一种环系蒽醌类化合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及有机化合物技术领域，具体而言，涉及一种环系蒽醌类化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.根据国际癌症研究机构最新的癌症统计数据，2018年，全球估计有1810万新癌症病例和960万癌症死亡病例。癌症严重威胁着人类健康，降低预期寿命，已成为21世纪世界各国最重要的公共卫生问题之一。因此，研制高效、低毒副作用的抗肿瘤药物显得尤为重要。2014-2020年间全世界共批准上市的小分子抗肿瘤药物中，天然产物来源药物所占比例达到了63％，典型代表有紫杉醇(taxol)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、喜树碱(camptothecin)、长春花碱(vinblastine)以及它们的衍生物等。由此可见，天然产物不仅是创新药物的直接来源，其结构的多样性和复杂性还可以为化学合成提供重要的活性骨架模板和结构信息，大大提高新药发现的几率，尤其为开发抗肿瘤药物提供了重要源泉。然而，天然产物的药源问题一直是制约其发展的限制性因素。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种环系蒽醌类化合物，该类化合物对多种肿瘤细胞均具有抑制活性的作用，具有较好的抗肿瘤活性，克服了天然产物药源问题。
4.本发明的另一目的在于提供一种环系蒽醌类化合物的制备方法，通过该制备方法可以得到纯度更高的化合物，更便于对化合物进行理化分析，有利于对化合物的应用进行开发研究。
5.本发明的另一目的还在于提供一种环系蒽醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，为开发新型抗肿瘤药物提供了物质基础。
6.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
7.本发明提出一种环系蒽醌类化合物，该环系蒽醌类化合物的结构式为：
[0008][0009]
其中，r为＝o或－oh。
[0010]
本发明提出一种环系蒽醌类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
取座囊霉菌发酵培养，得到发酵产物；座囊霉菌为dothideomycete sp.bmc-101(保藏编号是：cgmcc 23822)。
[0012]
本发明提出一种环系蒽醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0013]
本发明实施例至少具有以下有益效果：
[0014]
本发明中座囊霉菌为dothideomycete sp.bmc-101(保藏编号是：cgmcc 23822，于2021年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
[0015]
本发明的环系蒽醌类化合物对多种肿瘤细胞均具有抑制活性的作用，具有较好的抗肿瘤活性，有助于开发新型的抗肿瘤药物。
[0016]
本发明中通过发酵培养来获取含有该类化合物的发酵产物，原料可大量获得。其次，可以优化发酵条件，让发酵产物中该类化合物的含量提高，以便于后续提纯分离出更大量的化合物，有助于对化合物进行分析研究，从而开发出该化合物在不同方面的应用。通过将发酵产物进行分离、浸提或萃取，可以提高浸膏中化合物含量，更便于化合物分离提纯。通过将浸膏进行硅胶柱层析、sephadex lh20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱、tlc薄层制备等方法来分离提纯，可以得到纯度较高、含量较多的化合物，更便于后续对化合物进行结构改造，从而提高化合物在各方面的应用。尤其是在制备抗肿瘤药物中的应用，为开发新型抗肿瘤药物提供了物质基础。
附图说明
[0017]
图1为本发明实施例环系蒽醌类化合物的结构式；
[0018]
图2为本发明实施例化合物i的1h nmr图谱；
[0019]
图3为本发明实施例化合物i的
13
c nmr图谱；
[0020]
图4为本发明实施例化合物ii的1h nmr图谱；
[0021]
图5为本发明实施例化合物ii的
13
c nmr图谱；
[0022]
图6为本发明实施例化合物i的hr-esi-ms图谱；
[0023]
图7为本发明实施例化合物ii的hr-esi-ms图谱。
具体实施方式
[0024]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
[0025]
一种环系蒽醌类化合物，如图1所示，该环系蒽醌类化合物的结构式为：
[0026][0027]
其中，r为＝o或－oh。
[0028]
本发明的环系蒽醌类化合物对多种肿瘤细胞均具有抑制活性的作用，具有较好的抗肿瘤活性，有助于开发新型的抗肿瘤药物。
[0029]
一种环系蒽醌类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0030]
取座囊霉菌dothideomycete sp.bmc-101发酵培养，得到发酵产物，然后将发酵产物经硅胶柱层析，sephadex lh20凝胶柱层析，甲醇为溶剂，再经反相半制备hplc，乙腈和水为洗脱剂，分离纯化得到化合物i和化合物ii。
[0031]
其中，化合物i的结构式为：
[0032][0033]
化合物ii的结构式为：
[0034][0035]
本发明中通过发酵培养来获取含有该类化合物的发酵产物，原料可大量获得。其次，可以优化发酵条件，让发酵产物中该类化合物的含量提高，更便于后续提纯分离出更多的化合物，有助于对化合物进行分析研究，从而开发出该化合物在不同方面的应用。通过将发酵产物进行分离、浸提或萃取，可以提高浸膏中化合物含量，更便于化合物分离提纯。通过将浸膏进行硅胶柱层析、sephadex lh20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱、tlc薄层制备等方法来分离提纯，可以得到纯度较高、含量较多的化合物，更便于后续对化合物进行结构改造，从而提高化合物在各方面的应用。详细地，取座囊霉菌培养后的发酵产物进行分离，得到发酵液和菌丝体，将菌丝体依次进行浸提、减压浓缩、萃取，得到萃取相a，将发酵液萃取得到萃取相b，将萃取相a和萃取相b合并，减压浓缩得到浸膏；
[0036]
将浸膏用甲醇溶解，以第一溶液为洗脱剂进行正相硅胶分离，得到组分fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5、fr.6；将组分fr.4以第一溶液为洗脱剂进行正相硅胶分离，得到9个流份，其中流份5以反相半制备高效液相色谱分离，得到化合物ⅰ；将组分fr.5用tlc薄层制备法分离，得到化合物ⅱ；第一溶液为乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶液。
[0037]
详细地，流份5以反相半制备高效液相色谱分离时，流动相中乙腈与水的体积比为70：30。组分fr.5用tlc薄层制备法分离时，流动相中二氯甲烷和甲醇的体积比为30：1。限定分离时的流动相成分及比例，可以得到纯度更高、含量更多的化合物，有利于对化合物进行分析研究。可选地，发酵产物分离时，采用纱布进行分离得到发酵液和菌丝体。纱布分离操作简单，分离效果较好。
[0038]
本实施例中，座囊霉菌培养过程为：取菌株座囊霉菌接种到pda固体平面培养基上，在28℃培养箱中培养5-10d，然后再接种到液体营养培养基中，在28℃培养40d，即得发酵产物。
[0039]
先在pda固体平面培养基上培养，可以提高座囊霉菌的成活率，便于其繁殖，而在28℃培养箱中培养5-10d时，座囊霉菌的繁殖情况最好。然后再接种在液体营养培养基中培养，通过吸收液体培养基中的营养成分，更利于座囊霉菌生长繁殖，加快其生长及繁殖速度，更便于得到含有环系蒽醌类化合物量更多的发酵产物，从而便于后续对化合物进行分
离提纯。
[0040]
详细地，液体营养培养基按重量份数计包括以下组分：20份麦芽糖，10份葡萄糖，20份甘露醇，10份味精，3份酵母膏，1份玉米膏，0.5份kh2po4和0.3份mgso4·
7h2o。通过对液体营养培养成分的调整，让该培养基更适合座囊霉菌生长繁殖，从而得到含量更高的环系蒽醌类化合物。各组分在上述配比下，对座囊霉菌的生长繁殖效果最好。
[0041]
详细地，菌丝体依次进行浸提、减压浓缩、萃取时，用甲醇浸提3次，将减压浓缩得到的水相用乙酸乙酯萃取3次。发酵液萃取得到萃取相b时，用乙酸乙酯萃取3次。其中，水相与乙酸乙酯的体积比为1:1，发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1。先用甲醇对菌丝体进行浸提，然后再用乙酸乙酯对经浸提和减压浓缩后的水相进行萃取，这样可以让菌丝体中的化合物能够更好地析出，最大限度的提取出化合物，进而提高萃取相a中化合物浓度，更便于化合物后续分离提纯。用乙酸乙酯对发酵液进行萃取，更利于提取出发酵液中的化合物。限定浸提或萃取次数，可以最大限度地将菌丝体和发酵液中的化合物提取出来，从而得到含量更多的化合物。限定萃取剂与萃取物的比例，在该比例下，萃取物中的化合物析出效果最好，从而让得到的化合物含量最多。
[0042]
一种环系蒽醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，为开发新型抗肿瘤药物提供了物质基础。
[0043]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0044]
实施例
[0045]
一种环系蒽醌类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0046]
发酵产物制备：从甘油管中取菌株座囊霉菌dothideomycete sp.bmc-101孢子适量，接种到pda固体平面培养基上，在28℃培养箱中培养10d，然后再取培养后的座囊霉菌适量，接种到装有300ml液体营养培养基的锥形瓶中，在28℃培养40d，即得发酵产物。
[0047]
浸膏制备：取发酵产物用纱布进行分离，得到发酵液和菌丝体，将菌丝体用甲醇浸提3次，减压浓缩至无甲醇，将所得水相用等体积的乙酸乙酯萃取3次，得到萃取相a，将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，得到萃取相b，将萃取相a和萃取相b合并，减压浓缩得到浸膏，共3.3g。
[0048]
化合物提纯分离：将浸膏用甲醇溶解，以第一溶液为洗脱剂进行正相硅胶分离，得到组分fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5、fr.6；将组分fr.4(1.3g)以第一溶液为洗脱剂进行正相硅胶分离，得到9个流份，其中流份5以反相半制备高效液相色谱分离，得到化合物ⅰ(19mg)；将组分fr.5用tlc薄层制备法分离，得到化合物ⅱ(16mg)；第一溶液为乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶液。
[0049]
本实施例中反相半制备高效液相色谱分离时，流动相中乙腈和水的体积比为70：30；tlc薄层制备法分离时，流动相中二氯甲烷和甲醇的体积比为30：1。液体营养培养基组分为：20g麦芽糖，10g葡萄糖，20g甘露醇，10g味精，3g酵母膏，1g玉米膏，0.5g kh2po4，0.3g mgso4·
7h2o，蒸馏水1000ml。
[0050]
实验结果
[0051]
1.化合物结构鉴定
[0052]
检测过程中化合物的结构式(结构式中的阿拉伯数字表示碳原子的标位)为：
[0053][0054]
化合物ⅰ，为黄色固体，hr-esi-ms m/z:260.0923[m+h]
+
，计算值260.0921。ir(kbr)ν
max
为3554，3469，1760，1705，1619，1572cm-1
，核磁数据如表1所示。
[0055]
化合物ⅱ，为黄色固体，hr-esi-ms m/z:260.0923[m+h]
+
，计算值260.0921。ir(kbr)ν
max
为3550，3468，1761，1705，1620，1574cm-1
，核磁数据如表1所示。
[0056]
表1化合物ⅰ和化合物ⅱ的1h和
13
c nmr数据(400和100mhz，in dmso-d6)a[0057]
[0058][0059]
注：本表信号归属基于hmqc，1h-1
h cosy及hmbc图谱解析结果。
[0060]
如图2-图7所示，通过高分辨质谱、核磁共振谱(1h nmr，
13
c nmr，2d-nmr)、x-ray单晶衍射、红外光谱等数据进行综合分析，从而确定化合物i和化合物ii的分子式和结构式，结果如下所示：
[0061]
化合物ⅰ的分子式为c
29h22o10
，结构式为：
[0062][0063]
化合物ⅱ的分子式为c
29h24o10
，结构式为：
[0064][0065]
2.化合物i和化合物ii抗肿瘤活性试验
[0066]
(1)被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例中分离精制的化合物i和化合物ii纯品，精密称取适量样品，用dmso配制成所需浓度的溶液，供测活性。
[0067]
(2)实验方法：取对数生长期且生长状态良好的cne-2z细胞、smmc-7721细胞、mcf-7细胞、hepg2细胞、a549细胞，胰酶消化后重悬细胞，用血球计数板计数，将细胞密度稀释到5
×
104个/ml，按每孔100μl加到96孔细胞培养板中(边缘空用pbs填充)，每组设置3个复孔，同时设置只含培养液的空白对照组，于37℃、5％co2的培养箱中培养24h。弃去孔内溶液，进行给药处理，样品分别设定4个浓度梯度，同时设阳性、阴性对照组，培养72h后，每孔加入10μl mtt溶液，放入培养箱孵育4小时。完成孵育后，弃去孔内溶液，每孔加入100μl dmso使结晶全部溶解，然后将96孔板放置37℃烘箱继续孵育30min。用酶标仪检测各孔吸光度值，具体参数设置为：振板时间20s，检测波长为490nm。ir％(细胞抑制率)＝(od
阴性对照组-od
实验组
)/(od
阴性对照组-od
空白对照组
)
×
100％，取三组平均od值计算。
[0068]
表2化合物i和化合物ii对多种肿瘤细胞的体外细胞毒活性
[0069][0070]
根据表2可知，本发明实施例中得到的化合物i和化合物ii均可以抑制肿瘤细胞增殖，化合物i的半抑制率ic
50
在17.2～22.8μm范围内，化合物ii的半抑制率ic
50
为33.9～53.5μm范围内。因此可知，本发明得到的化合物具有较好的抗肿瘤活性。
[0071]
综上所述，本发明实施例的环系蒽醌类化合物对多种肿瘤细胞均具有抑制活性，具有较好的抗肿瘤活性，为后期进行该类化合物的结构改造提供了先导结构，为开发新型抗肿瘤药物提供了物质基础。
[0072]
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。