加入45克4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷，室温反应至完全，减压蒸除吡啶，然后用水和300ml二氯甲烷萃取，收集有机相，减压蒸除溶剂后残留物柱层析纯化得化合物2，化合物2为52克纯品白色固体，化合物1通过反应a得到化合物2，反应a为
[0043][0044]
对化合物2进行的核磁检测hnmr为：1h nmr(dmso)
δ
2.16-2.25(m,1h),2.30-2.36(m,1h),3.16(dd,1h),3.24(dd,1h),3.72(dd,6h),3.88-3.92(m,1h),4.21-4.26(m,1h),5.29(d,1h),6.17(dd,1h),6.78-6.87(m,5h),7.17-7.38(m,10h),8.03(s,1h),11.67(s,1h),12.1(w,1h)。
[0045]
s2、将步骤s1中的52克化合物2置于一个干燥的烧瓶中，加入300mldmf溶解，依次加入缩合剂27克dcc、18克hobt、24ml三乙胺和22克1，6-己二胺三氟乙酰胺，室温反应至完全，加800毫升水淬灭，800毫升乙酸乙酯萃取分层，收集有机相，减压蒸除溶剂后残留物用柱层析纯化，得50克白色固体为化合物3，化合物2通过反应b得到化合物3，反应b为
[0046][0047]
对化合物3进行的核磁检测hnmr为：1h nmr(dmso)δ1.23-.128(m,4h),1.38-1.48(m,4h),2.14-2.20(m,1h),2.30-2.36(m,1h),2.99-3.03(m,1h),3.10-3.19(m,5h),3.72(dd,6h),3.88-3.92(m,1h),4.21-4.26(m,1h),5.29(d,1h),6.17(t,1h),6.85-6.91(m,4h),7.05-7-4(m,11h),7.94(s,1h),8.01(t,1h),9.39(t,1h),11.60(s,1h)。
[0048]
s3、将步骤s2中的50克化合物3置于一个干燥烧瓶中，加入100毫升甲醇溶解，然后加入100毫升浓氨水，室温反应至完全，然后浓缩至干得化合物4，产品直接用于下步反应，化合物3通过反应c得到化合物4，反应c为
[0049][0050]
s4、将步骤s3中的44克化合物4置于一个烧瓶中，加入400毫升dmf溶解，然后加入40克fam-nhs，反应加热到80℃过夜，反应完成后减压蒸除溶剂dmf，残留物加500毫升二氯甲烷溶解，用水洗涤3遍，收集有机相浓缩，剩余物柱层析柱纯化，得40克化合物5，化合物4通过反应d得到化合物5，反应d为
[0051][0052]
对化合物5进行的核磁检测hnmr为：1h nmr(dmso)
δ
1.23-.128(m,4h),1.32(s,18h),1.38-1.48(m,4h),2.14-2.20(m,1h),2.30-2.36(m,1h),2.99-3.03(m,1h),3.10-3.19(m,5h),3.72(dd,6h),3.88-3.92(m,1h),4.21-4.26(m,1h),5.29(d,1h),6.17(t,1h),6.8(dd,4h),6.85-6.91(m,4h),7.05-7.4(m,14h),7.94(s,1h),8.01(t,1h),8.40(d,1h),8.73(s,1h),9.39(t,1h),11.60(s,1h)。
[0053]
s5、将40克步骤s4中的化合物5置于一个干燥的烧瓶中，加入400毫升二氯甲烷溶解，依次加入4.9克丁二酸酐、9毫升三乙胺，室温反应至完全，加200毫升水淬灭，萃取分层，收集有机相，减压蒸除溶剂得化合物6，产品直接用于下步反应，化合物5通过反应e得到化合物6，反应e为
[0054][0055]
s6、将10克步骤s5中的化合物6置于一个干燥的烧瓶中，加入二氯甲烷溶解，然后依次加入8克dcc，5克hobt，10毫升三乙胺，可控玻璃珠粉cpg，室温搅拌反应10小时，过滤，收集固体得到化合物7，即fam-dt-cpg，化合物6通过反应f得到化合物6，反应f为：
[0056][0057]
综上所述，本技术提供了一种荧光染料修饰的脱氧核苷固相载体的制备方法，方法简便，收益率高，实现了高效的荧光诊断目的。且fam是一种常见的荧光素类染料，它的激发波长498nm，发射波长525nm，常用于荧光探针中。fam也可以修饰在脱氧核苷dt上，形成fam-dt亚磷酰胺单体，在dna探针的合成中标记到探针的任何一个位点，也可以负载于固相载体形成fam-dt-固相载体，如：fam-dt-cpg(ps)，用于dna探针的3’端修饰。本发明尤其对fam-dt-cpg(ps)的固相载体的合成方法进行了详细的介绍。
[0058]
虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
[0059]
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。