一种塞来昔布代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用与流程

1.本发明涉及一种塞来昔布代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。


背景技术：

2.塞来昔布是昔布类非甾体类抗炎药，通过特异性抑制环氧酶
‑
2而发挥解热、镇痛和抗炎作用，其不良反应涉及心血管系统、胃肠道、中枢神经系统和呼吸系统，如引起高血压、消化不良、头疼等。塞来昔布在肝脏中主要由cyp2c9代谢。建议携带cyp2c9低酶活性基因型的患者降低塞来昔布的用药剂量，从而降低药物不良反应的发生风险。
3.细胞色素氧化酶p450主要存在于肝脏、肠道，在药物代谢中占有重要地位。cyp2c9 是细胞色素氧化酶p450家族的重要成员，占肝微粒体p450蛋白总量的20％。该基因位于 10q24，编码的蛋白能羟化代谢许多不同性质的药物，主要是酸性底物。cyp2c9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均为治疗指数较窄的药物。cyp2c9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。 cyp2c9*3(a1075c，ile359leu)导致cyp2c9酶活性降低，cyp2c9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带cyp2c9*1或arg144/ile359等位基因)的 4～6％。cypc2c9*3的频率为3％。cyp2c9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异现象。
4.目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用arms引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以rpa扩增和焦磷酸测序技术为基础，获得一种塞来昔布代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。
6.为实现上述发明目的之一，本发明采用的塞来昔布代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
7.本发明的试剂盒针对cyp2c9*3基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、cyp2c9*3测序引物、阳性对照。
8.优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0009][0010]
优选的，所述cyp2c9*3的特异性引物组序列如序列表seq id no:1～seq id no:2 所示。
[0011]
优选的，所述的cyp2c9*3测序引物如序列表seq id no:3所示。
[0012]
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。
[0013]
更优选的，所述的测序引物，为琼脂糖凝胶颗粒与氨基标记的pna序列的结合物，该结合物与dna结合较dna/dna的结合更为稳定且特异性高于dna/dna的捕获，且不受盐离子浓度的影响。可既充当测序引物又作为捕获探针，与扩增的产物结合以后，经过简单洗涤即可直接用于测序反应。
[0014]
优选的，cyp2c9*3测序引物对应的测序区域为cyp2c9*3待检序列，如序列表seq idno:4所示。
[0015]
优选的，cyp2c9*3待检序列对应cyp2c9*3分配指令如序列表seq id no:5所示。
[0016]
优选的，所述的试剂1包括：扩增缓冲液，18mm醋酸镁；
[0017]
优选的，所述的试剂2包括：cyp2c9*3前引物，cyp2c9*3后引物，dntps、链置换 dna聚合酶，单链dna结合蛋白，结合单链核酸的重组酶，海藻糖；可在恒温条件下进行cyp2c9*3扩增。
[0018]
更优选的，试剂2各组分浓度分别为：cyp2c9*3前引物(0.32um)，cyp2c9*3后引物(0.32um)，dntps(0.3mm)、链置换dna聚合酶(1.2ng/μl)，单链dna结合蛋白 (3.2ng/μl)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μl)，海藻糖(0.2％)。
[0019]
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的cyp2c9*3杂合型基因组dna。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0020]
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的塞来昔布不良反应的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0021]
a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组dna，采用rpa扩增进行扩增；
[0022]
b.将10ul反应产物与3ul测序引物分别进行结合；
[0023]
c.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
[0024]
d.取一个dntp排管，自圆滑一端向平端依次加入datpαs、dttp、dgtp、dctp；
[0025]
将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
[0026]
e.焦磷酸测序；
[0027]
f.确定cyp2c9*3位点塞来昔布位点的基因型。
[0028]
优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：39℃25min。
[0029]
本发明还公开了一种用于塞来昔布不良反应预测的试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒对cyp2c9*3进行检测，以从基因层面指导塞来昔布不良反应预测。
[0030]
重组酶聚合酶扩增(rpa)，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白
‑
dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在二十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
[0031]
与现有技术相比，本发明通过rpa扩增cyp2c9*3快速、有效地在恒定温度下产生大量扩增产物。通过直接与羧基修饰素结合的氨基标记单链dna类似物特异捕获单链dna，洗涤后，加入测序引物与模板dna退火后，加入测序原料进行焦磷酸测序。本发明以rpa 扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对塞来昔布不良反应相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测cyp2c9*3基因多态性塞来昔布不良反应预测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
[0032]
图1是本发明提供的cyp2c9*1*1型测序结果示例图；
[0033]
图2是本发明提供的cyp2c9*1*3型测序结果示例图；
[0034]
图3是本发明提供的cyp2c9*3*3型测序结果示例图；
[0035]
图4是本发明提供的塞来昔布血药浓度与cyp2c9基因位点的关系图。
具体实施方式
[0036]
下面结合实施例对本发明提供的塞来昔布代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0037]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0038]
实施例1、试剂盒的制备
[0039]
本发明的试剂盒针对cyp2c9*3设计了特异性扩增引物和测序引物，用于恒温扩增和焦磷酸测序检测。基于重组酶聚合酶扩增技术设计引物是本发明的关键之一，该技术的引物设计无法辅助软件进行，只能依靠人工设计。为保证扩增速度及检测灵敏度，引物长度应控制在30～35bp，引物设计过短易增加非特异性扩增导致假阳性，若设计过长易导致无法进行扩增。基因多态性序列以genebank内的公开序列为准。
[0040]
(一)本实施例的引物序列如下：
[0041][0042]
(二)本实施例的检测试剂盒包括如下组分：
[0043][0044][0045]
(三)本实施例的检测试剂盒试剂1单人份配置体系如下：
[0046]
成分体积(ul)扩增缓冲液18.8300mm醋酸镁1.2
[0047]
(四)本实施例的检测试剂盒试剂2单人份配置体系如下：
[0048]
试剂2各组分浓度分别为：cyp2c9*3前引物(0.32um)，cyp2c9*3后引物(0.32um)，，dntps(0.3mm)、链置换dna聚合酶(1.2ng/μl)，单链dna结合蛋白(3.2ng/μl)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μl)，海藻糖(0.2％)；
[0049][0050]
配置完成后98ul/管进行分装、冻干。
[0051]
(五)本实施例的检测试剂盒测序引物制备过程如下：
[0052]
(1)mes溶液配置
[0053]
①
100mm mes,ph 4.8(100ml)：
[0054]
②
2.13g mes(2
‑
[n
‑
morpholino]ethane sulfonic acid,mw 213.25).
[0055]
③
ph 4.8
[0056]
(2)tt buffer(50ml)配置
[0057]
①
12.5ml of 1m tris buffer ph 8
[0058]
②
50ul 10％
‑
20
[0059][0060]
(3)测序引物制备
[0061]
①
取500ul磁珠，吸磁1min，去上清；
[0062]
②
取1000ml 100mes溶液洗涤吸磁1min，去上清，重复洗涤2次；
[0063]
③
取10mg/ml eds和10mg/ml nhs各500ul，加入捕获引物10ul。
[0064]
④
25℃杂家30min
[0065]
⑤
取1000ml封闭液混合均匀，吸磁1min，去上清；
[0066]
⑥
取1000ml tt buffer混合均匀，吸磁1min，去上清；重复洗涤3次；
[0067]
⑦
加入1ml te缓冲液溶解。
[0068]
实施例2、焦磷酸检测
[0069]
本发明中采用的仪器如下：恒温仪；
[0070]
焦磷酸测序仪：武汉菲思特生物科技有限公司。
[0071]
(1)试剂准备(试剂准备室)
[0072]
提前将试剂取出，并将试剂1涡旋振荡15秒，低速离心待用。直接向试剂2(冻干)中加入440ul试剂1，涡旋振荡15秒充分混匀。确定反应数n，n＝待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次pcr实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μl/管分装至pcr反应管中。
[0073]
(2)加样检测(样本制备间)
[0074]
将样本dna、阳性对照和空白对照按5μl加样量加入到pcr反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行pcr扩增反应。
[0075]
(3)pcr扩增(扩增间)
[0076]
采用pcr仪进行扩增，反应体系为25μl，扩增条件：
[0077]
扩增温度时间循环数39℃25min1
[0078]
(4)焦磷酸测序
[0079]
1)在pcr反应管中加入结合液40μl和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入pcr产物10μl，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和pcr产物充分结合；
[0080]
2)向ep管中加入150ul洗涤缓冲液，7000g离心1min，弃上清；
[0081]
3)测序管中分别加入3ul测序酶和3ul测序底物；
[0082]
4)取一个dntp排管，自圆滑一端向平端依次加入20μldatpαs、20μl dttp、20μl dgtp、20μl dctp。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
[0083]
5)焦磷酸测序，测序结果如图1～3所示。
[0084]
(5)结果判读
[0085]
1)有效性判定：
[0086]
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为cyp2c9*1*3型。
[0087]
2)结果判定标准
[0088]
cyp2c9*3的dna测序峰值图中，
[0089]
a的频率≧90％，c的频率≦10％，即为*1*1型；
[0090]
40％≦a的频率≦60％，40％≦c的频率≦60％，即为*1*3型；
[0091]
c的频率≧90％，a的频率≦10％，即为*3*3型；
[0092]
实施例3、基因检测结果与药物不良反应及心血管疾病的相关性
[0093]
一组139名不同cyp2c9基因型的受试者，96名cyp2c9*1*1型，34名cyp2c9*1*3 型，9名cyp2c9*3*3型。每个受试者接受单次口服剂量为200毫克塞来昔布和240毫升水。给药前受试者维持空腹状态4h。在给药后分别在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、 24、36、48和96h小时采集静脉血样。采用高效液相色谱
‑
串联质谱(hplc
‑
ms/ms)系统测定塞来昔布及其羧酸代谢物的血浆浓度。结果显示cyp2c9*3等位基因的携带者塞来昔布的血浆浓度高于cyp2c9*1等位基因。塞来昔布血药浓度与cyp2c9基因位点的关系如图 4所示。
[0094]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。