一种增强水性抗体制剂稳定性的方法及其应用与流程

本发明涉及药物制备领域，特别是一种降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白(hcp)含量的亲和纯化工艺方法。

背景技术：

1、生物医药技术是当今医药工艺发展的核心力量。以单克隆抗体类药物为典型代表的生物制品是治疗恶性肿瘤、自身免疫病以及病毒感染等疾病的重要药物种类。抗体药物生产过程中纯化工艺非常关键，发酵产物中通常含有大量杂质，其中hcp的去除最为核心。在中国仓鼠卵巢细胞(cho)等基因工程细胞株大批量发酵过程中，细胞在不同的生理周期会有凋亡裂解，释放宿主细胞蛋白(host cell protein，hcp)。hcp是指来源于宿主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和转化蛋白(细胞分泌的促生长蛋白)。hcp不仅有可能诱导机体产生抗hcp 抗体，引起过敏反应，还有可能有“佐剂效应”引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果。

2、我们前期的发现微量hcp能导致药物制剂中聚山梨酯(又名：吐温)的降解。聚山梨酯，例如聚山梨酯20和80，是生物制药中常用的表面活性剂，它们可以改善蛋白质药物制剂的稳定性，并在其长期储存和运输过程中防止蛋白质产生聚集和变性，从而阻止蛋白质制剂药品质量的下降。然而聚山梨酯在一定条件下容易发生水解，造成蛋白质聚集，引起药品质量的下降。聚山梨酯的水解机理已经被行业广泛的研究，除了酸和碱的诱导水解外，残留在蛋白质制剂中微量 hcp是最主要的造成聚山梨酯水解的原因。因此蛋白药物的纯化工艺对hcp的去除提出了更高的要求。基于上述的原因，在大规模应用且经济可行的工艺条件下，开发出一种能够使hcp含量降低到1ppm以下，同时需要将导致聚山梨酯降解的一类hcp去除的纯化工艺，变得极其重要。

3、生产抗体药物的主要目的是为了获得纯度高的单克隆抗体分子，通过蛋白纯化方法，在提高单抗分子回收率的同时提高纯度。例如，专利cn105017418a公开的抗体纯化方法包括：1)亲和层析；2)调节亲和层析洗脱液的ph值至3.3- 3.8，进行病毒灭活；3)调节ph值至弱酸性，进行深层过滤；4)阴离子交换层析；5)阳离子交换层析。专利cn107793469a提供一种去除hcp含量的亲和纯化工艺，通过将改变淋洗步骤2的ph，通过加入氯化钠、氯化钙、盐酸精氨酸中的至少一种，作为淋洗2过程中的添加剂，降低hcp、目的蛋白及填料基质间的相互作用，从而起到去除hcp的作用。

4、上述现有技术均是以去除hcp、获得纯度高的抗体分子为目标，不能有效解决工业化生产中面临抗体分子纯度与回收率的矛盾。本发明分析了目前通用的抗体纯化工艺为protein a亲和层析，低ph孵育与深层过滤，阴离子层析、阳离子层析，纳滤和超滤的各个步骤和具体的操作方法。对hcp的去除能力，protein a亲和层析和阴离子层析为基础，去除能力较强，是hcp去除的主要步骤，低 ph孵育与深层过滤能有效降低hcp中酯酶活性，阳离子层析则主要作为后续 hcp的进一步再去除工艺，纳滤和超滤对hcp的去除能力有限。本发明专利是在通用纯化工艺基础上，充分研究了hcp残留的生物活性以及对抗体制剂的影响，通过优化工艺条件，调整控制参数，进一步降低hcp的含量，同时以酯酶活性为指标进行条件优化好选择消除了能够降解抗体制剂中聚山梨酯的hcp活性。

技术实现思路

1、为解决现有技术中以抗体纯度为指标的纯化方法难以工业化的技术问题，本发明针对影响水性抗体制剂组分和临床安全性的因素进行分析，通过酯酶活性和抗体纯度两个指标为依据进行方法优化和参数选择。通过在重组抗体纯化过程中去除hcp的酯酶活性、消除对聚山梨酯的降解，从而增强水性抗体制剂的组分稳定性。本发明所述方法能够减少水性抗体制剂不希望的降解产物的形成、增强抗体制剂的储存稳定性。

2、具体而言：

3、一方面，本发明提供一种增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于以含有目的抗体分子的重组细胞发酵液为对象纯化目的抗体分子的方法中，降低hcp 含量及其酯酶活性、消除其对聚山梨酯的降解。

4、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于纯化后目的抗体分子中hcp的含量不高于1ppm，hcp的酯酶活性经低ph孵育灭活。

5、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述纯化目的抗体分子的方法包括：具有中间洗脱步骤的亲和层析、低ph孵育灭活、阴离子交换层析、阳离子交换层析。

6、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析过程中采用含有0.2m盐酸精氨酸的中间洗涤液。

7、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析方法中，采用ph 6.8的柱平衡液、上样后平衡液和中间洗涤液，采用ph 3.1的洗脱液。

8、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述低ph 孵育灭活包括使用1m枸橼酸调节亲和层析洗脱液的ph值至3.3-3.5。

9、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述的阴离子交换层析，其上样ph为8.0±0.2，cond值为2-5ms/cm，载量不超过60 mg/ml。

10、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析方法中，

11、柱平衡液为：0.15m nacl，0.02m磷酸盐缓冲液，ph 6.8；

12、上样后平衡液为：0.15m nacl，0.02m磷酸盐缓冲液，ph 6.8；

13、中间洗涤液为：0.15m nacl，0.02m磷酸盐，0.2m盐酸精氨酸缓冲液， ph6.8；

14、洗脱液为：0.0175m na2hpo4-柠檬酸缓冲液，ph3.1。

15、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述低 ph孵育灭活，在室温孵育60-90min进行病毒和酯酶灭活；调ph至弱酸性 (ph5.3-5.5)利用深层过滤膜包过滤去除沉淀。

16、进一步，本发明所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析方法中，

17、层析柱冲洗液为：0.02m tris-hcl，1m nacl缓冲液，ph 8.0；

18、上样样品ph为8.0±0.2，cond值为2-5ms/cm，载量不超过60mg/ml。

19、层析柱上样后平衡液为：0.02m tris-hcl，0.04m nacl缓冲液，ph 8.0。

20、另一方面，本发明提供增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述抗体为地舒单抗。

21、另一方面，本发明提供增强水性抗体制剂稳定性的方法在制备抗体药物中的应用。

22、为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

23、术语“地舒单抗”是一种全人源的抗核因子-κb受体活化因子配体(ligand ofreceptor activator of nuclear factor-kappa b,rankl)的单克隆抗体(igg2)，由 2条轻链(κ链)和2条重链(γ2链)组成的igg2抗体，完整的分子量约147.7kda。每个轻链有215个氨基酸残基，每个重链有448个氨基酸残基。

24、术语“宿主细胞”涵盖植物细胞和动物细胞。动物细胞涵盖无脊椎动物、非哺乳动物脊椎动物(例如，鸟类、爬行类和两栖类)和哺乳动物细胞。无脊椎动物细胞的例子包括下列昆虫细胞：草地夜蛾(spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(aedes aegypti)(蚊)、白纹伊蚊(aedes albopictus)(蚊)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)(果蝇)、和家蚕(bombyx mori)(参见例如 luckow，v.a.等，bio/technology 6(1988)47-55；miller，d.w.等，genetic engineering，setlow，j.k.等(编)，第8卷，plenum publishing(1986)，第277页-第298页；及maeda，s.等，nature 315(1985)592-594)。

25、术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即ch1、ch2和ch3。各轻链由轻链可变区(简称vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和 vl区还可以划分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其由较为保守的框架区(fr)区分隔开。各vh和vl由三个cdr以及四个fr构成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(c1q)。

26、术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

27、本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1构成的单价片段；(ii)f (ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由 vh和ch1构成的fd片段；(iv)由抗体单臂vl和vh构成的fv片段；(v) 由vh构成的dab片段(ward et al.，(1989)nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fc(scfv)；参见例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；and huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。这些单链抗体也包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

28、本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合抗原的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv片段、单链fv(scfv)片段和单结构域片段。

29、fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在f(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。fab和f(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(fc) 区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，wahl等人，1983，j.nucl.med.24:316)。

30、如本领域通常理解的，“fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为ch2和ch3结构域)。igm和ige fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(ch2、ch3和 ch4结构域)。

31、术语“亲和层析”表示使用“亲和层析材料”的层析方法。在亲和层析中，基于其生物学活性或化学结构(其依赖静电相互作用的形成、疏水键和/或与层析官能团的氢键形成)分离多肽。为了从亲和层析材料中回收特异性结合的多肽，加入竞争配体或改变层析条件，如缓冲液的ph值、极性或离子强度。

32、“亲和层析材料”是包含复杂层析官能团的层析材料，其中复杂层析官能团组合了不同单个层析官能团以结合特定类型多肽。该层析材料根据其层析官能团的特异性特异地结合特定类型的多肽。示例性“亲和层析材料”是“金属螯合层析材料”，如含ni(ii)-nta或cu(ii)-nta的材料，用于结合含有六组氨酸标签的融合多肽，或具有许多表面暴露组氨酸、半胱氨酸和/或色氨酸残基的多肽，或“抗体结合层析材料”如a蛋白，或“酶结合层析材料”，如包含酶底物类似物、酶辅因子或酶抑制剂作为层析官能团的层析材料，或“凝集素结合层析材料”，如包含多糖、细胞表面受体、糖蛋白或完整细胞作为层析官能团的层析材料。

33、术语“阴离子交换层析”是指其中固相带正电(例如具有与其附接的一个或多个带正电荷的配体，例如季铵基基团)的层析。市售的阴离子交换基质包括deae 纤维素、qaesephadextm、fast q sepharosetm capto q和capto q impres(ge healthcare)、unosphere和nuviaq(biorad)、gigacapq(tosoh)、mustang q xt(pall)、fractogel q和eshmuno q(merck millipore)和阴离子交换膜吸附器如sartobind q(sartorius)、以及整体式吸附器，例如qa整体式(bia separations)。

34、术语“阳离子交换层析”，填充介质带负电荷并且具有可以与通过或穿过固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。可通过将一种以上带电配体连接至固相 (例如通过共价连接)来提供负电荷。替代地或另外地，电荷可为固相的固有性质(例如，二氧化硅具有整体负电荷)。阳离子交换基质(例如，cex树脂)可被放置或填充到用于纯化蛋白质的色谱柱中。cex是去除高分子量(hmw)蛋白质类以及宿主细胞蛋白质、dna和残留蛋白a的有效步骤(zeid等(2008)， biotechnology and bioengineering 102，971-976；yigzaw，y.等(2009)，current pharmaceutical biotechnology 10，421-426；gagnon，p.，purificationtools for monoclonal antibodies(单克隆抗体的纯化工具)，1996：validatedbiosystems， inc.；stein，a.和kiesewetter，a.(2007)，journal ofchromatography b848，151- 158；staby，a.等(2006)，journal of chromatography 1118，168-179)。通常，cex以结合-洗脱模式(bem，bind-and-elute mode)操作，其中，在低于目标分子的pi的ph下，在低电导率条件下，蛋白质结合至cex基质(例如，cex树脂)。然后通常通过增加电导率和/或诱导ph变化，来实现结合蛋白的洗脱。这可通过线性梯度或逐步洗脱至预定条件来进行。通常杂质(特别是hmw类)比 mab产物结合得更紧，并且可通过调整洗脱条件和合并液收集标准，从主要所需馏分中分离出杂质(yigzaw，y.等(2009)，同上；gagnon，p等(1996)，同上；pabst，t.m.等(2009)，journal of chromatography 1216，7950-7956)。

35、术语“结合亲和力”在本文中用作为两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原) 之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。经由单价相互作用的两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间的结合亲和力，可通过测定解离常数(kd)来定量测定。继而，可通过对复合物形成和解离动力学的测量，例如通过spr方法，来测定kd。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数，被分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数 kd(或koff)。kd通过等式kd＝kd/ka与ka和kd相联系。根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的kd值进行比较。类似地，可通过测定，并比较感兴趣的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的 kd值与不感兴趣的相互作用的kd值，来评价相互作用的特异性。通过众所周知的方法可直接测定该解离常数的值，例如，通过评价配体(例如抗体)对靶的结合能力的标准测定是本领域已知的，并包括例如elisa、蛋白质印迹、ria和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准测定，例如spr，还可评价抗体的结合动力学和结合亲和力。可进行竞争性结合测定，其中，将抗体与靶的结合，和该靶的另外的配体(例如另外的抗体)与该靶结合，进行比较。

36、本发明为了解决抗体生产中hcp含量较高，酯酶活性较强的问题，而公开了一种抗体纯化生产中显著降低cho中hcp含量的方法，且消除微量hcp中酯酶活性，可以广泛适用于抗体纯化工艺中，且所使用的材料成本价格较低，易于工艺放大。在本发明中，主要通过抗体亲和层析中间预洗脱来有效降低hcp 含量，低ph孵育降低酯酶活性，酸性条件下深层过滤吸附hcp，低载量低电导值阴离子层析进一步吸附hcp等工艺方法，满足抗体药物的大规模高质量纯化制备要求且hcp含量控制在1ppm以下，保证抗体药物的临床使用的安全稳定有效。

37、为了达到本发明中的目的主要采取以下措施：

38、1.亲和层析。发酵液进行亲和层析，亲和介质包括但不限于proteina、proteing、protein l等可同抗体特异性结合的配基交联到琼脂糖、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃等基质上的层析介质，优选基质为琼脂糖。优选的亲和填料有cytiva 的mabselect sure、mabselectsure lx和prism a，merck的eshmunoa，纳微科技的unimabproteina等。优选的亲和介质配基为protein a或在protein a基础上做结构优化的配基。层析步骤如下：

39、1.1上样：上样缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液等，优选为磷酸盐缓冲液或tris-盐酸缓冲液，更优选的可在缓冲液中加入nacl或na2so4 来降低非抗体蛋白同proteina填料间的非特异性吸附，所述磷酸盐缓冲液的盐浓度为5mm-0.15m之间，优选的为10mm-50mm之间，更优选的是20mm； ph为5.5-8.0之间；优选的为6.5-7.5之间，更优选的是7.0，nacl或na2so4的浓度优选为0-250mm，更优选的可为150mm

40、1.2中间洗涤：中间洗涤缓冲液包括但不限于以下缓冲液中的一种或几种的组合：1)中性缓冲液体系，例如：磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸等；2) 酸性的缓冲液体系：柠檬酸-磷酸氢二钠、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸三钠等。中间洗涤缓冲液中添加活性试剂，包括但不限于精氨酸、聚山梨酯、尿素、异丙醇、丙二醇、乙二醇、四甲基氯化铵等，优先的为盐酸精氨酸，精氨酸的浓度在 0.1-0.5m之间，优选的是0.1-0.3m之间，更优选的是0.2m。所述中间预洗涤缓冲液的ph为5.0-8.0之间，优选的是7.2。

41、1.3终洗脱：洗脱缓冲液包括但不限于以下缓冲液中的一种或几种的组合：柠檬酸、gly-盐酸及醋酸缓冲液等，ph范围从2.0-7.0，优选的ph为3.0-4.0。洗脱缓冲液的浓度范围为5-100mm，优选的为20-50mm。洗脱后可将亲和介质再生，再生缓冲液包括但不限于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、盐酸、甘氨酸、 naoh，优先为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液及naoh溶液。

42、2.低ph孵育，和所述方法灭活病毒，同时降低酯酶活性。

43、2.1降低中间样品ph到3.0-4.0；其中，所述低ph孵育的ph值为3.0- 4.0，使用枸橼酸、醋酸及盐酸等酸性溶液调节ph。所述低ph孵育调节ph到 3.1-3.8，较佳地为3.2-3.6，更佳地为3.3±0.1、3.4±0.1、3.5±0.1、3.6±0.1。

44、2.2低ph孵育时长，所述ph孵育进行的时间为0.5-2小时，较佳地为1-1.5 小时。灭活完成后用碱性溶液将样品ph调至5-6，所述的碱性溶液包括tris溶液、醋酸钠溶液、枸橼酸钠。

45、2.3深层过滤：低ph孵育后将样品进行深层过滤，深层膜包包括不限于默克x0hc，过滤前用注射用水冲洗深层过滤膜，冲洗体积不少于100l/m2。过滤速度不超过10l/min,压力不超过2bar，过滤后将样品调节ph到8.0，电导不超过5ms/cm。

46、3.阴离子交换层析

47、所用填料介质为q sepharose fast flow保留时间≥4min。先用再生缓冲液冲洗层析柱1-2倍柱体积(0.02m tris-hcl缓冲液+1m氯化钠，ph 8.0)、然后用平衡缓冲液平衡层析柱5-8倍柱体积(0.02m tris-hcl，0.04m nacl缓冲液， ph 8.0)、上样(ph为8.0±0.2，cond值为2-5ms/cm，载量不超过60mg/ml)，上样过程填料吸附hcp，收集流穿样品、再平衡2-4倍柱体积(0.02m tris-hcl， 0.04m nacl缓冲液，ph 8.0)。另一种优选例为填料载量为不超过60g/l。

48、4.阳离子交换层析

49、原理是基于带相反电荷分子间的相互吸引力，本产品阳离子交换层析使用的填料型号为sp sepharose fast flow(ge)，其功能基团为：–o–

50、ch2chohch2och2ch2ch2so3-，而蛋白质表面所带的电荷取决于其pi和环境ph，本产品等电点在8.0，阴离子交换层析后将样品用1m枸橼酸溶液调节ph值至5.2-5.4，其ph低于pi，使目标蛋白分子本身带正电荷，在上样时目标蛋白可与阳离子层析填料上带负电荷的基团结合，从而使目标蛋白与其他不被填料吸附或在后续淋洗步骤可以分离开的hcp分离。

51、阳离子层析(sp fastflow)，层析过程保留时间5min。0.5m氢氧化钠溶液清洗层析填料(接触时间不小于30min)、冲洗层析柱1-3倍柱体积(0.051m na2hpo4-柠檬酸，0.5mnacl，ph5.1)，平衡层析柱2-4倍柱体积(0.051m na2hpo4-柠檬酸，ph5.3)、上样(将阴离子层析洗脱后收集样品用1m柠檬酸溶液调节ph值至5.2-5.4，平衡2-4倍柱体积(0.051mna2hpo4-柠檬酸，0.5m nacl，ph5.1)、用5-7倍柱体积的22％洗脱液1(0.051m na2hpo4-柠檬酸， 0.5m nacl，ph5.1)，78％洗脱液2(0.051m na2hpo4-柠檬酸，ph5.3)洗脱目的蛋白，当a280处紫外吸收上升至0.1au时开始收集目标组分，当a280 处紫外吸收下降至0.3au时结束收集。

52、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

53、1、与传统的以目的抗体纯度为指标进行条件优化的构思不同，本发明针对影响水性抗体制剂组分和临床安全性的因素进行分析，通过hcp含量及其酯酶活性和抗体纯度两个指标为依据进行方法优化和参数选择，优化的抗体制备方法能够兼顾产量。

54、2、本发明基于抗体制剂中通常含有聚山梨酯、长期储存的抗体制剂中发现聚山梨酯降解产物、以及微量hcp存在聚山梨酯降解活性的发现，结合现有技术中通用的抗体纯化方法，提出了能够提高抗体制剂稳定性的技术方案。

55、3、本发明所述提高抗体稳定制剂的方法获得的抗体制剂批间稳定性高，不仅消除了hcp的酯酶活性，而且还进一步将hcp的含量降低至1ppm以下。