一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用

1.本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用。


背景技术：

2.水牛是分布在我国南方的一种重要的经济畜牧品种，是人类原料乳及肉类的主要来源之一。畜牧动物的产肉率高低与骨骼肌的发育好坏存在直接关系。成肌细胞是一种处于增殖状态的肌肉前体细胞，在骨骼肌生长发育过程中，其能够增殖分化为肌纤维并成熟为骨骼肌组织。利用成肌细胞系能够模拟肌肉的发育过程，可以对参与骨骼肌发育的基因及功能进行广泛的体外研究。其中，成肌细胞的获得至关重要。
3.目前，牛成肌细胞多是通过对牛骨骼肌细胞或骨骼肌卫星细胞分化而来，且多是针对黄牛，尚未有系统完整的构建水牛体外成肌细胞诱导分化模型的分离纯化培养体系。例如，中国专利一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法中通过增加lncrna-23的表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。但牛骨骼肌细胞或骨骼肌卫星细胞的分化方法操作复杂，耗费的时间长。且水牛相对黄牛而言，其肌纤维更密，不稳定的培养条件会促进成肌细胞发生分化，并融合形成肌管，使得体外培养成肌细胞难度更大。而通过体外培养水牛背最长肌来源的成肌细胞建立水牛肌肉发育研究模型，不仅有利于从细胞和分子生物学水平研究现有水牛肌肉发育机制，寻找相关水牛育种分子靶标，对我国水牛精准育种，推动水牛相关产业发展也具有重要意义。因此，亟需建立一种能高效、稳定地、可重复的分离和纯化水牛原代成肌细胞的方法。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用。
5.本发明的目的是提供一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用。
6.本发明的另一目的是提供所述方法在制备水牛原代成肌细胞系或水牛原代成肌细胞模型中的应用。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.本发明提供了一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法，其包含以下步骤：
9.s1.采集水牛胎儿背最长肌肌肉组织，消毒后用水冲洗，放入培养基中；
10.s2.将步骤s1所得水牛背最长肌肌肉组织表面筋膜、脂肪及结缔组织剥离干净，用ddh2o漂洗后置于75％酒精中漂洗，用含青霉素和链霉素的pbs漂洗，将漂洗干净的水牛背最长肌肌肉组织剪碎成肉糜；
11.s3.向步骤s2所得肉糜中加入含青霉素和链霉素的pbs，静置3～8min后弃上清；
12.s4.向步骤s3所得产物中加入i型胶原酶，置于恒温摇床消化，获得粘稠的胶状物；
13.s5.加入dmem终止胶原酶消化，离心后弃上清；
14.s6.加入等体积的0.25％胰蛋白酶置于恒温摇床消化20～30min，加入完全培养基终止消化；
15.s7.将终止消化的细胞悬液过细胞筛，将过滤后的液体离心，弃上清，用原代培养基进行重悬，得水牛原代成肌细胞；
16.s8.采用差速贴壁法进行水牛原代成肌细胞的纯化。
17.具体地，步骤s1所述水牛背最长肌肌肉组织来源于3～4个月龄的胎儿期水牛，体长15～20cm。
18.具体地，步骤s2中用75％酒精漂洗的时间不超过10s。
19.具体地，步骤s2所述含青霉素和链霉素的pbs中，青霉素的浓度为100～300u/ml，链霉素的浓度为0.1～0.3mg/ml。
20.具体地，步骤s2中先用含300u/ml青霉素和300mg/ml链霉素的pbs漂洗水牛背最长肌肌肉组织2次，再依次用含200u/ml青霉素和200mg/ml链霉素的pbs和含100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的pbs各漂洗2次，且使用前先将pbs于37℃条件下温浴。
21.具体地，步骤s2中使用眼科剪将水牛背最长肌肌肉组织剪碎成肉糜。
22.具体地，步骤s3中所加含青霉素和链霉素的pbs中，青霉素的浓度为100u/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml，所加体积为肉糜体积的2倍。
23.具体地，步骤s4中所加i型胶原酶的体积与步骤s3所得产物的体积相同，消化时间为60min。
24.具体地，步骤s4中所述i型胶原酶的终含量为300u。
25.具体地，步骤s4中所述第一次消化的温度为37℃，恒温摇床转速为200rpm/min。
26.具体地，步骤s6中所述第二次消化的温度为37℃，消化时间为20min～25min，恒温摇床转速为200rpm/min，采用2倍体积的浓度为10％的fbs终止消化。
27.具体地，所述步骤s5中，离心的转速为600xg，离心时间为5min。
28.具体地，步骤s6所述完全培养基为含体积浓度为10％的fbs，终浓度为100u/ml的青霉素，终浓度为0.1mg/ml的链霉素，终浓度为50ug/ml的庆大霉素以及体积浓度为1％的glutamax的高糖型dmem培养基。
29.具体地，步骤s6中加入2倍体积的完全培养基终止消化。
30.具体地，步骤s7所述原代培养基为含体积浓度为20％的fbs，终浓度为100u/ml的青霉素，终浓度为0.1mg/ml的链霉素，终浓度为50ug/ml的庆大霉素以及体积浓度为1％的glutamax的高糖型dmem培养基。
31.具体地，步骤s7中将终止消化的细胞悬液依次过100目、70目、40目的细胞筛。
32.具体地，步骤s8中所述差速贴壁法纯化水牛原代成肌细胞的操作为：将步骤s7所得细胞悬液在含5％co2的培养箱中培养2h，培养结束后将上清转移至新的培养皿中，置于co2培养箱中培养24h后更换新鲜的完全培养基，弃去上层悬浮细胞碎片和死细胞；每隔24h换一次传代培养基，到水牛成肌细胞增殖达到融合培养即可。
33.本发明在将水牛胎儿背最长肌肌肉组织表面筋膜、脂肪及结缔组织剥离干净后，在酒精消毒的基础上，再依次用含不同浓度梯度的青霉素和链霉素的pbs漂洗，不仅能够抑制细菌的生长，减少原代细胞污染的可能，且通过逐步降低抗生素浓度，使其从高浓度过渡到正常低浓度，与正常培养细胞所用浓度相同，保证了原代细胞培养的稳定环境，保证了原
代细胞的活性和活力。
34.本发明通过严格控制i型胶原酶和胰蛋白酶的酶使用浓度，使得组织消化更加充分，避免未达到最高酶活力情况而浪费组织，实现了组织利用的最大化，以尽可能多的得到原代成肌细胞。同时，本发明在37℃条件下，使用转速为200rpm/min的恒温摇床进行胰蛋白酶消化，避免了因胰蛋白酶分布不均匀而导致的个别组织消化过度问题，且在最适温度下容易达到消化最大化。
35.此外，本发明严格控制了胰蛋白酶的消化时间，胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。当胰蛋白酶消化超过30min时，对细胞有一定的致死性损伤，表现为相同质量的肌肉分离出的原代成肌细胞数目明显减少，存在大量未贴壁死亡细胞。对比实验表明：胰蛋白酶作用时间少于20min时分离得到的原代成肌细胞生长到80％所需的时间大于两天，当胰酶作用时间超过30min时分离得到的原代成肌细胞生长到80％所需的时间大于三天，且后期分化融合指数降低。而本发明通过设定的胰酶作用时间能够很好地避免对组织过度消化过度所导致的细胞活性低、得率差的问题，消化也更均匀透彻。
36.本发明还申请保护所述方法在制备水牛原代成肌细胞系或水牛原代成肌细胞模型中的应用。
37.本发明具有以下有益效果：
38.本发明提供了一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法，在所述分离水牛原代成肌细胞的方法的基础上，通过差速贴壁法纯化水牛原代成肌细胞，可以直接有效地去除成纤维细胞，大大提高了牛原代成肌细胞细胞的纯度，分离得到的细胞纯度接近100％。相对现有通过分化获得牛成肌细胞的方法来说，本发明所述分离纯化水牛原代成肌细胞的方法的操作简单，耗费时间少。同时，利用本发明所述分离纯化方法获得的水牛原代成肌细胞不仅纯度高，其活性也高，细胞的分化融合效果好，可用于构建水牛肌肉发育研究模型，极具实用价值和推广意义。
附图说明
39.图1为原代水牛背最长肌来源的成肌细胞，放大4倍。
40.图2为原代水牛背最长肌来源的成肌细胞，放大10倍。
41.图3为采用本发明所述方法得到的水牛成肌细胞的pax7免疫荧光染色效果图，放大倍数为20倍。
42.图4为采用本发明所述方法得到的水牛成肌细胞标记myod免疫荧光染色效果图，放大倍数为20倍。
43.图5为采用本发明所述方法得到的水牛成肌细胞的分化效果图，放大20倍。
44.图6为采用本发明所述方法得到的水牛成肌细胞分化后myhc免疫荧光染色标记图，放大倍数为20倍。
具体实施方式
45.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试
剂、方法和设备。
46.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
47.本发明所述pbs为磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)；所述fbs为胎牛血清(fetal bovine serum)；所述dmem为含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(dulbecco's modified eagle medium)；所述hs为马血清(horse serum)，所用抗体myod来自proteintech，货号为18943-1-ap；pax7来自bioss，货号为bs-2413r；myhc来自abcam，货号为ab207926；多聚赖氨酸来自solarbio，货号为p2100。
48.实施例1 水牛成肌细胞的分离纯化
49.1、培养基的配制
50.(1)庆大霉素溶液的配制：准确称取1g庆大霉素粉末溶于20ml无核酸酶水中，配制成50mg/ml的庆大霉素溶液，分装后于-20℃下保存备用.
51.(2)原代培养基的配制：在76.5ml dmem高糖液体培养基中添加下列成分：20ml胎牛血清；2ml青霉素和链霉素混合液(混合液中，青霉素的浓度为10ku/ml，链霉素的浓度10mg/ml，在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100u/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml)；0.5ml细胞培养添加剂gluta-max；1ml庆大霉素储藏液(储藏液浓度为5mg/ml)；配置成100ml原代培养基；培养基配齐后，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在4℃下保存备用。
52.(3)完全/传代培养基配制：在87.5ml dmem高糖液体培养基中添加下列成分：10ml胎牛血清；1ml青霉素和链霉素混合液；0.5ml细胞培养添加剂gluta-max；1ml庆大霉素储藏液(储藏液浓度为5mg/ml)；培养基配齐后，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，在4℃下保存备用。
53.(4)含2％青霉素和链霉素的pbs：98ml pbs溶液中添加2ml青霉素和链霉素混合液；含1％青霉素和链霉素的pbs则在99ml pbs溶液中添加1ml青霉素和链霉素混合液。
54.(5)多聚赖氨酸的配置：准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理，用0.01％的多聚赖氨酸以50微升每平方厘米的量均匀涂于培养皿底部表面，室温下静置5min，吸除多余液体，加入灭菌水，反复冲洗三次，无菌操作。处理后无菌晾干备用，回收后保持无菌的多聚赖氨酸可反复利用。
55.2、水牛成肌细胞的分离纯化
56.(1)试验器具的准备：将眼科剪、弯镊子、100mm培养皿、50ml离心管、移液枪和枪头，其中手术器械和枪头需用高温消毒灭菌后使用；
57.(2)无菌条件下，用0.01％的多聚赖氨酸以50微升每平方厘米的量均匀涂于100mm培养皿底部表面，室温下静置5min后吸除多余液体，加入灭菌水反复冲洗三次，处理后无菌晾干备用；
58.(3)水牛背最长肌肌肉组织的采集：本发明取3～4个月龄的胎儿期水牛的背最长肌肌肉组织；将水牛置于操作台中，用直尺测量体长为15cm～20cm，用75％酒精棉球擦拭整个身体消毒，用眼科剪剪开水牛第三根肋骨一直延伸到臀腰肉的背部皮肤，暴露皮下筋膜，用弯剪剥离筋膜，暴露背最长肌，分离出背最长肌后，快速将肌肉组织置于37℃dmem中浸泡，用同样的方法剥离另一侧背最长肌，即得水牛胎儿双侧背最长肌肌肉组织，此步骤要在5min内完成；
59.(4)水牛背最长肌肌肉组织的消化及悬液制备：在不同离心管中分别配制含1％、
2％、3％青霉素和链霉素混合液的pbs缓冲液(所述含1％青霉素和链霉素混合液的pbs缓冲液中，青霉素的浓度为100u/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml，2％、3％依倍数增加)，使用前先于37℃条件下温浴；75％酒精消毒后用pbs冲洗，放入dmem高糖培养基中；
60.将水牛背最长肌肌肉组织置于100mm一次性培养皿中，用镊子和眼科剪在2min内将肌肉组织表面筋膜、脂肪和结缔组织剥离干净，随后进行漂洗，漂洗程序如下：依次用ddh2o和75％酒精漂洗一次后，用含3％青霉素和链霉素的pbs漂洗两次，再用含2％和1％青霉素和链霉素的pbs漂洗依次两次，将漂洗干净的水牛背最长肌肌肉组织剪碎成肉糜；其中，肌肉组织在75％酒精中漂洗的时间应严格控制在10s以内。将获得的肉糜移入50ml离心管中，加入2倍体积的含3％青霉素和链霉素混合液的pbs，静置5min～8min后，尽可能完全的弃掉上清；加入与组织块等体积的i型胶原酶，轻轻吹打混合均匀得背最长肌肉糜悬液；将悬液置于37℃恒温摇床进行第一次消化，设置恒温摇床转速为200rpm/min，消化60min后观察悬液，组织块被大量消化分散，离心600g/min
×
5min后弃去上清；吸去i型胶原酶，加入0.25％的胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中进行第二次消化，消化时间为20min～25min，得到粘稠状液体，用2倍体积的10％fbs终止消化；
61.(5)背最长肌悬液的培养：将步骤(3)终止消化后得到的背最长肌悬液于600g/min转速下室温离心10min，离心结束后小心去上清液，然后再用原代培养基重悬背最长肌碎片，轻轻吹打再混匀制成悬液，采用差速贴壁培养法，将悬液均匀转移至0.1mg/ml多聚赖氨酸包被的100mm无菌培养皿中，轻轻摇匀，标记时间后置于37℃、5％co2的培养箱中贴壁培养2h后，吸取上清液转移至新的0.1mg/ml多聚赖氨酸包被的100mm无菌培养皿，以去除先沉淀下来的成纤维细胞，1天后换传代培养基，以后每隔24h换一次传代培养基，直到水牛背最长肌的成肌细胞增殖达到融合，即得到水牛背最长肌来源的成肌细胞。
62.所述完全培养基为含体积浓度为10％的fbs，终浓度为100u/ml的青霉素，终浓度为0.1mg/ml的链霉素，终浓度为50ug/ml的庆大霉素以及体积浓度为1％的glutamax的高糖型dmem培养基。
63.所述原代培养基为含体积浓度为20％的fbs，终浓度为100u/ml的青霉素，终浓度为0.1mg/ml的链霉素，终浓度为50ug/ml的庆大霉素以及体积浓度为1％的glutamax的高糖型dmem培养基。
64.所有传代使用的培养皿均需提前用0.1mg/ml多聚赖氨酸包被。
65.原代水牛背最长肌来源的成肌细胞分别放大4倍和10倍后的图片分别如图1和图2所示，结果表明本发明得到了形态一致的成肌细胞。
66.实施例2 消化时间的优化
67.本发明在试验过程中发现，第二次消化后细胞质量受到影响，获得的细胞损伤较严重，且存在大量未贴壁死亡细胞，导致后续分离得到的水牛原代成肌细胞数量少且活性不好。
68.进一步实验发现，在第二次消化过程中，当胰蛋白酶的消化时间超过30min时，对细胞有一定的致死性损伤，表现为相同质量的肌肉分离出的原代成肌细胞数目明显减少，存在大量未贴壁死亡细胞，故本发明对消化时间进行了优化。而对比实验结果表明：当胰蛋白酶作用时间少于20min时，分离得到的原代成肌细胞生长到80％所需的时间大于两天，当胰酶作用时间超过30min时，分离得到的原代成肌细胞生长到80％所需的时间大于三天，且
细胞后期的分化融合指数降低。因此，第二次消化的消化时间应为20min～30min，控制在20min～25min内更佳，消化20min～25min时，分离得到的原代成肌细胞无明显区别。
69.实施例3 成肌细胞分化效果观察
70.将实施例1中分离纯化获得的传代培养的成肌细胞接种于6孔板中，培养1～2d；待细胞长至70％～80％时，去除生长培养基，加入pbs磷酸缓冲液清洗3遍细胞，更换含1％青链霉素混合液的2％马血清(hs)的分化培养基；每24h换一次新鲜分化培养基液，观察并拍照，连续记录细胞的形态变化，对分化培养的细胞分别进行pax7免疫荧光染色、myod免疫荧光染色、myhc免疫荧光染色和dapi染色，通过细胞免疫荧光分析细胞的分化效果。细胞免疫分析过程如下：
71.吸弃细胞培养皿中的培养液，用4％的冷多聚甲醛固定20min，pbs洗涤三次，每次5min；用0.5％triton x-100通透细胞10min，pbs洗涤三次；用5％牛血清白蛋白(bsa)封闭30min，pbs洗涤三次；一抗4℃摇床孵育过夜，pbs洗涤三次；使用荧光标记的二抗室温避光孵育2h，pbs洗涤4次；dapi染细胞核10min，pbs洗涤三次后于荧光显微镜下观察。
72.图3为pax7免疫荧光染色效果图，放大倍数为20倍。其中，dapi染色的细胞核为蓝色，pax7标记抗体为绿色，merge为合并图。pax7是静息期成肌细胞的标志基因，其表达水平随着成肌细胞的定向分化而减少，因此可通过观察pax7观察分离所得成肌细胞的纯度。由图3可知，pax7免疫荧光染色的覆盖率极高，近乎100％，表明本发明所得成肌细胞的纯度高，纯化效果好。
73.图4为myod免疫荧光染色效果图，放大倍数为20倍。其中，红色为myod标记抗体，merge为合并图。myod基因属于bhlh转录因子，是骨骼肌生长过程中重要的调控因子，在成肌前体细胞的命运决定和成肌细胞的增殖中起着重要作用，myod表达水平随着定向分化而增加。由图4可知，myod基因在分离纯化后的水牛成肌细胞中表达呈阳性，表明所分离的细胞为成肌细胞，成肌诱导分化方法有效，细胞的活性高，分化好。
74.图5为本发明所得水牛成肌细胞的分化效果图，放大倍数为20倍。由图5可知，本发明所得水牛背最长肌来源的成肌细胞的成肌分化良好。
75.图6为myhc免疫荧光染色标记图，放大倍数为20倍。其中，红色为myhc标记抗体，merge为合并图。肌球蛋白是骨骼肌中的结构蛋白和收缩蛋白，而肌球蛋白重链(myhc)是其重要的组成部分。因此，myhc常作为鉴定成肌细胞分化的标志蛋白。由图6可知，分化6天后，经免疫荧光鉴定，myhc在细胞质内呈显著的阳性表达，表明本发明分离的水牛成肌细胞的纯度高，且诱导分化效果好。
76.上述结果表明，利用本发明所述水牛成肌细胞的分离和纯化方法，能够获得高纯度、高活性的背最长肌成肌细胞，且细胞的分化良好。分离的水牛成肌细胞随培养代次的增加，细胞的增殖和分化能力逐渐降低，3～5代内的细胞可作为体外培养原代成肌细胞的最佳材料。
77.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。