cd94和nkg2a基因人源化的非人动物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及人源化改造的转基因非人动物，尤其是人源化改造的转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠，更具体的，涉及包含人nkg2a基因和cd94的基因改造小鼠，其制备方法和用途。
背景技术：2.nkg2a(natural killer group 2a)是一种细胞表面分子，通常表达在nk细胞表面，也可以通过诱导在t细胞表达(特别是cd8+t细胞)。nkg2a属于凝集素家族，在人和小鼠体内，nkg2a与cd94通过二硫键形成异二聚体，可以与人体的白细胞抗原(hla
‑
e蛋白，属于非经典mhc i类基因)结合(小鼠中相应的蛋白为qa
‑
1b)，进而产生免疫抑制信号，抑制nk细胞和cd8+t细胞的功能，是一种抑制性受体，目前也认为是一种新型的免疫检查点。
3.hla
‑
e在多种肿瘤组织、自身免疫性疾病及其进展过程中异常表达，已有研究表明使用靶向nkg2a的抗体可以增强t细胞和nk细胞活性，从而进行抗肿瘤治疗，阻断nkg2a/hla
‑
e还可能在病毒感染(hiv)、自身免疫性疾病(如ra)、异体造血干细胞移植等方面发挥作用。
4.目前已有法国生物技术公司innate pharma sa(innate制药)开发nkg2a抗体monalizumab，该抗体是迄今为止开发的唯一能够同时作用于t细胞和nk细胞的检查点抑制剂，目前已进入ii期临床。在2018年10月20日欧洲肿瘤医学协会会议(esmo)上innate公司公布了ii期临床数据，monalizumab联用西妥昔单抗治疗头颈部复发或转移性鳞状细胞癌(scchn)试验疗效显著，可使许多患者能够获得长期的病情稳定期。
5.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发病机制、开发防治技术及药物是不可缺少的研究工具。由于人nkg2a和cd94序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人nkg2a和小鼠nkg2a蛋白序列的一致性仅为42％，人鼠cd94蛋白一致性仅55％，识别人nkg2a蛋白的抗体通常无法识别小鼠nkg2a，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向nkg2a及其配体cd94药物的药效。鉴于nkg2a相关药物全球研发进展及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期试验更有效并使研发失败率最小化，本领域急需开发人源化nkg2a和cd94相关的非人动物模型。
技术实现要素：6.项1、一种人源化cd94蛋白，所述的人源化cd94蛋白包含人cd94蛋白的全部或部分，优选的，所述的人cd94蛋白的部分包含人cd94蛋白的胞外区的全部或部分。
7.项2、根据项1所述的人源化cd94蛋白，所述的人源化cd94蛋白包含人cd94基因的2号至7号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，优选的，包含4号至7号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。
8.项3、根据项1所述的人源化cd94蛋白，所述的人源化cd94蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
9.a)为seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位氨基酸序列的全部或部分；
10.b)与seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
11.c)与seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
12.d)与seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
13.项4、根据项1或2所述的人源化cd94蛋白，所述的人源化cd94蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
14.i)为seq id no：8氨基酸序列的全部或部分；
15.ii)与seq id no：8氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
16.iii)与seq id no：8所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
17.iv)与seq id no：8所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
18.项5、一种人源化cd94基因，所述的人源化cd94基因包含人cd94基因的部分，优选的，人cd94基因的部分包含编码人cd94蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含编码与seq id no：2的第37
‑
179位、第34
‑
179位或或者第33
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含编码所述seq id no：2的第37
‑
179位、第34
‑
179位或或者第33
‑
179位氨基酸序列的核苷酸序列；更优选的，所述的人源化cd94基因编码项1
‑
4任一所述的人源化cd94蛋白。
19.项6、根据项5所述的人源化cd94基因，所述的人源化cd94基因包含人cd94基因的部分，优选的，包含4号至7号外显子的全部或部分；优选的，所述的人cd94基因的部分为seq id no：5所示的核苷酸序列。
20.项7、根据项5
‑
6任一所述的人源化cd94基因，所述的人源化cd94基因包含下列组中的一种：
21.(a)为seq id no：5或者seq id no：6所示核苷酸序列的全部或部分；
22.(b)与seq id no：5或者seq id no：6所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
23.(c)与seq id no：5或者seq id no：6所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
24.(d)具有seq id no：5或者seq id no：6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
25.项8、根据5
‑
6任一所述的人源化cd94基因，所述的人源化cd94基因转录的mrna选自下列组中的一种：
26.(i)为seq id no：7所示核苷酸序列的全部或部分；
27.(ii)与seq id no：7所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
28.(iii)与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
29.(iv)与seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
30.项9、一种cd94基因打靶载体，所述的cd94基因打靶载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含项5
‑
8任一所述的人cd94基因的部分。
31.项10、根据项9所述cd94基因打靶载体，所述的cd94基因打靶载体还包含5’臂，其选自非人动物cd94基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000072.6的序列至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：3至少具有90％同源性，或者包含seq id no：3所示的核苷酸序列；和/或，所述的cd94基因打靶载体还包含3’臂，其选自非人动物cd94基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000072.6的序列至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：4至少具有90％同源性，或者包含seq id no：4所示的核苷酸序列。
32.项11、一种基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化cd94蛋白，优选的，所述的构建方法包括用包含编码人cd94蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上；进一步优选的，用包含编码人cd94蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上；更一步优选的，用包含编码与seq id no：2的第37
‑
179位、第34
‑
179位或第33
‑
179位所示氨基酸具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者序列一致的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上；更优选的，所述的人源化cd94蛋白为项1
‑
4任一所述的蛋白。
33.项12、根据项11所述的构建方法，所述非人动物的基因座中包含人cd94基因的部分，优选的，所述的人cd94基因的部分为项5
‑
8任一所述的人cd94基因的部分。
34.项13、根据项11
‑
12任一所述的构建方法，使用cd94基因打靶载体进行非人动物的构建，优选地，所述cd94基因打靶载体为项5所述的cd94基因打靶载体。
35.项14、根据项11
‑
13任一所述的构建方法，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠，再进一步优选地，所述小鼠或大鼠还表达人或人源化nkg2a、pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla4、b7h3、b7h4、cd47、il2、il23a和ccr2蛋白中的至少一种。
36.项15、一种人源化nkg2a蛋白，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a蛋白的全部或部分，优选的，所述的人nkg2a蛋白的部分包含人nkg2a蛋白胞外区的全部或部分。
37.项16、根据项15所述的人源化nkg2a蛋白，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a基因的1号至8号外显子编码的氨基酸的全部或部分，优选的，包含人nkg2a基因的4号至8号外显子编码的氨基酸的全部或部分。
38.项17、根据项15
‑
16任一项所述的人源化nkg2a蛋白，所述的人源化nkg2a蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
39.a)为seq id no：29的第94
‑
233位氨基酸序列的全部或部分；
40.b)与seq id no：29的第94
‑
233位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
41.c)与seq id no：29的第94
‑
233位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
42.d)与seq id no：29的第94
‑
233位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
43.项18、根据项15
‑
16任一项所述的人源化nkg2a蛋白，所述的人源化nkg2a蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
44.i)为seq id no：35氨基酸序列的全部或部分；
45.ii)与seq id no：35氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
46.iii)与seq id no：35所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
47.iv)与seq id no：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
48.项19、一种人源化nkg2a基因，所述的人源化nkg2a基因包含人nkg2a基因的部分，优选的，包含编码人nkg2a蛋白胞外区的全部或核苷酸序列；进一步优选的，包含编码与seq id no：29的第94
‑
233位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：29的第94
‑
233位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列；进一步优选的，所述的人源化nkg2a基因编码项15
‑
18任一所述的人源化nkg2a蛋白。
49.项20、根据项19所述的人源化nkg2a基因，所述的人源化nkg2a基因包含人nkg2a基因的部分；人nkg2a基因的部分包含人nkg2a基因的4号至8号外显子的全部或部分；再进一步优选的，包含人nkg2a基因的4号外显子的部分、5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中4号外显子的部分至少包含编码最后一个氨基酸的4号外显子，8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。
50.项21、根据项19
‑
20任一所述的人源化nkg2a基因，所述的人源化nkg2a基因包含下列组中的一种：
51.(a)为seq id no：32所示核苷酸序列的全部或部分；
52.(b)与seq id no：32所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
53.(c)与seq id no：32所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
54.(d)具有seq id no：32所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
55.项22、根据项19
‑
20任一所述的人源化nkg2a基因，所述的人源化nkg2a基因转录的mrna选自下列组中的一种：
56.(i)为seq id no：34所示核苷酸序列的全部或部分；
57.(ii)与seq id no：34所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
58.(iii)与seq id no：34所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超
过1个核苷酸；或
59.(iv)与seq id no：34所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
60.项23、一种nkg2a基因打靶载体，所述的nkg2a基因打靶载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含项13
‑
15任一所述的人nkg2a基因的部分。
61.项24、根据项23所述的nkg2a基因打靶载体，所述的nkg2a基因打靶载体还包含5’臂，其选自非人动物nkg2a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000072.6的序列至少具有90％同源性；进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：30至少具有90％同源性，或者包含seq id no：30所示的核苷酸序列；和/或，所述的nkg2a基因打靶载体还包含3’臂，其选自非人动物nkg2a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000072.6的序列至少具有90％同源性；进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：31至少具有90％同源性，或者包含seq id no：31所示的核苷酸序列。
62.项25、一种基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化nkg2a蛋白。
63.项26、根据项25所述的构建方法，所述的构建方法包括用包含编码人nkg2a蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上；进一步优选的，用包含编码人nkg2a蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上；更进一步优选的，用包含与seq id no：29的第94
‑
233位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：29的第94
‑
233位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上；更优选的，所述的人源化nkg2a蛋白为项15
‑
18任一所述的人源化nkg2a蛋白。
64.项27、根据项25或26所述的构建方法，包括用包含人nkg2a基因的部分核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上；优选的，用包含项12
‑
13任一所述的人nkg2a基因的部分插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。
65.项28、根据项25
‑
27任一所述的构建方法，使用nkg2a基因打靶载体进行非人动物的构建，任选地，所述nkg2a基因打靶载体为项23或24所述的nkg2a基因打靶载体。
66.项29、根据项25
‑
28任一所述的构建方法，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠，再进一步优选地，所述小鼠或大鼠还表达人或人源化cd94、pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla4、b7h3、b7h4、cd47、il2、il23a和ccr2蛋白中的至少一种。
67.项30、一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于项11
‑
14或25
‑
29任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代，或者来源于所述的非人动物或其子代制备的动物模型。
68.项31、一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于项11
‑
14或25
‑
29任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代，或者来源于所述的非人动物或其子代制备的动物模型。
69.项32、一种瘤组织，所述的瘤组织来源于项11
‑
14或25
‑
29任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代制备的荷瘤动物模型。
70.项33、一种表达项1
‑
4任一所述的人源化cd94蛋白和/或项15
‑
18任一所述的人源化nkg2a蛋白的细胞。
71.项34、来源于项1
‑
4任一所述的人源化cd94蛋白、项5
‑
8任一所述的人源化cd94基因、项15
‑
18任一所述的人源化nkg2a蛋白、项19
‑
22任一所述的人源化nkg2a基因、项11
‑
14或25
‑
29任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代、用项11
‑
14或25
‑
29任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代制备的动物模型、项30所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、项31所述的组织或器官或其培养物、项32所述的瘤组织、项33所述的细胞在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究nkg2a通路功能、人nkg2a通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗病毒感染药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
72.项35、一种人cd94和/或nkg2a特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自项11
‑
14或25
‑
29任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代。
73.项36、根据项35所述的筛选方法，所述的调节剂选自car
‑
t、药物；优选的，所述的药物为抗体。
74.本发明的第一方面，提供了一种人源化cd94蛋白，所述的人源化cd94蛋白包含人cd94蛋白的全部或部分。
75.优选的，所述的人源化cd94蛋白包含人cd94蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
76.进一步优选的，所述的人源化cd94蛋白包含人cd94蛋白的胞外区的全部或部分。
77.优选的，所述的人源化cd94蛋白还包含非人动物cd94蛋白的部分，优选为非人动物cd94蛋白的跨膜区和/或胞质区。
78.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd94蛋白包含跨膜区、胞质区和胞外区，其中，胞外区包含人cd94蛋白胞外区的全部或部分。优选的，为保证人源化cd94蛋白包含结合抗人抗体的人cd94蛋白胞外区，又不影响人源化cd94蛋白包含的其他区域的正常功能。故对于胞外区可以适当在n端和/或c端减少几个氨基酸。进一步优选的，胞外区的氨基酸序列包含n端和/或c端去除1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸残基的人cd94蛋白胞外区，进一步优选的，胞外区的氨基酸序列包含n端去除5个氨基酸残基的人cd94蛋白胞外区。
79.再进一步优选的，胞外区包含与seq id no：2的第37
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第37
‑
179位所示氨基酸序列一致。
80.在本发明的一个具体实施方式中，来源于人的cd94还可以包含seq id no：2的第37
‑
179位两端向外延伸的与非人动物相同或性质相似的氨基酸序列残基的序列，所述相同或性质相似的氨基酸序列可以来自胞外区、跨膜区和/或胞质区，优选来自胞外区，例如seq id no：2的第34
‑
179位或seq id no：2的第33
‑
179位。该人源化cd94蛋白依然具有结合人相应抗体的功能。
81.再进一步优选的，胞外区包含与seq id no：2的第34
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第34
‑
179位所示氨基酸序列一致。
82.再进一步优选的，胞外区包含与seq id no：2的第33
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第33
‑
179位所示氨基酸序列一致。
83.再进一步优选的，跨膜区、胞质区来源于非人动物，优选的，所述部分胞外区包含至多1
‑
10个氨基酸来源于非人动物。
84.进一步优选的，部分胞外区包含n端和/或c端至多1
‑
10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
85.在本发明的一个具体实施方式中，部分胞外区包含n端至多1
‑
10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
86.优选的，所述的人源化cd94蛋白包含人cd94基因的2号至7号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含2号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。再进一步优选的，包含4号至7号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含4号外显子的全部或部分、5号至7号外显子的全部优选还包含3号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
21(优选为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21)个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
15个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码16
‑
19个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码20或21个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分包含去除编码前3个氨基酸的4号外显子的核苷酸序列，所述的3号外显子的部分包含3号外显子中编码最后1
‑
5优选1、2、3、4、5更优选为1个氨基酸的核苷酸序列。最为优选的，所述的人源化cd94蛋白包含与seq id no：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者包含seq id no：5编码的氨基酸序列。
87.优选的，所述的人源化cd94蛋白还包含非人动物cd94基因编码的氨基酸序列的全部或部分，优选为非人动物cd94基因1号、2号外显子。更优选还包含3号外显子的部分，其中，3号外显子的部分包含编码前1
‑
5优选为1、2、3、4、5更优选为3个氨基酸的3号外显子的核苷酸序列。
88.优选的，所述的人源化cd94蛋白选自下列组中的一种：
89.a)所述人源化cd94蛋白中来源于人cd94蛋白的氨基酸序列为seq id no：2所示氨基酸序列的全部或部分；
90.b)所述人源化cd94蛋白中来源于人cd94蛋白的氨基酸序列与seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
91.c)所述人源化cd94蛋白中来源于人cd94蛋白的氨基酸序列与seq id no：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
92.d)所述人源化cd94蛋白中来源于人cd94蛋白的氨基酸序列与seq id no：2所示
的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
93.和/或，
94.e)所述人源化cd94蛋白中来源于非人动物cd94蛋白的氨基酸序列为seq id no：1所示氨基酸序列的部分；
95.f)所述人源化cd94蛋白中来源于非人动物cd94蛋白的氨基酸序列与seq id no：1所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
96.g)所述人源化cd94蛋白中来源于非人动物cd94蛋白的氨基酸序列与seq id no：1所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
97.h)所述人源化cd94蛋白中来源于非人动物cd94蛋白的氨基酸序列与seq id no：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
98.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
99.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
100.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdcscid il
‑
2rγnul小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
101.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd94蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
102.a)为seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位氨基酸序列的全部或部分；
103.b)与seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
104.c)与seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
105.d)与seq id no：2的第37
‑
179或34
‑
179或33
‑
179位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
106.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd94蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
107.i)为seq id no：8氨基酸序列的全部或部分；
108.ii)与seq id no：8氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
109.iii)与seq id no：8所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
110.iv)与seq id no：8所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
111.本发明的第二方面，提供了一种人源化cd94基因，所述的人源化cd94基因包含人cd94基因的部分。
112.优选的，所述的人源化cd94基因包含编码人cd94蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人cd94蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，包含编码n端和/或c端去除1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸残基的人cd94蛋白胞外区的核苷酸序列。最为优选的，包含编码n端去除5个氨基酸残基的人cd94蛋白胞外区的核苷酸序列。
113.在本发明的一个具体实施方式中，包含编码与seq id no：2的第37
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第37
‑
179位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列。
114.在本发明的一个具体实施方式中，来源于人的cd94还可以包含编码seq id no：2的第37
‑
179位两端向外延伸的与非人动物相同或性质相似的氨基酸序列残基的序列，所述相同或性质相似的氨基酸序列可以来自胞外区、跨膜区和/或胞质区，优选来自胞外区，例如seq id no：2的第34
‑
179位或seq id no：2的第33
‑
179位。该人源化cd94基因表达的人源化cd94蛋白依然具有结合人相应抗体的功能。
115.在本发明的一个具体实施方式中，包含编码与seq id no：2的第34
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第34
‑
179位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列。
116.在本发明的一个具体实施方式中，包含编码与seq id no：2的第33
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第33
‑
179位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列。
117.再进一步优选的，跨膜区、胞质区来源于非人动物，所述部分胞外区包含至多1
‑
10个氨基酸来源于非人动物。
118.进一步优选的，部分胞外区包含n端和/或c端至多1
‑
10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
119.在本发明的一个具体实施方式中，部分胞外区包含n端至多1
‑
10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
120.优选的，所述的人源化cd94基因编码本发明所述的人源化cd94蛋白。
121.优选的，所述的人源化cd94基因包含人cd94基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含4号至7号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含4号外显子的全部或部分、5号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3号外显子的部分，更优选还包含4
‑
5号内含子和/或6
‑
7号内含子，其中4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
21(优选10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21)个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
15个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码16
‑
19个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码20或21个连续氨基酸的核苷酸序列；更优选的，4号外显子的部分包含去除编码前3个氨基酸的4号外显子的核苷酸序列，所述7号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，所述的
3号外显子的部分包含3号外显子中编码最后1
‑
5优选1、2、3、4、5更优选为1个氨基酸的核苷酸序列。
122.优选的，所述的人源化cd94基因还包含非人动物cd94基因的部分；优选为非人动物cd94基因的1号、2号外显子。更优选还包含3号外显子的部分，其中，3号外显子的部分包含编码前1
‑
5优选为1、2、3、4、5更优选为3个氨基酸的3号外显子的核苷酸序列。
123.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
124.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
125.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdcscid il
‑
2rγnul小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
126.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd94基因包含与seq id no：6具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含seq id no：6所示的核苷酸序列。
127.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd94基因包含下列组中的一种：
128.(a)为seq id no：5所示核苷酸序列的全部或部分；
129.(b)与seq id no：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
130.(c)与seq id no：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
131.(d)具有seq id no：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
132.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd94基因转录的mrna选自下列组中的一种：
133.(i)为seq id no：7所示核苷酸序列的全部或部分；
134.(ii)与seq id no：7所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
135.(iii)与seq id no：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
136.(iv)与seq id no：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
137.优选的，所述的人源化cd94基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。
138.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
off system/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
139.本发明的第三方面，提供了一种基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表
达人或人源化cd94蛋白。
140.优选的，所述的非人动物的内源cd94蛋白表达降低或缺失。
141.优选的，所述的非人动物体内表达本发明所述的人源化cd94蛋白。
142.优选的，人cd94基因的部分或者人源化cd94基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。
143.优选的，所述的非人动物体内包含人cd94基因的部分，更优选包含本发明所述的人源化cd94基因。
144.优选的，所述的非人动物体内还表达人或人源化nkg2a蛋白。进一步优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a蛋白的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分氨基酸序列。再进一步优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a蛋白的胞外区的全部或部分；更进一步优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含n端和/或c端去除1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸残基的人nkg2a蛋白胞外区。
145.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化nkg2a蛋白包含与seq id no：29的第94
‑
233位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：29的第94
‑
233位所示氨基酸序列一致。
146.在本发明的一个具体实施方式中，来源于人的nkg2a还可以包含seq id no：29的第94
‑
233位两端向外延伸的与非人动物相同或性质相似的氨基酸序列残基的序列，所述相同或性质相似的氨基酸序列可以来自胞外区、跨膜区和/或胞质区。该人源化nkg2a基因表达的人源化nkg2a蛋白依然具有结合人相应抗体的功能。
147.优选的，所述的非人动物体内内源nkg2a蛋白表达降低或缺失。
148.优选的，所述的非人动物体内包含人nkg2a基因的部分。进一步优选的，包含人nkg2a基因的1号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含人nkg2a基因的4号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含7
‑
8号内含子，其中8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。最为优选的，包含人nkg2a基因的4号外显子的部分、5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含4
‑
5号内含子和/或7
‑
8号内含子，其中4号外显子的部分至少包含编码末尾1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸的4号外显子，优选为至少包含编码最后一个氨基酸的4号外显子，8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，包含与seq id no：32具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含与seq id no：32所示核苷酸序列一致。
149.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
150.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
151.优选地，所述小鼠或大鼠还表达人或人源化nkg2a、pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla4、b7h3、b7h4、cd47、il2、il23a和ccr2蛋白中的至少一种。
152.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdcscid il
‑
2rγnul小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
153.本发明的第四方面，提供了一种基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化cd94蛋白。
154.优选的，所述的非人动物选自上述cd94基因人源化的非人动物。
155.优选的，包括用包含编码人cd94蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。进一步优选的，用包含编码人cd94蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。更进一步优选的，用包含编码n端和/或c端去除1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸残基的人cd94蛋白胞外区的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上再进一步优选的，用包含编码n端去除5个氨基酸残基的人cd94蛋白胞外区的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
156.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码seq id no：2的第37
‑
179位的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
157.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码与seq id no：2的第37
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第37
‑
179位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
158.在本发明的一个具体实施方式中，来源于人的cd94还可以包含编码seq id no：2的第37
‑
179位两端向外延伸的与非人动物相同或性质相似的氨基酸序列残基的序列的替换，所述相同或性质相似的氨基酸序列可以来自胞外区、跨膜区和/或胞质区，优选来自胞外区，例如seq id no：2的第34
‑
179位或seq id no：2的第33
‑
179位。获得的cd94基因人源化的非人动物表达的蛋白依然具有结合人相应抗体的功能。
159.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码与seq id no：2的第34
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第34
‑
179位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
160.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码与seq id no：2的第33
‑
179位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：2的第33
‑
179位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
161.优选的，包括用包含人cd94基因的部分核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。进一步优选的，用包含人cd94基因的1号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。更进一步优选的，用包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。再进一步优选的，用包含4号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。最为优选的，用包含4号外显子的全部或部
分、5号至6号外显子的全部和7号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含3号外显子的部分，更优选还包含4
‑
5号内含子和/或6
‑
7号内含子插入或替换至非人动物cd94基因座上，其中4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
21(10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21)个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
15个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码16
‑
19个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码20或21个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分包含去除编码前3个氨基酸的4号外显子的核苷酸序列，所述7号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，所述的3号外显子的部分包含3号外显子中编码最后1
‑
5优选为1、2、3、4、5更优选为3个氨基酸的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，用包含seq id no：5所示核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
162.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人cd94蛋白的cdna序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
163.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化cd94蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
164.在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化cd94基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物cd94基因座上。
165.优选的，所述的插入或替换的位点为cd94基因的内源调控元件之后。
166.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源cd94基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源cd94基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源cd94基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
167.进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源cd94蛋白不能正常表达。
168.优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
169.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化cd94基因。
170.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化cd94蛋白。
171.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(crispr/cas9)技术、锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。
172.优选的，使用cd94基因打靶载体进行非人动物的构建，其中，所述的cd94基因打靶载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人cd94基因的部分。优选的，包含人cd94基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分；更进一步优选的，包含4号至7号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含4号外显子的全部或部分、5号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3号外显子的部分，更优选还包含4
‑
5号内含子和/或6
‑
7号内含子，其中4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
21优选10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个连续氨基酸的核苷酸序列更优选的，4号外显子的
部分至少包含4号外显子中编码10
‑
15个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码16
‑
19个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码20或21个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分包含去除编码前3个氨基酸的4号外显子的核苷酸序列，所述7号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，所述的3号外显子的部分包含3号外显子中编码最后1
‑
5优选为1、2、3、4、5更优选为3个氨基酸的核苷酸序列。最为优选的，包含与seq id no：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或包含与seq id no：5所述核苷酸序列一致。
173.优选的，所述的cd94基因打靶载体还包含5’臂，其选自非人动物cd94基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：3至少具有90％同源性，或者包含seq id no：3所示的核苷酸序列。和/或，所述的cd94基因打靶载体还包含3’臂，其选自非人动物cd94基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：4至少具有90％同源性，或者包含seq id no：4所示的核苷酸序列。
174.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述cd94基因打靶载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得cd94基因人源化的非人动物。
175.优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向cd94基因的sgrna与上述cd94基因打靶载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物cd94基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd94基因上的靶序列上。
176.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd94基因的1号外显子至6号外显子序列上。
177.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd94基因的3号外显子至6号外显子序列上。
178.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd94基因的3号外显子和/或6号外显子序列上。
179.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述cd94基因打靶载体、靶向cd94基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得cd94基因人源化的非人动物。
180.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
181.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
182.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
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prkdcscid il
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2rγnul小鼠、nod
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rag 1
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(nrg)小鼠、rag 2
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(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
183.本发明的第五方面，提供了一种cd94基因打靶载体，所述的cd94基因打靶载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人cd94基因的部分。
184.优选的，所述的供体dna序列包含人cd94基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至7号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含4号至7号外显子的全部或部分；更进一步优选的，包含4号外显子的全部或部分、5号至6号外显子的全部和7号外显子的部分，优选还包含3号外显子的部分，优选还包含4
‑
5号内含子和/或6
‑
7号内含子，其中4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
21(优选10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21)个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码10
‑
15个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码16
‑
19个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，4号外显子的部分至少包含4号外显子中编码20或21个连续氨基酸的核苷酸序列；更优选的，4号外显子的部分包含去除编码前3个氨基酸的4号外显子的核苷酸序列，所述7号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列，所述的3号外显子的部分包含3号外显子中编码最后1
‑
5优选为1、2、3、4、5更优选为3个氨基酸的核苷酸序列。最为优选的，包含与seq id no：5具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或包含与seq id no：5所述核苷酸序列一致。
185.优选的，所述的cd94基因打靶载体还包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自非人动物cd94基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：3至少具有90％同源性，或者包含seq id no：3所示的核苷酸序列。和/或，所述的cd94基因打靶载体还包含与待改变的转换区3’端同源的dna片段，即3’臂，其选自非人动物cd94基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：4至少具有90％同源性，或者包含seq id no：4所示的核苷酸序列。
186.优选的，所述cd94基因打靶载体的待改变的转换区位于非人动物cd94基因座上。进一步优选的，位于非人动物cd94基因的1号至6号外显子上。更进一步优选的，位于非人动物cd94基因的3号至6号外显子上。
187.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
188.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
189.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
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2rγnul小鼠、nod
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(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
190.优选的，所述的cd94基因打靶载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
191.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
192.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
193.本发明的第六方面，提供了一种靶向cd94基因的sgrna，所述的sgrna靶向非人动物cd94基因，同时所述sgrna的序列在待改变的cd94基因上的靶序列上。
194.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd94基因的1号外显子至6号外显子序列上。
195.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd94基因的3号外显子至6号外显子序列上。
196.优选的，所述sgrna的靶位点位于cd94基因的3号外显子和/或6号外显子序列上。
197.本发明的第七方面，提供了一种编码上述靶向cd94基因的sgrna的dna分子。优选的，所述的dna分子的双链为sgrna的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
198.本发明的第八方面，提供了一种包含上述sgrna或者上述dna分子的靶向cd94基因的sgrna载体。
199.本发明的第九方面，提供了一种包含上述cd94基因打靶载体、靶向cd94基因的sgrna、dna分子和/或靶向cd94基因的sgrna载体的细胞。
200.本发明的第十方面，提供了上述cd94基因打靶载体，上述的sgrna，dna分子，靶向cd94基因的sgrna载体或者上述的包含cd94基因打靶载体和/或靶向cd94基因的sgrna、dna分子或靶向cd94基因的sgrna载体细胞在cd94基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
201.本发明的第十一方面，提供了一种人源化nkg2a蛋白，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a蛋白的全部或部分。
202.优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
203.进一步优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a蛋白的胞外区的全部或部分。
204.优选的，所述的人源化nkg2a蛋白还包含非人动物nkg2a蛋白的部分，更优选为非人动物nkg2a蛋白的跨膜区和/或胞质区。
205.优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含跨膜区、胞质区和胞外区，其中，胞外区包含人nkg2a蛋白胞外区的全部或部分。优选的，胞外区的氨基酸序列包含n端和/或c端去除1
‑
10(优选1
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9、1
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8、1
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7、1
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6、1
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5、1
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4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸残基的人nkg2a蛋白胞外区；进一步优选的，所述的胞外区包含与seq id no：29的第94
‑
233位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：29的第94
‑
233位所示氨基酸序列一致。
206.在本发明的一个具体实施方式中，来源于人的nkg2a还可以包含seq id no：29的第94
‑
233位两端向外延伸的与非人动物相同或性质相似的氨基酸序列残基的序列，所述相同或性质相似的氨基酸序列可以来自胞外区、跨膜区和/或胞质区。该人源化nkg2a蛋白依然具有结合人相应抗体的功能。
207.再进一步优选的，跨膜区、胞质区来源于非人动物，所述部分胞外区包含至多1
‑
10个氨基酸来源于非人动物。
208.进一步优选的，部分胞外区包含n端和/或c端至多1
‑
10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
209.在本发明的一个具体实施方式中，部分胞外区包含n端至多1
‑
10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
210.优选的，所述的人源化nkg2a蛋白包含人nkg2a基因的3号至8号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含3号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含4号至8号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。再进一步优选的，包含5号至8号外显子编码的氨基酸序列。再进一步优选的，包含4号外显子的部分、5号至8号外显子，其中4号外显子的部分至少包含编码末尾1
‑
10(优选1
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9、1
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8、1
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7、1
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6、1
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5、1
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4、1
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3、1
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2)个氨基酸的4号外显子，优选为至少包含编码最后一个氨基酸的4号外显子。
211.优选的，所述的人源化nkg2a蛋白还包含非人动物nkg2a基因编码的氨基酸序列的全部或部分，更优选为非人动物nkg2a基因的1号外显子，进一步优选还包含2号外显子的部分。
212.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
213.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
214.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
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2rγnul小鼠、nod
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(nrg)小鼠、rag 2
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(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
215.优选的，所述的人源化nkg2a蛋白选自下列组中的一种：
216.a)所述人源化nkg2a蛋白中来源于人nkg2a蛋白的氨基酸序列为seq id no：29所示氨基酸序列的全部或部分；
217.b)所述人源化nkg2a蛋白中来源于人nkg2a蛋白的氨基酸序列与seq id no：29所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
218.c)所述人源化nkg2a蛋白中来源于人nkg2a蛋白的氨基酸序列与seq id no：29所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
219.d)所述人源化nkg2a蛋白中来源于人nkg2a蛋白的氨基酸序列与seq id no：29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
220.和/或，
221.e)所述人源化nkg2a蛋白中来源于非人动物nkg2a蛋白的氨基酸序列为seq id no：28所示氨基酸序列的部分；
222.f)所述人源化nkg2a蛋白中来源于非人动物nkg2a蛋白的氨基酸序列与seq id no：28所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
223.g)所述人源化nkg2a蛋白中来源于非人动物nkg2a蛋白的氨基酸序列与seq id no：28所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
224.h)所述人源化nkg2a蛋白中来源于非人动物nkg2a蛋白的氨基酸序列与seq id no：28所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
225.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化nkg2a蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
226.a)为seq id no：29的第94
‑
233位氨基酸序列的全部或部分；
227.b)与seq id no：29的第94
‑
233位氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
228.c)与seq id no：29的第94
‑
233位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
229.d)与seq id no：29的第94
‑
233位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
230.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化nkg2a蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
231.i)为seq id no：35氨基酸序列的全部或部分；
232.ii)与seq id no：35氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
233.iii)与seq id no：35所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
234.iv)与seq id no：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
235.本发明的第十二方面，提供了一种人源化nkg2a基因，所述的人源化nkg2a基因包含人nkg2a基因的部分。
236.优选的，所述的人源化nkg2a基因包含编码人nkg2a蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人nkg2a蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，包含编码n端和/或c端去除1
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10(优选1
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9、1
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8、1
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7、1
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6、1
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5、1
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4、1
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3、1
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2)个氨基酸残基的人nkg2a蛋白胞外区的核苷酸序列。最为优选的，包含编码与seq id no：29的第94
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233位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：29的第94
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233位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列。
237.在本发明的一个具体实施方式中，来源于人的nkg2a还可以包含编码seq id no：29的第94
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233位两端向外延伸的与非人动物相同或性质相似的氨基酸序列残基的序列，所述相同或性质相似的氨基酸序列可以来自胞外区、跨膜区和/或胞质区。该人源化nkg2a基因表达的人源化nkg2a蛋白依然具有结合人相应抗体的功能。
238.再进一步优选的，跨膜区、胞质区来源于非人动物，所述部分胞外区包含至多1
‑
10个氨基酸来源于非人动物。
239.进一步优选的，部分胞外区包含n端和/或c端至多1
‑
10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
240.在本发明的一个具体实施方式中，部分胞外区包含n端至多1
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10(优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸来源于非人动物。
241.优选的，所述的人源化nkg2a基因编码上述的人源化nkg2a蛋白。
242.优选的，所述的人源化nkg2a基因包含人nkg2a基因的部分。进一步优选的，包含人nkg2a基因的1号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。再进一步优选的，包含人nkg2a基因的4号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含7
‑
8号内含子，其中8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。最为优选的，包含人nkg2a基因的4号外显子的部分、5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含4
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5号内含子和/或7
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8号内含子，其中4号外显子的部分至少包含编码末尾1
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10(优选1
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9、1
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8、1
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7、1
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6、1
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5、1
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4、1
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3、1
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2)个氨基酸的4号外显子，优选为至少包含编码最后一个氨基酸的4号外显子，8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，包含与seq id no：32具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含与seq id no：32所示核苷酸序列一致。
243.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
244.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
245.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
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prkdcscid il
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2rγnul小鼠、nod
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rag 1
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il2rg
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(nrg)小鼠、rag 2
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il2rg
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‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
246.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化nkg2a基因包含与seq id no：33具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含seq id no：33所示的核苷酸序列。
247.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化nkg2a基因包含下列组中的一种：
248.(a)为seq id no：32所示核苷酸序列的全部或部分；
249.(b)与seq id no：32所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
250.(c)与seq id no：32所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
251.(d)具有seq id no：32所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
252.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化nkg2a基因转录的mrna选自下列组中的一种：
253.(i)为seq id no：34所示核苷酸序列的全部或部分；
254.(ii)与seq id no：34所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
255.(iii)与seq id no：34所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
256.(iv)与seq id no：34所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
257.优选的，所述的人源化nkg2a基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。
258.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
off system/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
259.本发明的第十三方面，提供了一种基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化nkg2a蛋白。
260.优选的，所述的非人动物的内源nkg2a蛋白表达降低或缺失。
261.优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化nkg2a蛋白。
262.优选的，所述的人nkg2a基因的部分或者人源化nkg2a基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。
263.优选的，所述的非人动物体内包含人nkg2a基因的部分，更优选包含上述的人源化nkg2a基因。
264.优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化cd94蛋白；更优选为上述的人源化cd94蛋白。
265.优选的，所述的非人动物体内内源cd94蛋白表达降低或缺失。
266.优选的，所述的非人动物体内包含人cd94基因的部分；更优选为上述的人源化cd94基因。
267.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
268.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
269.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdcscid il
‑
2rγnul小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
270.本发明的第十四方面，提供了一种基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化nkg2a蛋白。
271.优选的，所述的非人动物选自上述的nkg2a基因人源化的非人动物。
272.优选的，包括用包含编码人nkg2a蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。进一步优选的，用包含编码人nkg2a蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。更进一步优选的，用包含编码n端和/或c端去除1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸残基的人nkg2a蛋白胞外区的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。最为优选的，用包含与seq id no：29的第94
‑
233位具
有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：29的第94
‑
233位所示氨基酸序列一致的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。
273.优选的，包括用包含人nkg2a基因的部分核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。进一步优选的，用包含人nkg2a基因的1号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。更进一步优选的，用包含人nkg2a基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。再进一步优选的，用包含人nkg2a基因的4号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。更进一步优选的，用包含人nkg2a基因的5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含7
‑
8号内含子的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上，其中8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。最为优选的，用包含人nkg2a基因的4号外显子的部分、5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含4
‑
5号内含子和/或7
‑
8号内含子核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上，其中4号外显子的部分至少包含编码末尾1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸的4号外显子，优选为至少包含编码最后一个氨基酸的4号外显子，8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。
274.在本发明的一个具体实施方式中，用包含与seq id no：32具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含与seq id no：32所示一致的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。
275.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人nkg2a蛋白的cdna序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。
276.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化nkg2a蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。
277.在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化nkg2a基因的核苷酸序列插入或替换至非人动物nkg2a基因座上。
278.优选的，所述的插入或替换的位点为nkg2a基因的内源调控元件之后。
279.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源nkg2a基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源nkg2a基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源nkg2a基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
280.进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源nkg2a蛋白不能正常表达。
281.优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
282.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化nkg2a基因。
283.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化nkg2a蛋白。
284.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(crispr/cas9)技术、锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核
酶)或其他分子生物学技术。
285.优选的，使用nkg2a基因打靶载体进行非人动物的构建，其中，所述的nkg2a基因打靶载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人nkg2a基因的部分。优选的，包含人nkg2a基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人nkg2a基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的4号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含7
‑
8号内含子，其中8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。再进一步优选的，包含人nkg2a基因的4号外显子的部分、5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含4
‑
5号内含子和/或7
‑
8号内含子，其中4号外显子的部分至少包含编码末尾1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸的4号外显子，优选为至少包含编码最后一个氨基酸的4号外显子，8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。最为优选的，包含与seq id no：32具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含与seq id no：32所示核苷酸序列一致。
286.优选的，所述的nkg2a基因打靶载体还包含5’臂，其选自非人动物nkg2a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：30至少具有90％同源性，或者包含seq id no：30所示的核苷酸序列。和/或，所述的nkg2a基因打靶载体还包含3’臂，其选自非人动物nkg2a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：31至少具有90％同源性，或者包含seq id no：31所示的核苷酸序列。
287.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述nkg2a基因打靶载体、导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得nkg2a基因人源化的非人动物。
288.优选的，使用靶向nkg2a基因的sgrna进行非人动物的构建，其中，所述的sgrna靶向非人动物nkg2a基因，同时所述sgrna的序列在待改变的nkg2a基因上的靶序列上。
289.优选的，所述sgrna的靶位点位于nkg2a基因的1号外显子至7号外显子序列上。
290.优选的，所述sgrna的靶位点位于nkg2a基因的2号外显子至6号外显子序列上。
291.优选的，所述sgrna的靶位点位于nkg2a基因的2号外显子和/或6号外显子序列上。
292.优选的，所述sgrna的5’端靶位点序列如seq id no：44
‑
51任一项所示。进一步优选的，所述sgrna的5’端靶位点序列如seq id no：44所示。
293.优选的，所述sgrna的3’端靶位点序列如seq id no：52
‑
58任一项所示。进一步优选的，所述sgrna的3’端靶位点序列如seq id no：58所示。
294.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向nkg2a基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得nkg2a基因人源化的非人动物。
295.优选的，使用上述的靶向nkg2a基因的sgrna和上述的nkg2a基因打靶载体一起进行非人动物的构建。
296.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述nkg2a基因打靶载体、靶向nkg2a基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得nkg2a基因人源化的非人动物。
297.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
298.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
299.优选地，所述小鼠或大鼠还表达人或人源化cd94、pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla4、b7h3、b7h4、cd47、il2、il23a和ccr2蛋白中的至少一种。
300.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdcscid il
‑
2rγnul小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
301.本发明的第十五方面，提供了一种nkg2a基因打靶载体，所述的nkg2a基因打靶载体包含供体dna序列，所述的供体dna序列包含人nkg2a基因的部分。
302.优选的，所述的nkg2a基因打靶载体包含人nkg2a基因的1号至8号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人nkg2a基因的1号至8号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的4号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含人nkg2a基因的5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含7
‑
8号内含子，其中8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。再进一步优选的，包含人nkg2a基因的4号外显子的部分、5号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含4
‑
5号内含子和/或7
‑
8号内含子，其中4号外显子的部分至少包含编码末尾1
‑
10(优选1
‑
9、1
‑
8、1
‑
7、1
‑
6、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3、1
‑
2)个氨基酸的4号外显子，优选为至少包含编码最后一个氨基酸的4号外显子，8号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。最为优选的，包含与seq id no：32具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含与seq id no：32所示核苷酸序列一致。
303.优选的，所述的nkg2a基因打靶载体还包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自非人动物nkg2a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：30至少具有90％同源性，或者包含seq id no：30所示的核苷酸序列。和/或，所述的nkg2a基因打靶载体还包含与待改变的转换区3’端同源的dna片段，即3’臂，其选自非人动物nkg2a基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：31至少具有90％同源性，或者包含seq id no：31所示的核苷酸序列。
304.优选的，所述nkg2a基因打靶载体的待改变的转换区位于非人动物nkg2a基因座
上。进一步优选的，位于非人动物nkg2a基因的1号至7号外显子上。更进一步优选的，位于非人动物nkg2a基因的2号至6号外显子上。
305.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
306.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
307.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdcscid il
‑
2rγnul小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
308.优选的，所述的nkg2a基因打靶载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
309.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
310.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
311.本发明的第十六方面，提供了一种靶向nkg2a基因的sgrna，其中，所述的sgrna靶向非人动物nkg2a基因，同时所述sgrna的序列在待改变的nkg2a基因上的靶序列上。
312.优选的，所述sgrna的靶位点位于nkg2a基因的1号外显子至7号外显子序列上。
313.优选的，所述sgrna的靶位点位于nkg2a基因的2号外显子至6号外显子序列上。
314.优选的，所述sgrna的靶位点位于nkg2a基因的2号外显子和/或6号外显子序列上。
315.优选的，所述sgrna的5’端靶位点序列如seq id no：44
‑
51任一项所示。进一步优选的，所述sgrna的5’端靶位点序列如seq id no：44所示。
316.优选的，所述sgrna的3’端靶位点序列如seq id no：52
‑
58任一项所示。进一步优选的，所述sgrna的3’端靶位点序列如seq id no：58所示。
317.本发明的第十七方面，提供了一种编码上述靶向nkg2a基因的sgrna的dna分子。优选的，所述的dna分子的双链为sgrna的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。
318.本发明的第十八方面，提供了一种包含上述sgrna或者上述dna分子的靶向nkg2a基因的sgrna载体。
319.本发明的第十九方面，提供了一种包含上述nkg2a基因打靶载体、靶向nkg2a基因的sgrna、dna分子和/或靶向nkg2a基因的sgrna载体的细胞。
320.本发明的第二十方面，提供了上述nkg2a基因打靶载体，上述的sgrna，dna分子，靶向nkg2a基因的sgrna载体或者上述的包含nkg2a基因打靶载体和/或靶向nkg2a基因的sgrna、dna分子或靶向nkg2a基因的sgrna载体细胞在nkg2a基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
321.本发明的第二十一方面，提供了一种包含上述nkg2a基因打靶载体和/或靶向nkg2a基因的sgrna的细胞。
322.本发明的第二十二方面，提供了上述nkg2a基因打靶载体，上述的靶向nkg2a基因的sgrna，或者上述包含nkg2a基因打靶载体和/或靶向nkg2a基因的sgrna的细胞在nkg2a基因修饰中的应用。
323.本发明的第二十三方面，提供了一种cd94基因和nkg2a基因人源化的非人动物的构建方法，包括：对上述的cd94基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的cd94基因人源化的非人动物采用上述nkg2a基因人源化的非人动物的构建方法进行基因编辑；或者，对上述的nkg2a基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的nkg2a基因人源化的非人动物采用上述cd94基因人源化的非人动物的构建方法进行基因编辑。
324.优选的，所述的非人动物表达人cd94蛋白和人nkg2a蛋白。
325.优选的，所述的非人动物内源的cd93蛋白和内源的nkg2a蛋白表达降低或缺失。
326.本发明的第二十四方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
327.(一)提供上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物；
328.(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
329.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因pd
‑
1、pd
‑
l1、ctla4、b7h3、b7h4、cd47、il2、il23a或ccr2中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。
330.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
331.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
332.本发明的第二十五方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。
333.本发明的第二十六方面，提供了一种nkg2a基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失nkg2a基因的全部或部分核苷酸序列。
334.优选的，所述的非人动物缺失nkg2a基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号至6号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失2号外显子的部分、3
‑
5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还缺失2
‑
3号内含子和/或5
‑
6号内含子，其中缺失的2号外显子的部分至少包含编码最后一个氨基酸的核苷酸序列，缺失的6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。
335.优选的，采用上述靶向nkg2a基因的sgrna制备nkg2a基因缺失的非人动物。
336.本发明的第二十七方面，提供了一种cd94基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失cd94基因的全部或部分核苷酸序列。
337.优选的，所述的非人动物缺失cd94基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失3号至6号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失3号外显子的部分、4
‑
5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还缺失3
‑
4号内含子和/或5
‑
6号内含子，其中缺失的3号外显子的部分至少包含编码1
‑
21优选1
‑
18个连续氨基酸的核苷酸序列，优选的，缺
失的3号外显子的部分至少包含编码末尾18个连续氨基酸的核苷酸序列，缺失的6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。
338.优选的，采用上述靶向cd94因的sgrna制备cd94基因缺失的非人动物。
339.本发明的第二十八方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的非人动物或其子代。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
340.本发明的第二十九方面，提供了一种动物模型的构建方法，包括上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的动物或者多基因修饰的非人动物的构建方法。
341.本发明的第三十方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述构建的多基因修饰的非人动物在制备动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
342.本发明的第三十一方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
343.优选的，所述的动物模型是一种结肠癌动物模型。优选为结肠癌小鼠模型。
344.在一个具体实施方式中，所述的结肠癌小鼠模型的构建方法为，选取如上所述的cd94基因和nkg2a基因人源化的非人动物的构建方法获得的nkg2a/cd94基因人源化小鼠，皮下接种过表达人hla的小鼠结肠癌细胞。优选的，选取8周nkg2a/cd94基因人源化小鼠；优选的，所述的表达人hla的小鼠结肠癌细胞为b
‑
cag
‑
hhla
‑
e mc38；优选的，接种的数量为5
×
105个。
345.本发明的第三十二方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物模型。
346.本发明的第三十三方面，提供了一种瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤动物模型。
347.本发明的第三十四方面，提供了一种cd94和/或nkg2a基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化cd94蛋白，和/或，人或人源化nkg2a蛋白。优选的，所述的细胞表达上述的人源化cd94蛋白和/或上述的人源化nkg2a蛋白。
348.优选的，所述的细胞的基因组中包含人cd94和/或nkg2a基因的部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化cd94基因和/或上述的人源化nkg2a基因。
349.本发明的第三十五方面，提供了一种nkg2a基因缺失的细胞，所述的细胞缺失nkg2a基因的全部或部分核苷酸序列。
350.优选的，所述的细胞缺失nkg2a基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失2号至6号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失2号外显子的部分、3
‑
5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还缺失2
‑
3号内含子和/或5
‑
6号内含子，其中缺失的2号外显子的部分至少包含编码最后一个氨基酸的核苷酸序列，缺失的6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。
351.优选的，采用上述靶向nkg2a基因的sgrna制备nkg2a基因缺失的细胞。
352.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
353.本发明的第三十六方面，提供了一种cd94基因缺失的细胞，所述的细胞缺失cd94基因的全部或部分核苷酸序列。
354.优选的，所述的细胞缺失cd94基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失3号至6号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失3号外显子的部分、4
‑
5号外显子的全部和6号外显子的部分，优选还缺失3
‑
4号内含子和/或5
‑
6号内含子，其中缺失的3号外显子的部分至少包含编码1
‑
21优选1
‑
18个连续氨基酸的核苷酸序列，优选的缺失的3号外显子的部分至少包含编码末尾18个连续氨基酸的核苷酸序列，缺失的6号外显子的部分至少包含编码胞外区的核苷酸序列。
355.优选的，采用上述靶向cd94基因的sgrna制备cd94基因缺失的细胞。
356.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
357.本发明的第三十七方面，提供了一种表达上述的人源化cd94蛋白和/或上述的人源化nkg2a蛋白的构建体。
358.本发明的第三十八方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
359.优选的，所述的细胞不能发育成动物个体。
360.本发明的第三十九方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
361.本发明的第四十方面，提供了来源于上述的人源化cd94蛋白、上述的人源化cd94基因、上述的人源化nkg2a蛋白、上述的人源化nkg2a基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究nkg2a通路功能、人nkg2a通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗病毒感染药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
362.本发明的第四十一方面，提供了一种人cd94和/或nkg2a特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。
363.优选的，所述的调节剂选自car
‑
t、药物；优选的，所述的药物为抗体。
364.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
365.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
366.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
367.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
368.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
369.优选的，所述人cd94和/或nkg2a特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为
药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
370.本发明的第四十二方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。
371.优选的，所述的干预方案选自car
‑
t、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
372.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
373.优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
374.本发明的第四十三方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备人cd94和/或nkg2a特异性调节剂中的用途。
375.本发明的第四十四方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备治疗肿瘤、病毒感染或自身免疫疾病的药物中的用途。
376.本发明所述的cd94和/或nkg2a基因人源化的非人动物，其体内可正常表达人或人源化cd94和/或nkg2a蛋白，可用于针对人nkg2a通路靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病、病毒感染和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。
377.本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
378.本发明所述的“病毒感染”包括hiv感染。
379.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为头颈部复发或转移性鳞状细胞癌(scchn)。
380.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
381.本发明所述的“人源化xxx蛋白”，包含来源于人xxx蛋白的部分和非人xxx蛋白的
部分。例如人源化cd94蛋白或人源化nkg2a蛋白。
382.其中，所述的“人源化cd94蛋白”包含连续或间隔的5
‑
179个氨基酸序列与人cd94蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10
‑
143个，更优选为连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、143、150、160、170或179个氨基酸序列与人cd94蛋白的氨基酸序列一致。
383.所述的“人源化nkg2a蛋白”包含连续或间隔的5
‑
233个氨基酸序列与人nkg2a蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔10
‑
140个，更优选为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、150、160、170、180、190、200、210、220、230或233个氨基酸序列与人nkg2a蛋白的氨基酸序列一致。
384.本发明所述的“人源化xxx基因”，包含来源于人xxx基因的部分和非人xxx基因的部分。例如人源化cd94基因或人源化nkg2a基因。
385.其中，所述的“人源化cd94基因”包含连续或间隔的20bp
‑
90000bp个核苷酸序列与人cd94基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20
‑
5157个，更优选为20、50、100、200、300、400、429、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、4000、4500、5000、5157、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000bp个核苷酸序列与人cd94基因的核苷酸序列一致。
386.本发明所述的“人源化nkg2a基因”包含连续或间隔的20
‑
13000bp个核苷酸序列与人nkg2a基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20
‑
3934个，更优选为20、50、100、200、300、400、420、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3934、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、8000、9000、10000、11000、12000或13000bp个核苷酸序列与人nkg2a基因的核苷酸序列一致。
387.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“4号至7号外显子”包含4号外显子、4
‑
5号内含子、5号外显子、5
‑
6号内含子、6号外显子、6
‑
7号内含子和7号外显子的全部核苷酸序列。
388.本发明所述的“x
‑
xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“4
‑
5号内含子”表示4号外显子与5号外显子之间的内含子。
389.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“cd94基因座”表示cd94基因1号至6号外显子上的任选一段的dna片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的cd94基因座可以是cd94基因1号至6号外显子上的任选一段的dna片段。例如所述的“nkg2a基因座”表示nkg2a基因1号至7号外显子上的任选一段的dna片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的nkg2a基因座可以是nkg2a基因1号至7号外显子上的任选一段的dna片段。
390.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre
‑
mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。
391.本发明所述的“三个以上”包括但不限于三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个等。
392.本发明所述的“连续三个以上”包括但不限于连续三个、连续四个、连续五个、连续六个、连续七个、连续八个、连续九个或连续十个等。其中“4号至7号外显子的连续三个以上”包括连续三个、四个等等外显子，还包括期间的内含子核苷酸序列。
393.本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
394.本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
395.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
396.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
397.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠。
398.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，
1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.inchief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
附图说明
399.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
400.图1：鼠cd94基因和人cd94基因对比示意图(非按比例)。
401.图2：人源化cd94小鼠基因示意图(非按比例)，其中，用人cd94基因部分4号至部分7号外显子的序列替换小鼠的部分3号至部分6号外显子区域获得人源化cd94小鼠基因。
402.图3：cd94基因打靶策略及cd94基因打靶载体设计示意图，其中，cd94基因打靶载体包含5’同源臂、3’同源臂以及含有人cd94 dna片段、frt和neor的敲进片段(ki片段)，3’同源臂下游还有dta片段。
403.图4：采用cd94
‑5’
探针、cd94
‑3’
探针和neo探针进行southern blot鉴定的结果图，其中，wt为野生型c57bl/6小鼠，1
‑
a09、2
‑
b09、2
‑
c02、2
‑
d02、2
‑
h10、3
‑
b12、3
‑
d05、4
‑
c03和4
‑
g06为克隆编号；
404.图5：cd94人源化小鼠f1代鼠尾pcr鉴定结果，其中，图(a)使用引物对cd94
‑
wt
‑
f和cd94
‑
wt
‑
r用于扩增小鼠内源的野生型cd94基因片段；图(b)使用引物对cd94
‑
wt
‑
f和cd94
‑
mut
‑
r用于扩增修饰后的cd94基因片段，用以验证cd94基因打靶载体是否正确插入小鼠基因组位点，其中，m为marker，pc为阳性对照，wt为野生型小鼠对照，h2o为水对照；
405.图6：小鼠体内脾脏细胞中nk细胞上cd94蛋白表达流式分析结果，其中h/+(图(c)、图(e))为cd94基因人源化杂合子小鼠，wt(图(a)、图(b)和图(d))为野生型c57bl/6小鼠；
406.图7：鼠nkg2a基因和人nkg2a基因对比示意图(非按比例)；
407.图8：人源化nkg2a小鼠基因示意图(非按比例)，其中，用人nkg2a基因部分4号至部分8号外显子的序列替换小鼠的部分2号至部分6号外显子区域获得人源化nkg2a小鼠基因；
408.图9：nkg2a基因打靶策略及nkg2a基因打靶载体设计示意图，其中，nkg2a基因打靶载体包含5’同源臂、3’同源臂以及含有人nkg2a dna片段、frt和neor的敲进片段，3’同源臂下游还有dta元件；
409.图10：sgrna活性检测结果，其中，图(a)为5’端靶位点序列检测结果，图(b)为3’端靶位点序列检测结果，con为阴性对照，pc为阳性对照。
410.图11：nkg2a/cd94基因人源化小鼠rt
‑
pcr检测结果示意图；
411.图12：nkg2a/cd94基因人源化纯合小鼠脾脏中cd94蛋白表达流式分析结果，其中h/h为nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠，wt为野生型c57bl/6小鼠，iso为同型对照；
412.图13：nkg2a/cd94基因人源化纯合小鼠脾脏中nkg2a蛋白表达流式分析结果，其中h/h为nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠，wt为野生型c57bl/6小鼠，iso为同型对照；
413.图14：nkg2a/cd94基因人源化纯合小鼠体内脾脏中cd94和nkg2a蛋白表达流式分析结果，其中h/h为nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠，wt为野生型c57bl/6小鼠，iso为同型对照；
414.图15：c57bl/6野生型小鼠和nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果；
415.图16：c57bl/6野生型小鼠和nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠脾脏中t细胞亚群占比的流式检测结果；
416.图17：nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠皮下接种过表达人hla的小鼠结肠癌细胞mc38，分组给药后，实验周期内各组小鼠体重结果示意图；
417.图18：nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠皮下接种过表达人hla的小鼠结肠癌细胞mc38，分组给药后，实验周期内各组小鼠体重变化结果示意图；
418.图19：nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠皮下接种过表达人hla的小鼠结肠癌细胞mc38，分组给药后，实验周期内各组小鼠肿瘤体积结果示意图；
419.图20：nkg2a基因人源化纯合小鼠体内脾脏中nkg2a蛋白表达流式分析结果，其中h/+为nkg2a基因人源化纯合子小鼠，wt为野生型c57bl/6小鼠，iso为同型对照。
具体实施方式
420.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
421.在下述实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
422.bglii、stui、draiii和ecorv酶购自neb，货号分别为r0144m、r0187m、r3510l、r3195m；
423.c57bl/6小鼠和flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
424.brilliant violet 510
tm anti
‑
mouse cd45 antibody(mcd4
‑
bv605)来源biolegend，货号103138；
425.pe
‑
cy
tm
7 mouse anti
‑
mouse nk
‑
1.1(mnk1.1
‑
pe/cy7)来源bd pharmingen，货号552878；
426.pe anti
‑
mouse cd159a(nkg2ab6)antibody来源biolegend，货号142803；
427.alexa647
‑
conjugated affinipure f(ab
′
)2fragment goat anti
‑
human igg,fc7 fragment specific(minimal cross
‑
reaction to bovine,mouse,and rabbit serum proteins)来源jackson immuno research，货号109
‑
606
‑
170；
428.pe mouse igg2b,κisotype ctrl antibody来源biolegend，货号400311；
429.apc anti
‑
mouse cd94 antibody来源biolegend，货号105511；
430.pe anti
‑
human cd94 antibody来源biolegend，货号305504；
431.apc rat igg2a,k isotype ctrl antibody来源biolegend，货号400512；
432.zombie nir
tm fixable viability kit来源biolegend，货号423106。
433.实施例1：cd94基因人源化小鼠
434.小鼠cd94基因(ncbi gene id：16643，primary source：mgi:1196275，uniprotkb：o54707，位于6号染色体nc_000072.6的第129588092至129598775位，基于转录本nm_010654.4及其编码蛋白np_034784.1(seq id no：1)和人cd94基因(ncbi gene id：3824，primary source：hgnc:6378，uniprotkb：q13241，位于12号染色体nc_000012.12的第10238383至10329608位，基于转录本nm_001351062.1及其编码蛋白np_001337991.1(seq id no：2所示)对比示意图如图1所示。
435.为了达到本发明的目的，采用基因编辑系统可以得到本发明的非人动物，包括但不限于基于锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(crispr)技术或其他分子生物学技术。本实施例示例性的可在小鼠内源cd94基因座引入编码人cd94蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化cd94蛋白。可以采取在小鼠内源cd94基因座上直接插入含有人cd94的基因序列的方法，例如含有人cd94的dna序列或cdna序列，并可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转，或敲除)使得插入位点后的小鼠内源cd94基因组序列不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源cd94基因座上直接用人cd94的基因序列(例如，人cd94的dna序列或cdna序列)进行替换。本实施例将以dna序列的原位替换策略来阐述如何对小鼠cd94基因进行人源化改造。
436.具体而言，用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源cd94基因座上用人cd94基因的序列替换特定小鼠cd94基因序列。在小鼠cd94基因调节元件的控制下，如将至少包含小鼠cd94基因的部分3号至部分6号外显子的4731bp的序列用对应的人基因序列5157bp替换，得到小鼠人源化cd94基因座示意图如图2所示。
437.进一步的，设计如图3所示的cd94基因打靶策略。其中图3所示的cd94基因打靶载体上含有5’同源臂(seq id no：3)、3’同源臂(seq id no：4)以及含有人cd94 dna片段的敲进片段(ki片段)，其中5’同源臂与ncbi登录号为nc_000072.6的第129590135至129593735位核苷酸序列相同；3’同源臂与ncbi登录号为nc_000072.6的第129599166至129603653位核苷酸序列相同；敲进片段上的人cd94基因片段(seq id no：5)与ncbi登录号为nc_000012.12的第10309634至10314790位核苷酸序列相同。seq id no:3：cd93基因5’同源臂3601bp nc_000072.6第129590135至129593735位。
438.其中，含有人cd94基因序列的片段上游与5’同源臂直接连接，含有人cd94基因序列的片段下游与鼠基因座的连接设计为：5
’‑
gaagataaaaatcgttatatctgtaagcaacagctaaatgtttcttaaggcaaagggtatagacaaggaaggtcc
‑3’
(seq id no：6)，其中序列
“”
的最后一个“t”是人序列的最后一个核苷酸，序列“taaat”的第一个“t”是小鼠序列的第一个核苷酸。
439.改造后的人源化小鼠cd94的mrna序列如seq id no：7所示，其表达的氨基酸序列
如seq id no：8所示。
440.cd94基因打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。
441.其中，neo盒上游与小鼠cd94基因座的连接设计为：
[0442]5’‑
aagtatggtaacatatcatctgcgaagcttgatatcgaattccgaagttcctattctctagaaagtataggaactt
‑3’
(seq id no：9)，其中序列
“”
的最后一个“g”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“aagc”的第一个“a”是neo盒的第一个核苷酸。neo盒下游与小鼠cd94基因座的连接设计为：
[0443]5’‑
tattctctagaaagtataggaacttcatcagtcaggtacataatggtggatccaggatgtggtttgattggttctgttcct
‑3’
(seq id no：10)，其中序列
“”
的“t”是neo盒的最后一个核苷酸，“gatgt”的第一个“g”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在cd94基因打靶载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
[0444]
使用常规方法构建cd94基因打靶载体，如通过酶切连接、直接合成等构建用人cd94基因替换小鼠基因的cd94基因打靶载体。小鼠和人cd94 dna分别获自细菌人工染色体(bac)克隆rp23
‑
208d19和rp11
‑
282c10。构建好的cd94基因打靶载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的cd94基因打靶载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测，确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用bglii或stui或draiii消化细胞dna并使用3个探针进行杂交)检测，结果如图4所示，检测结果表明pcr鉴定为阳性的多个克隆中，有6个克隆(1
‑
a09、2
‑
b09、2
‑
c02、2
‑
h10、3
‑
b12、3
‑
d05)为阳性杂合克隆且无随机插入。
[0445]
表1：pcr引物及目的条带大小如下：
[0446][0447]
southern blot检测包括如下探针引物：
[0448]
cd94
‑5’
探针(cd94
‑5’
probe)：
[0449]
f：5
’‑
acaagccaaacactaaattggcat
‑3’
(seq id no：15)
[0450]
r：5
’‑
gtgggccaagtagacacttcct
‑3’
(seq id no：16)
[0451]
cd94
‑3’
探针(cd94
‑3’
probe)：
[0452]
f：5
’‑
cacaacattaagttttccctctagt
‑3’
(seq id no：17)
[0453]
r：5
’‑
gataatccagtactgccttgatagt
‑3’
(seq id no：18)
[0454]
neo探针(neo probe)：
[0455]
f：5
’‑
ggatcggccattgaacaagatgg
‑3’
(seq id no：19)
[0456]
r：5
’‑
cagaagaactcgtcaagaaggcg
‑3’
(seq id no：20)
[0457]
表2
[0458][0459]
按照本领域已知的技术将筛选出的阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到表达人源化cd94蛋白的cd94基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的f1代小鼠(尚未去除neo标记基因)的鉴定结果见图5，其中，编号为cd94
‑
f1
‑
1的小鼠为阳性杂合小鼠。
[0460]
表3：pcr引物及目的条带大小
[0461][0462]
其中，wt为野生型小鼠，mut为cd94人源化小鼠
[0463]
通过流式方法确认小鼠体内人源化cd94蛋白的表达情况。选取6周龄的野生型c57bl/6小鼠和cd94基因人源化杂合小鼠(约6
‑
12周龄)各1只，分别取脾脏细胞，在流式细胞仪上，通过排除用活力染料(zombie nir，biolegend)标记的死细胞并用荧光染料标记的抗体(pe
‑
cy
tm
7 mouse anti
‑
mouse nk
‑
1.1(mnk1.1
‑
pe/cy7)、抗cd3抗体fitc rat anti
‑
mouse cd3、抗鼠cd94抗体apc anti
‑
mouse cd94 antibody(mcd94
‑
apc)、或抗人cd94抗体pe anti
‑
human cd94 antibody(hcd94
‑
pe)、apc rat igg2a,k isotype ctrl)染色来标记细胞。流式分析结果(见图6)表明，与野生型c57bl/6小鼠相比，抗人cd94抗体可以检测到人源化小鼠脾脏内的nk细胞中存在表达人源化cd94蛋白的细胞，而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化cd94蛋白的细胞。
[0464]
实施例2：nkg2a基因人源化小鼠
[0465]
小鼠nkg2a基因(ncbi gene id：16641，primary source：mgi：1336161，uniprotkb：q9z202，位于6号染色体nc_000072.6的第129666015至129682852位，基于转录本nm_001136068.2及其编码蛋白np_001129540.1(seq id no：28))和人nkg2a基因(ncbi gene id：3821，primary source：hgnc:6374，uniprotkb：p26715，位于12号染色体nc_000012.12的第10441673至10454685位，基于转录本nm_213658.2及其编码蛋白np_998823.1(seq id no：29))对比示意图如图7所示。
[0466]
为了实现本发明的目的，采用基因编辑系统可以得到本发明的非人动物，包括但不限于基于锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(crispr)技术或其他分子生物学技术。本实施例示例性的计划对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人nkg2a蛋白的核酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化nkg2a蛋白。为了达到本实施例的目的，可在小鼠内源nkg2a基因座引入编码人nkg2a蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化nkg2a蛋白。可以采取在小鼠内源nkg2a基因座上直接插入含有人nkg2a的基因序列的方法，例如含有人nkg2a的dna序列或cdna序列，并可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转，或敲除)使得插入位点后的小鼠内源nkg2a基因组序列不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源nkg2a基因座上直接用人nkg2a的基因序列(例如，人nkg2a的dna序列或cdna序列)进行替换。本实施例将以dna序列的原位替换的策略来阐述如何对小鼠nkg2a基因进行人源化改造。
[0467]
具体而言，用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源nkg2a基因座上用人nkg2a基因的序列替换特定小鼠nkg2a基因序列。在小鼠nkg2a基因调节元件的控制下，如将至少包含小鼠nkg2a基因的部分2号外显子至部分6号外显子的3438bp的序列用对应的人基因序列3934bp替换，得到小鼠人源化nkg2a基因座示意图如图8所示。
[0468]
进一步的，设计如图9所示的打靶策略。其中图9所示的nkg2a基因打靶载体上含有5’同源臂(seq id no：30)、3’同源臂(seq id no：31)以及含有人nkg2a dna片段，其中5’同源臂与ncbi登录号为nc_000072.6的第129682351至129678300位核苷酸序列相同；3’同源臂与ncbi登录号为nc_000072.6的第129674508至129669878位核苷酸序列相同；敲进片段上的人nkg2a dna片段(seq id no：32)与ncbi登录号为nc_000012.12的第10450487至10446554位核苷酸序列相同。
[0469]
其中，人nkg2a dna片段上游和5’同源臂直接连接，人nkg2a dna片段下游和鼠基因座的连接设计为：5
’‑
tcaataatatatcattgtaagcataatgaaacacctgcactgg
‑3’
(seq id no：33)其中序列“gctt”的最后一个“t”是人序列的最后一个核苷酸，序列“tgaa”的“t”是小鼠序列的第一个核苷酸。
[0470]
改造后的人源化小鼠nkg2a的mrna和氨基酸序列分别如seq id no：34和seq id no：35所示。
[0471]
nkg2a基因打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中，neo盒上游与小鼠nkg2a基因座的连接设计为5
’‑
attgccagttgtatattgcaacttcagcttctgtagtacatttgggtc
tccgaagttcctattctctagaaagtat
‑3’
(seq id no：36)，其中序列“ggtc”的“c”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“gaat”的“g”是neo盒的第一个核苷酸。neo盒下游与小鼠nkg2a基因座的连接设计为5’[0472]
‑
aggaacttcatcagtcaggtacataattaggtggatccacttttagtcaataagtaatattatata
‑3’
(seq id no：37)，其中序列“atcc”的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，“accc”的“a”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在nkg2a基因打靶载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
[0473]
nkg2a基因打靶载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。小鼠和人nkg2a dna分别获自细菌人工染色体(bac)克隆rp23
‑
164f1和rp11
‑
653f19。构建好的nkg2a基因打靶载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的nkg2a基因打靶载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并确认外源基因的整合情况，使用pcr和southern blot技术进行检测，还结合测序鉴定，筛选获得正确的阳性克隆细胞用于囊胚注射。
[0474]
按照本领域已知的技术将筛选出的阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到表达人nkg2a蛋白的nkg2a基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型，pcr引物见表4。
[0475]
表4：pcr引物及目的条带大小如下：
[0476][0477][0478]
还可以引入crispr/cas系统进行基因编辑，从而得到nkg2a基因人源化小鼠。该系统中靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率，因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgrna1
‑
sgrna8)、3’端靶位点(sgrna9
‑
sgrna15)的sgrna序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于nkg2a基因第2号外显子和第6号外显子上，各sgrna在nkg2a上的靶位点序列如下：
[0479]
表5：sgrna在nkg2a上的靶位点序列
[0480][0481][0482]
利用uca试剂盒检测多个sgrna的活性，从结果可见sgrna具有不同活性，检测结果参见图10和表6。从中优先选择2个(分别是sgrna1和sgrna15)进行后续实验。在nkg2a基因打靶载体转染c57bl/6小鼠的胚胎干细胞的同时转入sgrna1、sgrna15和cas9 mrna，也可筛选得到正确的阳性克隆细胞。
[0483]
表6：sgrna的活性检测结果
[0484][0485]
可通过常规检测方法确认获得的阳性小鼠体内人源化nkg2a蛋白的表达情况，例如使用fcsa方法，检测方案如下：选取野生型c57bl/6小鼠和nkg2a基因人源化小鼠各1只，安乐死后取脾细胞，分别用抗鼠cd45抗体brilliant violet 510
tm anti
‑
mouse cd45、鼠源nk细胞表面抗体pe/cy
tm
7 mouse anti
‑
mouse nk1.1、抗鼠cd159a抗体pe anti
‑
mouse cd159a(nkg2ab6)antibody(mnkg2a)(以抗鼠抗体pe mouse igg2b,κisotype ctrl为对照)、抗人igg抗体alexa647
‑
conjugated affinipure f(ab
′
)2fragment goat anti
‑
human igg,fc7 fragment specific(minimal cross
‑
reaction to bovine,mouse,and rabbit serum proteins)(af647)、抗人nkg2a抗体莫那利珠单抗(monalizumab)(hnkg2a)(以抗鼠抗体alexa fluormouse igg1,k isotype ctrl(fc)为对照)识别染色后进行流式检测，检测结果如图20所示，在野生型c57bl/6小鼠体内未检测到人源化nkg2a蛋白的表达，只检测到鼠nkg2a蛋白的表达，在nkg2a基因人源化小鼠杂合子体内同时检测到鼠nkg2a蛋白的表达和人源化nkg2a蛋白的表达。以上实验表明通过本方法，构建了可稳定传代、无随机插入且可在小鼠体内表达人源化nkg2a蛋白的nkg2a基因人源化小鼠。
[0486]
实施例3双基因人源化小鼠和多基因人源化小鼠
[0487]
利用实施例1制得的cd94和/或实施例2制得的nkg2a小鼠还可以制备含有cd94和/或nkg2a的双基因人源化或多基因人源化小鼠模型。如，前述实施例2中，电转时使用的es细胞选择含有除nkg2a基因修饰小鼠的es细胞，例如来源于实施例1得到的cd94基因人源化阳性克隆细胞，可以进一步得到nkg2a与cd94基因人源化的双基因人源化小鼠。也可将本方法得到的nkg2a和/或cd94小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到nkg2a和/或cd94人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
[0488]
以双重人源化nkg2a/cd94小鼠的为例。由于鼠nkg2a与cd94基因均位于6号染色体
上，在得到cd94人源化阳性es细胞后，按照实施例2的方法进行二次打靶，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化nkg2a/cd94小鼠。
[0489]
可采用rt
‑
pcr检测nkg2a/cd94基因人源化小鼠体内人源化nkg2a mrna和人源化cd94 mrna的表达情况。分别选取7周龄野生型c57bl/6小鼠和人源化nkg2a/cd94纯合子小鼠各3只，脱颈安乐死后取脾脏组织，提取细胞总rna，利用逆转录试剂盒逆转录成cdna后进行pcr扩增，引物序列如表7所示。
[0490]
表7 rt
‑
pcr检测引物序列及目的片段长度
[0491][0492]
检测结果显示(见图11)，在野生型c57bl/6小鼠细胞中可检测到鼠nkg2a和cd94 mrna表达，未检测出人源化nkg2a和cd94 mrna表达；在人源化nkg2a/cd94纯合子小鼠细胞中检测到人源化nkg2a和人源化cd94 mrna表达，未检测出鼠nkg2a和cd94 mrna表达。进一步采用流式细胞术检测nkg2a/cd94基因人源化小鼠体内nkg2a和cd94蛋白的表达情况。选取9周龄野生型c57bl/6小鼠和nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠各1只，安乐死后取脾脏细胞，分别用抗鼠cd45抗体brilliant violet 510
tm anti
‑
mouse cd45、鼠源nk细胞表面抗体pe/cy
tm 7mouse anti
‑
mouse nk1.1、抗鼠cd159a抗体pe anti
‑
mouse cd159a(nkg2ab6)antibody(mnkg2a)、抗人igg抗体alexa647
‑
conjugated affinipure f(ab
′
)2fragment goat anti
‑
human igg,fc7 fragment specific(minimal cross
‑
reaction to bovine,mouse,and rabbit serum proteins)(af647)、抗人nkg2a抗体莫那利珠单抗(monalizumab)(hnkg2a)、小鼠抗体mouse igg2a，κisotype ctrl antibody，apc，biolegend
tm
抗体、抗鼠cd94抗体apc anti
‑
mouse cd94 antibody(mcd94)、抗人cd94抗体pe anti
‑
human cd94 anti body(hcd94)和抗鼠抗体apc rat igg2a,k isotype ctrl antibody(mcd94)识别染色后进行流式检测，检测结果如图12
‑
14所示。从图中可以看出，在c57bl/6小鼠体内检测到鼠nkg2a蛋白和cd94蛋白，未检测出人源化nkg2a蛋白和cd94蛋白；在nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠体内检测到人源化nkg2a/cd94蛋白，未检测到鼠nkg2a蛋白和cd94蛋白。
[0493]
更进一步对野生型c57bl/6小鼠和nkg2a/cd94人源化纯合子小鼠脾脏中的白细胞和t细胞免疫分型情况进行流式检测。脾脏中白细胞亚型和t细胞亚型检测结果分别如图15和图16所示，从图中可以看出，nkg2a/cd94基因人源化纯合子小鼠脾脏样本中t细胞、b细胞、nk细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、粒细胞(granulocyte)、dc细胞、巨噬细胞(macrophage)和单核细胞(monocyte)等白细胞亚型与c57bl/6野生型小鼠一致(图14)，cd4+t细胞、cd8+t
细胞和tregs细胞等t细胞亚型百分比与c57bl/6野生型小鼠一致(图15)，表明nkg2a/cd94基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞的分化、发育和在淋巴组织中的分布。
[0494]
以上结果表明，本实施例成功构建出可表达人源化nkg2a蛋白和人源化cd94蛋白的nkg2a/cd94基因人源化小鼠。
[0495]
此外，使用本发明制得的cd94和/或nkg2a基因人源化小鼠还可以制备三基因或多基因人源化小鼠。以三基因人源化nkg2a/cd94/pd
‑
1小鼠的生成为例。由于鼠pd
‑
1基因位于1号染色体上，可选择nkg2a/cd94双基因人源化小鼠与pd
‑
1基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到三基因人源化nkg2a/cd94/pd
‑
1小鼠。
[0496]
实施例4动物模型体内药效验证
[0497]
利用本发明制的nkg2a和/或cd94基因人源化小鼠构建肿瘤模型，可用于测试靶向人nkg2a和/或cd94的药物的药效。具体来说，选取实施例3制备的8周龄雌性nkg2a/cd94双基因人源化纯合子小鼠，皮下接种过表达人hla的小鼠结肠癌细胞b
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cag
‑
hhla
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e mc38(5
×
105个)，待肿瘤体积约100mm3后，按瘤体积分为对照组和治疗组(n＝5/组)。对照组注射pbs，治疗组注射抗人nkg2a抗体monalizumab(药物序列信息参见专利文本(公开号wo2016041945a1))。给药方式：腹腔注射(i.p.)，分组当天开始给药，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。具体分组和给药情况见表8。实验周期内小鼠体重情况、体重变化情况和肿瘤体积测量结果分别如图17、图18、图19所示。
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表8：分组及给药情况
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表9中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时、分组后11天、分组后第18天时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠情况、肿瘤(体积)抑制率(tumor growth inhibition value，tgitv)以及治疗组与对照组小鼠肿瘤体积的统计学差异(p值)。
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表9：肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率
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如图15
‑
17和表9所示，整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好，治疗组(g2组)与对照组相(g1)动物体重均呈增长趋势(图17和18)，且无显著差异(p>0.05)，表明动物对抗人nkg2a抗体monalizumab的耐受性良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。如图19和表9所示，从肿瘤体积结果上看，在实验各个时期，治疗组肿瘤体积均小于对照组，在第18天时，g2组小鼠肿瘤体积为1837
±
273mm3，与对照组2825
±
156mm3相比显著减小(p<0.05)，表明该剂量的monalizumab在nkg2a/cd94人源化动物中具有良好的肿瘤抑制效果。
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以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
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另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。