一种重组火鸡疱疹病毒及其制备方法和应用

1.本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及利用crispr-cas9技术构建重组火鸡疱疹病毒株，重组病毒可以作为疫苗提供良好的保护作用。


背景技术：

2.crispr-cas9系统作为最近兴起的基因编辑技术，除了在高效产生基因工程细胞和动物模型的方面取得了巨大的成功，还被用于编辑多种大型dna病毒的基因组，包括单纯疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病毒、痘病毒、豚鼠巨细胞病毒和鸭肠炎病毒。
3.火鸡疱疹病毒(hvt)已经广泛用作表达多种禽病异源抗原的疫苗载体，这些疫苗对马立克氏病病毒(mdv)和插入载体中的基因所属病毒提供了良好和持久的免疫效果。然而这些重组hvt疫苗主要产生于病毒感染细胞中的常规同源重组，或者通过在克隆全长基因组的细菌人工染色体(bac)中的重组生成，这些方法产生重组病毒的效率较低，因此使用这些方法产生重组疫苗十分耗时。而利用crispr-cas9系统可以高效编辑禽疱疹病毒基因组，快速产生重组病毒，具有广阔的技术应用前景。
4.hvt可供外源基因插入的位点目前已报道的有us2、us10、ul45/46、hvt065/066、tk等，发现新的hvt表达外源基因的位点，并基于现有插入位点构建插入多种外源基因的hvt活载体疫苗，可以实现一苗多防，具有广阔的市场前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一个火鸡疱疹病毒插入外源基因的位点hvt005/hvt006。
6.本发明一个方面提供了一种重组火鸡疱疹病毒，在火鸡疱疹病毒基因组的hvt005区和hvt006区之间的间隔区中插入外源基因，所述外源基因选自来自鸡新城疫病毒、禽流感病毒或禽传染性囊病病毒的基因；
7.进一步地，所述禽流感病毒选自h9n2亚型禽流感病毒、h5n1亚型禽流感病毒、h7n7亚型禽流感病毒、h5n2亚型禽流感病毒、h7n2亚型禽流感病毒、h9n1亚型禽流感病毒；所述新城疫病毒选自vii型鸡新城疫病毒、ii型鸡新城疫病毒、iii型鸡新城疫病毒；
8.进一步地，所述外源基因选自鸡新城疫病毒f基因、禽流感病毒的ha基因、禽传染性囊病病毒的vp2基因。
9.进一步地，所述火鸡疱疹病毒基因组的hvt005区和hvt006区之间的间隔区为火鸡疱疹病毒8867nt-9319nt之间，优选地，其核苷酸序列为seq id no:1。
10.进一步地，所述鸡新城疫病毒f基因为vii型鸡新城疫病毒f基因完整的开放阅读框，其裂解位点更换成鸡新城疫活疫苗(la sota株)的裂解位点。
11.进一步地，鸡新城疫病毒f基因核苷酸序列为seq id no:2。
12.进一步地，所述鸡新城疫病毒f基因的表达盒由mcmv启动子、鸡新城疫病毒f基因和sv40 poly a依次连接而成。
13.进一步地，所述的禽流感病毒的ha基因为h9n2亚型禽流感病毒ha基因完整的开放
阅读框。
14.进一步地，h9n2亚型禽流感病毒ha基因的核苷酸序列为seq id no:3。
15.进一步地，h9n2亚型禽流感病毒ha基因的表达盒由mcmv启动子、外源基因和sv40poly a依次连接而成。
16.本发明另一个方面提供了上述重组火鸡疱疹病毒的制备方法，其包括以下步骤：
17.s1)构建crispr-cas9质粒：
18.s1-1)针对hvt005区和hvt006区之间的间隔区设计sgrna序列，sgrna序列如seq id no.7所示，tcatatactgaatcgtaggg seq id no.7；
19.s1-2)根据设计的sgrna序列合成正链hvt005/006-sgrna-f和负链hvt005/006-sgrna-r，退火形成dsdna后插入载体中获得crispr-cas9质粒；
20.正链hvt005/006-sgrna-f和负链hvt005/006-sgrna-r序列如下seq id no.8和seq id no.9所示。
[0021][0022]
s2)构建供体载体质粒，所述供体载体质粒中包含外源基因表达盒；
[0023]
s3)构建重组火鸡疱疹病毒和纯化：px459-sga质粒、crispr-cas9质粒和供体载体质粒共转染于原代鸡胚成纤维细胞中，然后接种火鸡疱疹病毒，培养至细胞病变；纯化得到初级重组火鸡疱疹病毒；
[0024]
s4)去除步骤s3)所得初级重组火鸡疱疹病毒中的gfp，获得重组火鸡疱疹病毒。
[0025]
进一步地，步骤s2)包括以下步骤：
[0026]
s2-1)将外源基因插入pcdna3.1-sfii载体中，获得pcdna3.1-sfii-外源基因载体；
[0027]
s2-2)将pcdna3.1-sfii-外源基因载体中的外源基因表达盒通过sfii酶切位点连入pt-sga-gfp载体中，获得pt-sga-gfp-外源基因载体。
[0028]
进一步地，步骤s4)包括以下步骤：pcdna3.1-cre质粒转染于原代鸡胚成纤维细胞中，接种步骤s3)所得初级重组火鸡疱疹病毒，培养至细胞病变，经过病毒挑斑纯化，得到重组病毒rhvt-外源基因。
[0029]
本发明另一个方面提供了上述重组火鸡疱疹病毒在制备用于预防禽流感和/或鸡新城疫和/或禽传染性囊病的疫苗中的应用。
[0030]
本发明另一个方面提供了一种预防禽流感和/或鸡新城疫和/或禽传染性囊病的疫苗，其含上述重组火鸡疱疹病毒。
[0031]
本发明再一个方面提供了一种在火鸡疱疹病毒插入外源基因的方法，所述方法包含利用crispr-cas9技术，将外源基因插入到火鸡疱疹病毒的基因组中；
[0032]
所述外源基因插入到火鸡疱疹病毒的基因组hvt005区和hvt006区的间隔区；
[0033]
进一步地，所述的插入位点位于hvt基因组hvt005-hvt006间隔区的8867nt-9319nt之间，其核苷酸序列为seq id no:1；
[0034]
进一步地，所述crispr-cas9技术为通过构建crispr-cas9质粒实现：
[0035]
s1-1)针对hvt005区和hvt006区之间的间隔区设计sgrna序列，sgrna序列如seq id no.7所示，tcatatactgaatcgtaggg seq id no.7；
[0036]
s1-2)根据设计的sgrna序列合成正链hvt005/006-sgrna-f和负链hvt005/006-sgrna-r，退火形成dsdna后插入载体中获得crispr-cas9质粒；
[0037]
正链hvt005/006-sgrna-f和负链hvt005/006-sgrna-r序列如下seq id no.8和seq id no.9所示。
[0038][0039]
本发明提供一个在火鸡疱疹病毒(hvt)基因组中插入外源基因的位点，即将外源基因插入火鸡疱疹病毒基因组的hvt005区和hvt006区的间隔区。更具体的，所述的插入位点位于hvt基因组hvt005-hvt006间隔区的8867nt-9319nt之间，其核苷酸序列为seq id no:1。
[0040]
本发明提供基于crispr/cas9靶向hvt005-hvt006间隔区的sgrna向导序列hvt005/006-sgrna。
[0041]
hvt005/006-sgrna:tcatatactgaatcgtaggg
[0042]
本发明所述的f基因为基因vii型鸡新城疫病毒f基因完整的开放阅读框，其裂解位点更换成鸡新城疫活疫苗(la sota株)的裂解位点。其核苷酸序列为seq id no:2。所述的f基因表达盒由mcmv启动子、外源基因和sv40 poly a依次连接而成。
[0043]
本发明所述的ha基因为h9n2亚型禽流感病毒ha基因完整的开放阅读框，其核苷酸序列为seq id no:3。所述的ha基因表达盒由mcmv启动子、外源基因和sv40 poly a依次连接而成。
[0044]
所述的mcmv启动子为鼠源mcmv启动子，其核苷酸序列如seq id no:4所示。所述的sv40 poly a的核苷酸序列如seq id no:5所示。
[0045]
一种表达ndv f蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，为利用crispr-cas9技术，将外源基因插入到火鸡疱疹病毒(hvt)的基因组中，经过筛选和纯化获得重组病毒，即所述表达ndv f蛋白的重组火鸡疱疹病毒。
[0046]
所述的表达ndv f蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，具体包括如下步骤：
[0047]
(1)crispr-cas9质粒px330-hvt05/06-sgrna的构建
[0048]
①
针对hvt005/006靶位点设计和合成sgrna序列。具体序列为：hvt005/006-sgrna:tcatatactgaatcgtaggg
[0049]
②
将合成后的hvt005/006-sgrna-f和hvt005/006-sgrna-r序列退火形成dsdna后插入px330载体(购自优宝生物)中，构建成px330-hvt05/06-sgrna。
[0050]
(2)供体载体pt-sga-gfp-f的构建
[0051]
①
将f基因片段插入pcdna3.1-sfii载体(见实施例2.2.2.1)中，获得pcdna3.1-sfii-f载体。
[0052]
②
将pcdna3.1-sfii-f载体中的f基因表达盒通过sfii酶切位点连入pt-sga-gfp载体中(见实施例2.2.3)，获得pt-sga-gfp-f载体。
[0053]
(3)构建和纯化重组火鸡疱疹病毒rhvt-f
[0054]
①
px459-sga质粒(见实施例1.1)、pt-sga-gfp-f质粒(见实施例2.2)和px330-hvt005/006-sgrna质粒(见实施例2.1)共转染于原代鸡胚成纤维细胞(cef)中，接种火鸡疱疹病毒hvt fc126株，然后在37℃条件下培养至细胞病变，经过病毒挑斑纯化，得到重组病毒rhvt-gfp-f；
[0055]
②
pcdna3.1-cre(购自优宝生物)质粒转染于原代鸡胚成纤维细胞(cef)中，接种重组病毒rhvt-gfp-f，然后在37℃条件下培养至细胞病变，经过病毒挑斑纯化，得到重组病毒rhvt-f，即为所述的表达ndv f蛋白的重组火鸡疱疹病毒。
[0056]
一种表达aiv ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，同一种表达ndv f蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，只是f基因替换为ha基因。其他病原相关保护性抗原基因也可以按照同样方法进行构建。
[0057]
有益效果
[0058]
1.本发明首次发现hvt005-hvt006间隔区可作hvt外源基因插入的位点。利用crispr/cas9技术在hvt基因组hvt005-hvt006间隔区插入ndv f基因和aiv ha基因，可作为鸡新城疫预防和禽流感预防的疫苗候选株。
[0059]
2.crispr/cas9基因敲入技术相比普通同源重组、bac同源重组等技术手段更为有效、迅速，有助于快速构建mdv重组疫苗。
[0060]
3.crispr/cas9敲入方法简单，设计的sgrna序列加上供体质粒可对靶位点进行高效插入。
附图说明
[0061]
图1：供体质粒构建示意图；
[0062]
图2：重组病毒rhvt-f的构建示意图；
[0063]
图3：重组病毒rhvt-ha的构建示意图；
[0064]
图4：px330-hvt005/006-sgrna质粒pcr电泳鉴定图；
[0065]
图5：重组病毒rhvt-gfp-f的荧光图；
[0066]
图6：重组病毒rhvt-gfp-ha的荧光图；
[0067]
图7：ifa鉴定重组病毒rhvt-f荧光图；
[0068]
图8：ifa鉴定重组病毒rhvt-ha荧光图；
[0069]
图9：pcr鉴定重组病毒rhvt-f传代稳定性pcr电泳图；
[0070]
图10：pcr鉴定重组病毒rhvt-ha传代稳定性pcr电泳图。
具体实施方式
[0071]
下面以构建rhvt-f和rhvt-ha为例，对本发明进行详细的描述。
[0072]
实施例：
[0073]
1.实验材料
[0074]
1.1毒株、质粒和抗体
[0075]
hvt fc-126疫苗株、ndv基因ⅶ型js株和aiv h9n2(2019)株由扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室鉴定与保存。
[0076]
质粒：px330、px459、pcdna3.1和pcdna3.1-cre质粒购自湖南科爱医疗器械有限公司旗下网站(优宝生物)。-t easy vector systems购自promega公司。质粒pcmv-n-gfp购自碧云天公司。质粒px459-sga扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室构建与保存，质粒px459-sga为sga序列(参考knock-in of large reporter genes in human cells via crispr/cas9-induced homology-dependent and independent dna repair，https://doi.org/10.1093/nar/gkw064)通过bbsi酶切位点连入px459质粒中。
[0077]
抗体：抗ha(h9)单克隆抗体2g4(参考文献《抗体压下h9n2流感病毒囊膜糖蛋白关键抗原表位氨基酸的变异分析》万志敏)和抗f(ndv)单克隆抗体1d10(参考文献《抗新城疫病毒融合蛋白单克隆抗体的特性及初步应用》王倩倩)由扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室制备与保存。
[0078]
2.实验方法
[0079]
2.1靶位点设计及sgrna序列的合成
[0080]
选择hvt的hvt005-hvt006间隔区插入外源基因，参照genbank中登录的hvt fc126株(登录号：af291866)的全基因序列的hvt005-hvt006间隔区序列，使用sgrna设计网站(http://crispr.mit.edu/)进行靶位点sgrna设计，得到sgrna向导序列。
[0081][0082]
在sgrna向导序列5’端添加碱基cacc，并将第一个碱基t换成g，形成正链sgrna序列；把设计sgrna向导序列反向互补，5’端添加碱基aaac，形成负链sgrna序列。
[0083][0084]
2.2打靶载体的构建：
[0085]
(1)将合成后的hvt005/006-sgrna-f和hvt005/006-sgrna-r序列退火形成dsdna，反应体系如下：
[0086][0087][0088]
将上述体系震荡离心后置于pcr仪中。37℃30min，95℃5min，梯度降温5℃/min，4℃10min。
[0089]
(2)利用bbsi酶对px330载体进行酶切使其线性化，反应体系如下：
[0090][0091]
37℃孵育2h，对线性化的载体px330进行切胶回收。
[0092]
(3)取退火后的dsdna与线性化的载体px330进行连接，反应体系如下：
[0093][0094]
将上述体系震荡离心后16℃过夜连接，获得连接产物。
[0095]
(4)取50μl dh5
ɑ
感受态细胞(购自诺维赞生物技术公司)，加入10μl连接产物，混匀感受态和连接产物，冰上孵育30min。42℃水浴90s，迅速将管子插入冰中静置3min。向管中加入800μl无抗lb培养基，摇床(37℃/150rpm)培养1h；吸取200μl菌液均匀涂布于提前准备好的含氨苄青霉素(50μg/ml)的固体培养基上，37℃倒置培养，转化的克隆在14-16h会出现。
[0096]
(5)提取质粒并根据载体px330和sgrna序列设计引物进行pcr鉴定
[0097][0098][0099]
反应程序：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。
[0100]
反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳(如图3所示)。
[0101]
2.2.供体载体pt-sga-gfp-f的构建
[0102]
2.2.1 ndv f基因的扩增
[0103]
针对ndv基因ⅶ型f基因序列和ndv la sota株f基因裂解位点序列设计overlappcr引物。引物序列如下：
[0104][0105]
以基因ⅶ型ndv的反转录cdna为模版，f(overlap)left-f和f(overlap)left-r，f(overlap)right-f和f(overlap)right-r为引物，分别pcr扩增f基因left片段和f基因right片段，之后再以f基因left片段和f基因right片段为模板，f(overlap)left-f和f(overlap)right-r为引物，overlappcr扩增替换裂解位点后的f基因片段。其中替换裂解位点后f基因的核苷酸序列为seq id no:2。
[0106]
用primer premier 5.0引物软件设计引物，上游和下游都引入noti酶切位点。引物序列如下：
[0107][0108]
以替换裂解位点后f基因片段为模版，noti-f-f和noti-f-r为引物，pcr扩增f基因，反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带备用。
[0109]
2.2.2真核表达载体pcdna3.1-sfii-f的构建
[0110]
2.2.2.1质粒pcdna3.1-sfii的构建
[0111]
基因序列合成mcmv+polya元件(nhei+sfii+mcmv+noti+sv40ploya+sfii+pmei)，mcmv序列参考于鼠巨细胞病毒基因组(murid herpesvirus 1strain smith,complete genome，genbank:gu305914.1，184336nt-182946nt)，整个元件核苷酸序列为seq id no:6。
[0112]
对基因合成的mcmv+polya序列片段进行nhei和pmei双酶切，通过nhei和pmei酶切位点连入pcdna3.1质粒中，得到质粒pcdna3.1-sfii。
[0113]
2.2.2.2质粒pcdna3.1-sfii-f的构建
[0114]
将质粒pcdna3.1-sfii和2.2.1中的f基因pcr胶回收产物用noti进行酶切，1％凝胶电泳后，切胶回收线性化后的pcdna3.1-sfii-noti载体和noti-f基因片段。将回收后的pcdna3.1-sfii-noti片段和noti-f基因片段连接，构建质粒pcdna3.1-sfii-f。
[0115]
2.2.3供体载体pt-sga-gfp-f的构建
[0116]
2.2.3.1质粒pt-sga的构建
[0117]
合成基因序列(sga+loxp+paci+loxp+sfii+spacer+sfii+sga)引物如下表，将sga-sfii-f和sga-sfii-r退火形成dsdna片段后，连入pgem-t-easy载体中，得到pt-sga载体。
[0118][0119]
2.2.3.2质粒pt-sga-gfp的构建
[0120]
针对gfp表达盒设计如下引物：
[0121][0122]
以pcmv-n-gfp质粒为模板，paci-gfp-f和paci-gfp-r为引物，扩增gfp表达盒(paci+cmv启动子+gfp+sv40polya+paci)，通过paci酶切位点连入pt-sga质粒，得到pt-sga-gfp质粒。
[0123]
2.2.3.3质粒pt-sga-gfp-f的构建
[0124]
将质粒pcdna3.1-sfii-f和pt-sga-gfp用sfii进行酶切，1％凝胶电泳后，切胶回收pcdna3.1-sfii-f载体中的sfii-f片段和线性化后的pt-sga-gfp载体。将回收后的sfii-f片段和pt-sga-gfp-sfii片段连接，构建质粒pt-sga-gfp-f。
[0125]
2.3.供体载体pt-sga-gfp-ha的构建
[0126]
2.3.1 aiv ha基因的扩增
[0127]
用primer premier 5.0引物软件设计引物，上游和下游都引入noti酶切位点。引物序列如下：
[0128][0129]
以aiv h9n2(2019)株cdna为模版，noti-ha-f和noti-ha-r为引物，pcr扩增ha基因，反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。其中ha基因的核苷酸序列为seq id no:3。
[0130]
2.3.2真核表达载体pcdna3.1-sfii-ha的构建
[0131]
将质粒pcdna3.1-sfii(见实施例2.2.2.1)和2.3.1中的ha基因pcr胶回收产物用
noti进行酶切，1％凝胶电泳后，切胶回收线性化的pcdna3.1-sfii载体和noti-ha基因片段。将回收后的pcdna3.1-sfii-noti片段和noti-ha基因片段连接，构建质粒pcdna3.1-sfii-ha。
[0132]
2.3.3供体载体pt-sga-gfp-ha的构建
[0133]
将质粒pcdna3.1-sfii-ha和pt-sga-gfp(见实施例2.2.3.2)用sfii进行酶切，1％凝胶电泳后，切胶回收pcdna3.1-sfii-ha载体中的sfii-ha片段和线性化后的pt-sga-gfp载体。将回收后的sfii-ha片段和pt-sga-gfp-sfii片段连接，构建质粒pt-sga-gfp-ha。
[0134]
2.4表达gfp和f蛋白的重组火鸡疱疹病毒rhvt-gfp-f的构建
[0135]
2.4.1细胞转染
[0136]
转染前制备原代cef细胞，细胞生长于含5％胎牛血清m199培养基的24孔细胞培养板中，待细胞长至铺满单层的80％时，参照transit-x2(mirusbio公司)转染试剂说明书使用transit-x2进行转染，每孔转染体系中质粒px459-sga 0.25μg，质粒pt-sga-gfp-f 0.25μg和质粒px330-hvt005/006-sgrna 0.25μg。
[0137]
2.4.2病毒感染
[0138]
在转染后8-12h感染hvt病毒，每孔病毒量为5000pfu。37℃，5％co2条件下继续培养2-3天后，将1孔细胞用胰酶消化并接种于2块新的cef 6孔细胞培养板上。37℃，5％co2条件下继续培养3-4天后，荧光显微镜下观察，挑选带有绿色荧光的病毒噬斑。
[0139]
2.4.3重组病毒rhvt-gfp-f的纯化
[0140]
荧光显微镜下观察，用记号笔标注出带有绿色荧光的病毒噬斑，胰酶消化法挑取标记的绿色荧光细胞，接种于次代cef单层细胞上，37℃，5％co2条件下培养3-4d；重复上述步骤，至所有噬斑均显示荧光，完全纯化的重组病毒命名为rhvt-gfp-f(如图5所示)。
[0141]
2.5.表达gfp和ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒rhvt-gfp-ha的构建
[0142]
2.5.1细胞转染
[0143]
转染前制备原代cef细胞，细胞生长于含5％胎牛血清m199培养基的24孔细胞培养板中，待细胞长至铺满单层的80％时，参照transit-x2(mirusbio公司)转染试剂说明书使用transit-x2进行转染，每孔转染体系中质粒px459-sga 0.25μg，质粒pt-sga-gfp-ha 0.25μg和质粒px330-hvt005/006-sgrna 0.25μg。
[0144]
2.5.2病毒感染
[0145]
在转染后8-12h感染hvt病毒，每孔病毒量为5000pfu。37℃，5％co2条件下继续培养2-3天后，将1孔细胞用胰酶消化并接种于2块新的cef 6孔细胞培养板上。37℃，5％co2条件下继续培养3-4天后，荧光显微镜下观察，挑选带有绿色荧光的病毒噬斑。
[0146]
2.5.3重组病毒rhvt-gfp-ha的纯化
[0147]
荧光显微镜下观察，用记号笔标注出带有绿色荧光的病毒噬斑，胰酶消化法挑取标记的绿色荧光细胞，接种于次代cef单层细胞上，37℃，5％co2条件下培养3-4d；重复上述步骤，至所有噬斑均显示荧光，完全纯化的重组病毒命名为rhvt-gfp-ha(如图6所示)。
[0148]
2.6.表达f蛋白的重组火鸡疱疹病毒rhvt-f的构建
[0149]
2.6.1细胞转染
[0150]
转染前制备原代cef细胞，细胞生长于加入含5％胎牛血清的m199培养基的24孔细胞培养板中，待细胞长至铺满单层的80％时，参照transit-x2(mirusbio公司)转染试剂说
明书使用transit-x2进行转染，每孔转染体系中质粒pcdna3.1-cre 0.5μg。
[0151]
2.6.2病毒感染
[0152]
在转染后8-12h感染rhvt-gfp-f病毒，每孔病毒量为5000pfu。37℃，5％co2条件下继续培养2-3天后，将1孔细胞用胰酶消化并接种于2块新的cef 6孔细胞培养板上。37℃，5％co2条件下继续培养3-4天后，荧光显微镜下观察，挑选不带有绿色荧光的病毒噬斑。
[0153]
2.6.3重组病毒rhvt-f的纯化
[0154]
荧光显微镜下观察，用记号笔标注出不带有绿色荧光的病毒噬斑，胰酶消化法挑取标记的病变细胞，接种于次代cef单层细胞上，37℃，5％co2条件下培养3-4d；重复上述步骤，至所有噬斑均不显示荧光，完全纯化的重组病毒命名为rhvt-f。
[0155]
2.7表达ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒rhvt-ha的构建
[0156]
2.7.1细胞转染
[0157]
转染前制备原代cef细胞，细胞生长于加入含5％胎牛血清的m199培养基的24孔细胞培养板中，待细胞长至铺满单层的80％时，参照transit-x2(mirusbio公司)转染试剂说明书使用transit-x2进行转染，每孔转染体系中质粒pcdna3.1-cre0.5μg。
[0158]
2.7.2病毒感染
[0159]
在转染后8-12h感染rhvt-gfp-ha病毒，每孔病毒量为5000pfu。37℃，5％co2条件下继续培养2-3天后，将1孔细胞用胰酶消化并接种于2块新的cef 6孔细胞培养板上。37℃，5％co2条件下继续培养3-4天后，荧光显微镜下观察，挑选不带有绿色荧光的病毒噬斑。
[0160]
2.7.3重组病毒rhvt-ha的纯化
[0161]
荧光显微镜下观察，用记号笔标注出不带有绿色荧光的病毒噬斑，胰酶消化法挑取标记的病变细胞，接种于次代cef单层细胞上，37℃，5％co2条件下培养3-4d；重复上述步骤，至所有噬斑均不显示荧光，完全纯化的重组病毒命名为rhvt-ha。
[0162]
2.8.重组病毒的鉴定及传代稳定性检测
[0163]
2.8.1间接免疫荧光试验(ifa)鉴定
[0164]
将重组病毒rhvt-f株、rhvt-ha株和hvt亲本毒分别接种于长满单层cef的24孔细胞培养板中，37℃，5％co2条件下培养，待细胞出现典型噬斑后，将培养液弃掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，pbs洗2次，接种rhvt-f株的孔中加入500μl(1:200稀释)1d10单抗，接种rhvt-ha株的孔中加入500μl(1:200稀释)2g4单抗，接种hvt株的1个孔中加入500μl(1:200稀释)1d10单抗，另一个孔中加入500μl(1:200稀释)2g4单抗。37℃恒温培养箱中孵育1h，用pbs洗3次，每孔加500μl(1:800稀释)alexa 594羊抗鼠igg抗体，放置37℃恒温培养箱中孵育1h，用pbs洗3次，在荧光显微镜下观察，rhvt-f株和rhvt-ha株感染孔出现特异性红色荧光(如图7和图8所示)，而hvt感染孔无荧光，表明rhvt-f株的f基因和rhvt-ha株的ha基因能够正确的表达。
[0165]
2.8.2pcr检测传代稳定性
[0166]
rhvt-f株和rhvt-ha株在cef连续传15代，每隔5代次，提取重组病毒的基因组，以提取的基因组为模板，以hvt-005/006-f和hvt-005/006-r为引物进行pcr，可分别扩增出3500bp左右的目的条带(如图9和图10所示)，表明f基因和ha基因成功插入到hvt基因组中，并未出现基因丢失现象。
[0167][0168]
3.用rhvt-f株作为疫苗
[0169]
3.1rhvt-f株的扩增
[0170]
鸡胚成纤维细胞接种于若干t75细胞瓶，培养1天后接种rhvt-f，每瓶接种5万pfu病毒。接种后，每天观察病毒生长情况，一般在接种后48-72小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变时，倒去细胞培养液，pbs洗一遍后，加入适量胰酶消化，待单层细胞出现皱缩快要脱离瓶壁时，弃去胰酶，加入等量含5％牛血清的细胞培养液终止消化。使用移液枪吹打细胞，使之全部脱离瓶壁，离心收集细胞后用冻存液(含15％牛血清和10％dmso的细胞培养液)重悬细胞，分装于冻存管，放入-70度，第2天转入液氮保存。
[0171]
3.2rhvt-f株的免疫
[0172]
将18只1日龄spf鸡随机分成两组，分别为rhvt-f组和攻毒对照组；其中rhvt-f组于1日龄时通过腹腔接种2000pfu/羽份的rhvt-f重组疫苗，攻毒对照组接种疫苗稀释液。两组鸡于28日龄时，用ndv强毒f48e8株经肌肉注射途径进行攻毒，攻毒剂量为105eld
50
/羽份。攻毒后每天观察并统计各组鸡的发病和死亡情况，观察两周。
[0173]
3.3 rhvt-f株免疫鸡的攻毒保护效果
[0174]
各组鸡的发病和死亡情况如下表所示，从表中可以看出rhvt-f组鸡的攻毒保护率可达100％，而攻毒对照组的保护率为0％。
[0175][0176]
免疫保护评价结果表明，鸡群免疫重组火鸡疱疹病毒rhvt-f株后，可以对ndv强毒株提供良好的免疫保护。