甘露聚糖酶变体的制作方法

1.本发明涉及甘露聚糖酶的变体。这些变体可用于其中需要甘露聚糖的降解或改性的工业应用中，如在洗衣和清洁应用中，在饲料、食品、纸浆和造纸和油工业中。本发明还提供了有用的甘露聚糖酶、编码这些酶的多核苷酸、酶组合物及其生产和使用方法。


背景技术：

2.半纤维素和半乳甘露聚糖的主要作用是充当结构多糖和/或充当储备能量。除作为植物中最广泛的储备多糖的直链淀粉和支链淀粉之外，各种植物的种子、根、鳞茎和块茎中存在多样的基于甘露聚糖的多糖类群。这些类群包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖。
3.甘露聚糖是具有β-1,4连接的d-吡喃甘露糖残基主链的多糖。在大多数情况下，甘露聚糖高度地不溶于水中，但具有高的水结合能力。与未取代的甘露聚糖相反，半乳甘露聚糖为水溶性。归因于植物细胞壁的复杂结构性组成，依赖分解植物材料兴起的微生物必须拥有众多不同的能够水解这些高度聚合且大多不溶性物质的酶。两类参与半纤维素降解的主要内切作用酶是β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶。此外，需要外切作用酶β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-葡糖苷酶以完全降解半乳葡甘露聚糖。
4.参与甘露聚糖主链降解的主要酶类型是水解甘露聚糖主链中内部糖苷键的内切-1,4-β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)。内切-1,4-β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)是本文中也称为内切-β-1,4-d-甘露聚糖酶、β-甘露聚糖酶或甘露聚糖酶的甘露聚糖降解酶。由于内切-1,4-β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)降解甘露聚糖主链，所以甘露聚糖降解包括降解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。
5.甘露聚糖酶广泛用于食品和饲料应用、洗涤剂以及纸浆和造纸业：
6.·
已经显示使用甘露聚糖酶作为饲料添加剂提供若干有益作用，因为甘露聚糖是肠道内容物粘度的促成因素，从而不利地影响饲料消化率和动物生长速率。
7.·
在食品工业中，描述了甘露聚糖酶用于生产速溶咖啡，其中由于咖啡甘露聚糖的水解，酶降低了咖啡提取物的粘度。此外，甘露聚糖酶用于产生作为功能性食品成分令人感兴趣的特定甘露糖低聚物，如具有益生元功能的甘露糖低聚物。在这类应用中，将植物衍生的甘露糖聚合物通过甘露聚糖酶进行水解。
8.·
在加工和制造果汁中通常使用甘露聚糖酶，因为它降低粘度并提高过滤速率、稳定性并有助于提取水果成分。
9.·
洗涤剂用途：甘露聚糖酶促进移除食物衍生和化妆品衍生的污渍/污垢，后者经常包括含有甘露聚糖的添加剂如稳定剂、乳化剂和增稠剂。在更特殊的清洁应用中，应用甘露聚糖酶从需要无微生物的表面或管件如制药设备移除生物膜。在这样的应用中，甘露聚糖酶经常与洗涤剂和其他酶如糖酶和蛋白酶组合使用。
10.·
纸浆和造纸：甘露聚糖酶用于纸浆的酶辅助漂白中。甘露聚糖酶据称弥补木聚糖酶的作用。
11.·
甘露聚糖酶应用于借助水力压裂的石油和天然气井增产过程中。甘露聚糖酶降低用于该过程中的瓜尔豆溶液的粘度。
12.·
甘露聚糖酶用于从交联型半乳甘露聚糖组成的基质中控释药物或其他材料。
13.在应用条件下的活性是许多工业用酶的关键参数，因为这些酶在应用条件下经常倾向于活性不足。因此，本发明的目的是找到在通过发酵生产酶期间具有改善的稳定性的甘露聚糖酶变体，从而实现提高的非降解酶产物的产量。此类变体在本文中可称为“对降解稳定”。
14.在一个实施方案，本发明的甘露聚糖酶变体在生产中提供提高的非降解产物的产率和更好的使用性能。
15.在一个方面，本发明提供了在发酵过程中稳定的甘露聚糖酶，从而引起更高产量的具有足够酶活性的酶。甘露聚糖酶与seq id no:2至少75％相同，优选与根据seq id no:2的第31-490位的序列至少75％相同。根据seq id no:2的第31-409位的序列等于seq id no:3。
16.在一个方面，本发明提供了编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸序列。
17.在一个方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸序列的载体。
18.在一个方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞，其使得宿主细胞能够表达至少一种根据本发明的重组甘露聚糖酶变体。
19.在一个方面，本发明提供了一种表达多核苷酸的方法，其包括步骤
20.(a)通过将包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸的核酸构建体引入宿主细胞中来提供包含异源核酸构建体的宿主细胞，该异源核酸构建体包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸；
21.(b)在有利于表达多核苷酸的条件下培养步骤(a)的重组宿主细胞；和
22.(c)任选地，回收由多核苷酸编码的目的蛋白质。
23.在本发明的一个方面，在酶制剂中提供根据本发明的甘露聚糖酶变体，酶制剂允许与一种类型的酶或酶的混合物灵活地配制成液体制剂，如液体洗涤剂制剂。“配制成”意指将酶制剂加入液体制剂中。
24.酶制剂可以进一步包含选自由以下组成的组的其他酶(一种或多种)：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、dna酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，以及选自由以下组成的组的合适添加剂：稳定所包含的酶的化合物如酶稳定剂和稳定制备物的化合物如防腐剂。
25.序列
26.本文使用的序列如下：
27.seq id no:1:编码根据seq id no:2的亲本甘露聚糖酶的多核苷酸序列：
[0028][0029]
以其单字母代码表示的seq id no:2亲本甘露聚糖酶(包括信号序列的490aa)：
[0030][0031]
以其单字母代码表示的seq id no:3包括接头和cbd(碳水化合物结构域)的成熟亲本甘露聚糖酶：
[0032][0033]
发明详述：
[0034]
应理解，如在说明书和权利要求书中所使用的，“一个(a)”或“一种(an)”意指一个或多个(“至少一个”的意义)，这取决于其使用的上下文。
[0035]
此外，应理解，术语“至少”意指该术语所指的项目或参数在一个方向上受到限制，但在一个或多个其他方向上是开放式的。
[0036]
如在下文中所使用的，术语“具有”、“包含”、“含有”或“包括”或其任何任意语法变体以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指代其中除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在另外的特征的情况，又可以指代其中存在一个或多个另外的特征的情况。
[0037]
通过“在一个实施方案中”或类似表达引入的特征旨在作为附加或替代特征，对本发明的替代实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对以这种方式引入的特征与本发明的其他附加或替代或非附加或替代特征的组合的可能性没有任何限制。术语“可以”在本文中优选地涵盖实施方案。
[0038]
如本文所用，术语“约”意指关于在所述术语之后列举的任何数字，存在在其中可以实现技术效果的区间精度。因此，如本文所提及的约优选是指精确数值或所述精确数值附近的
±
15％、优选
±
10％、更优选
±
5％或甚至更优选
±
3％的范围。
[0039]
通常，“酶”是作用于底物并将其转化为产物的催化活性蛋白质或多肽。该反应在本文中可称为酶促转化，其通常发生在酶的“活性位点”处。发挥酶促转化作用的酶是酶促活性的或具有酶促活性。本文中称为“酶”的任何多肽意指具有催化活性的多肽。
[0040]
根据本发明的甘露聚糖酶变体具有甘露聚糖降解活性并且属于酶类别ec 3.2.1.78。在一个实施方案中，甘露聚糖降解活性意指至少一种半乳甘露聚糖的降解。优选地，至少一种半乳甘露聚糖的特征在于甘露糖:半乳糖的比率为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1和/或5:1。
[0041]
甘露聚糖降解活性或甘露聚糖酶活性可以根据本领域已知的标准测试程序来测试。例如：可以将待测试的甘露聚糖酶应用于在包含0.2％azcl半乳甘露聚糖(角豆(carob))的琼脂平板中冲出的4mm直径的孔中，即用于测定内切-1,4-β-d-甘露聚糖酶的底物可从公司megazyme以i-az形式获得(megazyme的互联网地址：http://www.megazyme.com/purchase/index.html)。如mccleary,b.v.(1978).carbohydrate re-search,67(1),213-221中所述，甘露聚糖降解活性可以在液体测定中使用用雷马亮蓝(remazol brilliant blue)染色的角豆半乳甘露聚糖进行测试。用于测试甘露聚糖降解活性的另一种方法是在与如瓜尔豆胶或刺槐豆胶等底物孵育时还原糖的检测
–
参考参见
miller,g.l.use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.analytical chemistry 1959；31:426
–
428。
[0042]
酶是通常通过多肽序列(在本文中也称为氨基酸序列)识别的多肽。多肽序列通常由seq id no.来识别，其根据世界知识产权局(wipo)标准st.25(1998)在本公开所附的序列表中提供，这意味着本文的氨基酸使用其中第一个字母为大写的三字母代码或相应的一个字母表示。
[0043]
多肽通常由多核苷酸编码。多核苷酸通常通过多核苷酸序列和seq id no.来识别，其根据世界知识产权局(wipo)标准st.25(1998)在本公开所附的序列表中提供。
[0044]“亲本”多肽氨基酸序列是用于向序列引入突变(例如通过引入一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其组合)，从而产生亲本多肽氨基酸序列的“变体”的起始序列。亲本包括：用作引入(进一步)变化的起始序列的野生型多肽氨基酸序列或合成产生的多肽氨基酸序列。
[0045]
本发明的甘露聚糖酶变体的亲本多肽可以具有根据seq id no:2或seq id no:3的多肽序列。在本发明的一个方面，亲本多肽具有根据seq id no:2的第31-490位的序列。根据seq id no:2的第31-490位的序列等于seq id no:3。
[0046]“变体多肽”是指氨基酸序列不同于其亲本的酶。
[0047]
当与亲本序列相比时，可以通过它们的“序列同一性”来限定变体多肽序列。“与seq id no:x至少x％相同”的酶或多肽意指与根据seq id no:x的多肽序列相比时具有x％相同的多肽序列的酶或多肽，其中seq id no:x意指根据本发明的序列。在一个实施方案中，seq id no:x选自seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4。
[0048]“与seq id no:y至少y％相同”的多核苷酸意指与根据seq id no:y的多核苷酸序列相比时具有y％相同的多核苷酸序列的多核苷酸，其对应于本文的seq id no:1。
[0049]
序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”提供。为了计算序列同一性，在第一步中必须进行序列比对。
[0050]
根据本发明，通过使用needleman和wunsch的算法(j.mol.biol.(1979)48，第443-453页)产生比对。优选地，将程序“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(emboss))用于本发明的目的，使用程序默认参数(多核苷酸：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5和矩阵＝ednafull；多肽：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5和矩阵＝eblosum62)。
[0051]
在比对两个序列后，在第二步中，从产生的比对确定同一性值。
[0052]
在一个实施方案中，通过将相同残基数除以显示本发明的相应序列的完整长度的比对区域的长度乘以100来计算％同一性：％-同一性＝(相同残基/显示本发明的相应序列的完整长度的比对区域的长度)*100。
[0053]
多肽
[0054]
本发明的多肽与seq id no:2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，并且其中多肽具有甘露聚糖降解活性。在本发明的一个方面，根据本发明的甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2的第31-490位或根据seq id no:3的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同，并且其中多肽具有甘露聚糖降解活性。
[0055]
本发明的甘露聚糖酶变体可以进一步包含一个或多个保守取代，这表示一个氨基酸由相似的氨基酸取代。根据本发明的相似氨基酸定义如下：
[0056]
氨基酸a相似于氨基酸s；氨基酸d相似于氨基酸e和n；氨基酸e相似于氨基酸d、k和q；氨基酸f相似于氨基酸w和y；氨基酸h相似于氨基酸n和y；氨基酸i相似于氨基酸l、m和v；氨基酸k相似于氨基酸e、q和r；氨基酸l相似于氨基酸i、m和v；氨基酸m相似于氨基酸i、l和v；氨基酸n相似于氨基酸d、h和s；氨基酸q相似于氨基酸e、k和r；氨基酸r相似于氨基酸k和q；氨基酸s相似于氨基酸a、n和t；氨基酸t相似于氨基酸s；氨基酸v相似于氨基酸i、l和m；氨基酸w相似于氨基酸f和y；氨基酸y相似于氨基酸f、h和w。
[0057]
在一个实施方案，根据本发明的甘露转化酶变体是“成熟的多肽”，意指酶的最终形式，包括任何后修饰、糖基化修饰、磷酸化、截短、n末端修饰、c-末端修饰、信号序列缺失。成熟多肽可以根据表达系统、载体、启动子和/或生产过程而变化。根据本发明的成熟的甘露糖酶变体可以与根据seq id no:2的第31-490位的序列至少75％相同，或者可以与根据seq id no:3的序列至少75％相同。
[0058]
本发明提供了与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同的多肽，其包含一个或多个选自n341、f346、t348、e349、s352、g356和d379的氨基酸取代，其中编号根据seq id no:2。至少一个氨基酸取代可以选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349t/s/g/d、s352n/g、g356y/v/t/q/h/c和d379v。
[0059]
在本发明的一个方面，根据本发明的甘露聚糖酶变体在以下位置t32、n37、f61、i80、y90、t91、k99、s100、v125、l150、d179、s183、y196、d206、d229、n258、i323、n345、v358、s370、n383、n384、q423、f435、d459、n461、i463和v482包含一个或多个保守氨基酸取代，优选选自至少一个以下的取代：t32s、n37s、f61y、i80v、y90w、t91s、k99r、s100n、v125i、l150i、d179n、s183n、y196f、d206e、d229n、n258d、i323l、n345d、v358i、s370a、n383s、n384s、q423k、f435y、d459n、n461s、i463v和v482l，其中甘露聚糖变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自t32s、t91s、k99r、s100n、v125i、d179n、s183n、y196f、d206e、n258d、v358i、s370a、q423k、d459n、n461s和v482l的取代的组合。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自t32s、n37s、f61y、i80v、y90w、k99r、s100n、v125i、l150i、d179n、s183n、y196f、d206e、d229n和i323l的取代的组合。优选地，根据本发明的甘露聚糖酶变体包含一个或多个选自n37s、f61y、i80v、y90w、t91s、l150i、d229n、n258d、i323l、n345d、v358i、s370a、n383s、n384s、q423k、f435y、d459n、n461s、i463v和v482l的保守氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。
[0060]
在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体在以下位置处包含一个或多个氨基酸取代：n39t、t45n、d64q、s133d、e140s、s168d、a173v、q202n、s305d、h332d、g335d、a360g、a365v、d372g、q381n、s391y、f398l、k433t、e438g、i449t和k475n，其中甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自s133d、s168d、a173v、q202n、s305d、h332d、g335d、a365v、d372g、q381n、s391y、e438g和k475n的取代的组合。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自n39t、t45n、d64q、s133d、e140s和s168d的取代的组合。优选地，根据本发
明的甘露聚糖酶变体包含一个或多个选自a360g和i449t的氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。
[0061]
在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体在其多肽序列内包含一个或多个保守氨基酸区域。本文的保守氨基酸区域的特征在于多个连续氨基酸未突变，其中连续氨基酸的数目为3-10、4-10、5至10、6、7、8、9或10个。一个或多个保守氨基酸区域可以选自g76-a77-n78-t79、r81-v83-l84、e115-v116-h117-d118、y134-w135-i136、a154-n155-e156-w157、a191-g192-w193-g194-q195、f218-s219-i220-h221-m222-y223-e224-y225-a226-g227、n236-i237-d238、i249-g250-e251-f252-g253、g259-d260-v261-d262-e263和g276-w277-l278-a279-w280，并且其中编号根据seq id no:2。
[0062]
在本发明的一个方面，与亲本酶相比时，根据本发明的甘露聚糖酶变体具有改善的发酵稳定性。
[0063]
根据本发明的发酵稳定性是通过由发酵产生的由催化结构域、接头和cbd组成的甘露聚糖酶与已被内源性截短的甘露聚糖酶的比例。
[0064]
本文中改善的发酵稳定性意指与亲本酶相比时，根据本发明的甘露聚糖酶变体的发酵稳定性为至少1.5倍、至少1.6倍、至少2倍。
[0065]
在一个实施方案中，发酵稳定性意指在细菌宿主细胞，优选芽孢杆菌属宿主细胞，更优选枯草芽孢杆菌宿主细胞中表达时的发酵稳定性。
[0066]
在一个实施方案中，发酵稳定性意指在35℃至45℃范围内的发酵温度下，优选在37℃的温度下的发酵稳定性。
[0067]
在一个实施方案中，具有改善的发酵稳定性的甘露聚糖酶变体是与seq id no:2至少75％相同的多肽，其在至少两个或更多个选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349t/s/g/d、s352n/g、g356y/v/t/q/h/c和d379v的位置处具有氨基酸取代，其中编号根据seq id no:2。在一个实施方案中，具有改善的发酵稳定性的甘露聚糖酶是与seq id no:2至少75％相同的多肽，其具有
[0068]
(a)一个或多个在选自t348n/g、s352n和d379v的位置处的氨基酸取代，优选结合
[0069]
(b)一个或多个在选自n341f、f346t、t348s/r/m、e349t/s/g/d、s352g和g356y/v/t/q/h/c的氨基酸取代，
[0070]
其中当在(a)中定义的相应位置存在取代时，不存在(b)中定义的氨基酸取代，并且其中编号根据seq id no:2，并且其中多肽具有甘露聚糖降解活性。
[0071]
多核苷酸
[0072]
本发明涉及编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸。多核苷酸编码与seq id no:2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽。在本发明的一个方面中，多核苷酸编码与根据seq id no:3的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽。本发明的多核苷酸可以具有与seq id no:1至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。
[0073]
根据本发明的多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，包含一个或多个选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349t/s/g/d、s352n/g、g356y/v/t/q/h/c和d379v的氨基酸取代，其中编号根据seq id no:2。
[0074]
在一个实施方案中，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码在以下位置处的一个或多个保守氨基酸取代：t32s、n37s、f61y、i80v、y90w、t91s、k99r、s100n、v125i、l150i、d179n、s183n、y196f、d206e、d229n、n258d、i323l、n345d、v358i、s370a、n383s、n384s、q423k、f435y、d459n、n461s、i463v和v482l，其中甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以编码选自t32s、t91s、k99r、s100n、v125i、d179n、s183n、y196f、d206e、n258d、v358i、s370a、q423k、d459n、n461s和v482l的氨基酸取代的组合。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以编码选自t32s、n37s、f61y、i80v、y90w、k99r、s100n、v125i、l150i、d179n、s183n、y196f、d206e、d229n和i323l的取代的组合。优选地，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码一个或多个选自n37s、f61y、i80v、y90w、t91s、l150i、d229n、n258d、i323l、n345d、v358i、s370a、n383s、n384s、q423k、f435y、d459n、n461s、i463v、v482l的保守氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。
[0075]
在一个实施方案中，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码在以下位置处的一个或多个氨基酸取代：n39t、t45n、d64q、s133d、e140s、s168d、a173v、q202n、s305d、h332d、g335d、a360g、a365v、d372g、q381n、s391y、f398l、k433t、e438g、i449t和k475n，其中甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以编码选自s133d、s168d、a173v、q202n、s305d、h332d、g335d、a365v、d372g、q381n、s391y、e438g和k475n的氨基酸取代的组合。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以编码选自n39t、t45n、d64q、s133d、e140s和s168d的取代的组合。优选地，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码选自a360g和i449t的一个或多个氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据seq id no:2或seq id no:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据seq id no:2。
[0076]
在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体在其多肽序列内包含一个或多个保守氨基酸区域。本文的保守氨基酸区域的特征在于多个连续氨基酸未突变，其中连续氨基酸的数目为3-10、4-10、5至10、6、7、8、9或10个。一个或多个保守氨基酸区域可以选自g76-a77-n78-t79、r81-v83-l84、e115-v116-h117-d118、y134-w135-i136、a154-n155-e156-w157、a191-g192-w193-g194-q195、f218-s219-i220-h221-m222-y223-e224-y225-a226-g227、n236-i237-d238、i249-g250-e251-f252-g253、g259-d260-v261-d262-e263和g276-w277-l278-a279-w280，并且其中编号根据seq id no:2。
[0077]
提高发酵稳定性的方法
[0078]
在一个方面，本发明涉及通过在选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349t/s/g/d、s352n/g、g356y/v/t/q/h/c和d379v的氨基酸位置处引入一个或多个氨基酸取代的步骤来增加与seq id no:2或seq id no:3至少75％相同的甘露聚糖酶的发酵稳定性的方法，其中编号根据seq id no:2。优选地，与相应的亲本酶相比时，甘露聚糖酶变体的发酵稳定性增
加至少约50％。
[0079]
在一个实施方案中，增加与seq id no:2或seq id no:3至少75％相同的甘露聚糖酶的发酵稳定性的方法包括以下步骤：在选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349t/s/g/d、s352n/g、g356y/t/h/c和d379v的氨基酸位置处引入一个或多个氨基酸取代，其中编号根据seq id no:2。优选地，与相应的亲本酶相比时，甘露聚糖酶变体的发酵稳定性增加至少100％。
[0080]
在一个实施方案中，增加与seq id no:2或seq id no:3至少75％相同的甘露聚糖酶的发酵稳定性的方法包括在选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349s/g/d、s352g、g356y/t/c和d379v的氨基酸位置处引入一个或多个氨基酸取代的步骤，其中编号根据seq id no:2。优选地，与相应的亲本酶相比时，甘露聚糖酶变体的发酵稳定性增加至少150％。
[0081]
在一个实施方案中，增加与seq id no:2或seq id no:3至少75％相同的甘露聚糖酶的发酵稳定性的方法包括在选自n341f、f346t、t348n/m/g、e349s/g/d、s352g和d379v的氨基酸位置处引入一个或多个氨基酸取代的步骤，其中编号根据seq id no:2。优选地，与相应的亲本酶相比时，甘露聚糖酶变体的发酵稳定性增加至少200％。
[0082]
甘露聚糖酶的产生
[0083]
本发明涉及一种产生根据本发明的甘露聚糖酶变体的方法，其包括步骤
[0084]
(a)通过将包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸的核酸构建体引入宿主细胞中来提供包含异源核酸构建体的宿主细胞，该异源核酸构建体包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸；
[0085]
(b)在有利于多核苷酸表达的条件下培养步骤(a)的重组宿主细胞；和
[0086]
(c)任选地，回收由多核苷酸编码的目的蛋白质。
[0087]
本发明还涉及一种表达根据本发明的甘露聚糖酶变体的方法，其包括步骤
[0088]
(a)通过将包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸的核酸构建体引入宿主细胞中来提供包含异源核酸构建体的宿主细胞，该异源核酸构建体包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸；
[0089]
(b)在有利于多核苷酸表达的条件下培养步骤(a)的重组宿主细胞；和
[0090]
(c)任选地，回收由多核苷酸编码的目的蛋白质。
[0091]
可以“表达”编码多肽的多核苷酸。术语“表达”或“基因表达”意指一个或多个特定基因或特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别意指一个或多个基因或基因构建体转录为结构rna(例如rrna、trna)或mrna，随后后者翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括dna的转录和所得mrna产物的加工。
[0092]
本文的核酸构建体意指单链或双链的核酸分子，其是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或是合成的，其包含一个或多个控制序列。术语“控制序列”意指表达编码本发明的甘露聚糖酶的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸可以是天然的或外来的，或者彼此是天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点的目的，可以向控制序列提供接头。
pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(baccillus thuringiensis)。最优选地，芽孢杆菌细胞选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌。在一个实施方案中，芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
[0098]
本发明提供了用于产生发酵产物的发酵方法，包括步骤
[0099]
a)提供根据本发明的重组宿主细胞，和
[0100]
b)在允许表达编码本发明的甘露聚糖酶的多核苷酸的条件下培养重组宿主细胞。
[0101]
在多核苷酸和多肽的上下文中，术语“异源的”(或外源的或外来的或重组的)在本文中定义为：
[0102]
(a)不是宿主细胞天然的；或
[0103]
(b)是宿主细胞天然的，但因通过改变天然序列的重组dna技术操作宿主细胞dna而包含结构性修饰，例如缺失、取代和/或插入；或
[0104]
(c)是宿主细胞天然的，但因通过重组dna技术(例如更强的启动子)操作宿主细胞dna而引起表达在数量上发生了改变，或者表达是从与天然宿主细胞不同的基因组位置定向的。
[0105]
优选地，本文中的“异源”意指“不是宿主细胞天然的”。
[0106]
在一个方面，本发明涉及表达多核苷酸的宿主细胞，优选芽孢杆菌属，该多核苷酸编码与seq id no:2至少75％相同的多肽，其在选自n341、f346、t348、e349、s352、g356和d379的一个或多个位置处具有氨基酸取代，其中编号根据seq id no:2，并且其中与亲本酶相比时，甘露聚糖酶具有改善的发酵稳定性。至少一个氨基酸取代可以选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349t/s/g/d、s352n/g、g356y/v/t/q/h/c和d379v。
[0107]
在一个实施方案中，表达具有改善的发酵稳定性的根据本发明的甘露聚糖酶变体的宿主细胞包含编码与seq id no:2至少75％相同的甘露聚糖酶变体的多核苷酸，该甘露聚糖酶变体在选自n341f、f346t、t348s/r/n/m/g、e349t/s/g/d、s352n/g、g356y/v/t/q/h/c和d379v的至少两个或更多个位置处具有氨基酸取代，其中编号根据seq id no:2。在一个实施方案中，具有改善的发酵稳定性的甘露聚糖酶是与seq id no:2至少75％相同的多肽，其具有
[0108]
(a)一个或多个在选自t348n/g、s352n、d379v及其组合的位置处的氨基酸取代，优选结合
[0109]
(b)至少一个选自n341f、f346t、t348s/r/m、e349t/s/g/d、s352g和g356y/v/t/q/h/c的氨基酸取代，
[0110]
其中当在(a)中定义的对应位置存在取代时，不存在(b)中定义的氨基酸取代，和
[0111]
其中编号根据seq id no:2，并且其中多肽具有甘露聚糖降解活性。
[0112]
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明的甘露聚糖酶的多核苷酸的基因构建体。如本文所用，“基因构建体”或“表达盒”或“表达构建体”是由至少一个待表达的本发明的多核苷酸序列组成的dna分子，其与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效地连接。通常，表达盒包含三个元件：启动子序列、开放阅读框和3'非翻译区，其在真核生物中通常含有多腺苷酸化位点。
[0113]
另外的调控元件可包括转录以及翻译增强子。
[0114]
也可以将内含子序列添加到5'非翻译区(utr)或编码序列中，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量。表达盒可以是载体的一部分，或者可以整合到宿主细胞的基因组并与其宿主细胞的基因组一起复制。表达盒通常能够增加或减少表达。
[0115]
如本文所用，术语“载体”包括适于携带外来多核苷酸序列以转移至另一细胞或在给定细胞内稳定或瞬时表达的任何种类的构建体。如本文所用，术语“载体”涵盖任何种类的克隆载体，例如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如噬菌体)、噬菌体、杆状病毒、粘粒、f黏粒、人工染色体或和对特定目标宿主具有特异性的任何其他载体。还包括低拷贝数或高拷贝数载体。外来多核苷酸序列通常包含编码序列，其在本文中可称为“目的基因”。目的基因可以包含内含子和外显子，这取决于宿主细胞的来源或目的地的种类。
[0116]
如本文所用的载体可以提供用于在转化到宿主细胞或宿主细胞器中后转录和翻译外来多核苷酸的区段。这样的额外区段可以包括调控核苷酸序列、在特定细胞类型中维持和/或复制所需的一个或多个复制起点、一个或多个可选择的标记、多腺苷酸化信号、用于插入外来编码序列如多克隆位点等的合适位点。一个实例是需要将载体作为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持在细菌细胞中时。合适的复制起点的非限制性实例包括f1-ori和cole1。载体复制而不整合到宿主细胞的基因组，例如作为细菌宿主细胞中的质粒，或将其dna的一部分或全部整合到宿主细胞的基因组并因此导致其dna的复制和表达。
[0117]
可以通过克隆将外来核酸引入载体。克隆可以意指通过合适的手段和方法(例如，限制酶)切割载体(例如，在多克隆位点内)和外来多核苷酸，可以形成在单独的核酸内的拟合结构，其能够使所述外来核酸与载体受控融合。一旦引入载体，包含编码序列的外来核酸便引入(转化、转导、转染等)宿主细胞或宿主细胞器中。可以选择适合于在宿主细胞或宿主细胞器中表达外来多核苷酸序列的克隆载体。
[0118]
如本文所提及，术语“引入”或“转化”涵盖将外来多核苷酸转移到宿主细胞，而与用于转移的方法无关。也就是说，如本文所用的术语“转化”独立于载体、穿梭系统或宿主细胞，并且它不仅涉及本领域已知的转化的多核苷酸转移方法(参见例如sambrook，j.等人(1989)molecular cloning：a laboratory manual第2版，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny)，但其包括任何其他种类的多核苷酸转移方法，例如但不限于，转导或转染。能够随后克隆繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用基因构建体转化，并由此再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用于和最适合被转化的特定物种的克隆繁殖系统而有所不同。在本发明的一个实施方案中，载体用于转化宿主细胞。
[0119]
本发明的多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞中，优选芽孢杆菌属宿主细胞，并且可以保持非整合，例如作为质粒。“稳定转化”意指转化的细胞或细胞器将包含外来编码序列的核酸传递至下一代的细胞或细胞器。通常，稳定转化是由于包含外来编码序列的核酸整合到染色体或作为附加体(单独的核dna片段)引起的。“瞬时转化”意指一旦转化细胞或细胞器在一定时间内表达外来核酸序列
‑‑
大多在一代内。通常，瞬时转化是由于包含外来核酸序列的核酸未整合到染色体或作为附加体。或者，将其整合到宿主基因组。
[0120]
酶通常作为液体浓缩物产生，通常源自发酵液。本文中的“液体酶浓缩物”是指包含至少一种酶的任何含液体酶的产品。在酶浓缩物的上下文中，“液体”涉及在20℃和101.3kpa下的物理外观。
[0121]
液体酶浓缩物可以由固体酶溶解在溶剂中来产生。溶剂可以选自水和有机溶剂。从固体酶溶解在溶剂中得到的液体酶浓缩物可以包含高达饱和浓度的酶量。
[0122]
本文中的溶解意指固态化合物通过与至少一种溶剂接触而液化。溶解意指固态化合物完全溶解，直到在特定溶剂中达到饱和浓度，其中不发生相分离。
[0123]
在本发明的一个方面，酶浓缩物可以基本上不含水，这意味着无明显量的水存在。本文中无明显量的水意指酶浓缩物包含按重量计少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于7％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％的水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言，或不含水。在一个实施方案中，不含水的酶浓缩物意指酶浓缩物不包含明显量的水，但以按重量计30％-80％量包含有机溶剂，前述百分数相对于酶浓缩物的总重量而言。
[0124]
包含水的液体酶浓缩物可称为“含水酶浓缩物”。
[0125]
在一个实施方案中，含水酶浓缩物是含酶溶液，其中固体酶产物已经溶解在水中。在一个实施方案中，“含水酶浓缩物”意指由发酵产生的酶产生的含酶产品。
[0126]
发酵意指在允许重组宿主细胞生长并表达所需蛋白质的合适营养培养基中培养表达所需酶的重组细胞的过程。在发酵结束时，通常收集并进一步加工发酵液，其中发酵液包含液体级分和固体级分。取决于酶是否已经分泌到液体级分，从发酵液的液体级分或从细胞裂解物回收所需的蛋白质或酶。使用本领域技术人员已知的方法回收所需的酶。从发酵液回收蛋白质或酶的适合方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。
[0127]
发酵产生的含水酶浓缩物可包含按重量计0.1％至40％、或按重量计0.5％至30％、或按重量计1％至25％、或按重量计3％至25％、或按重量计5％至25％范围的酶量，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。
[0128]
发酵产生的含水酶浓缩物可包含按重量计多于约50％、按重量计多于约60％、按重量计多于约70％或按重量计多于约80％的量的水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。在一个实施方案中，由发酵产生的水性酶浓缩物包含按重量计约50％至80％，或按重量计约60％至70％范围内的量的水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。由发酵产生的水性酶浓缩物可包含残余组分，如源自发酵培养基的盐、源自生产宿主细胞的细胞碎片、生产宿主细胞在发酵过程中产生的代谢物。在一个实施方案中，残余组分以按重量计少于30％、按重量计少于20％、按重量计少于10％或按重量计少于5％的量包含于液体酶浓缩物中，前述百分数均相对于含水酶浓缩物的总重量而言。
[0129]
如果保留在水性环境中，酶趋向于失去酶活性，因此将其转化为无水形式是常规做法：水性浓缩物可以例如在载体材料存在下冻干或喷雾干燥以形成聚集体。通常，固体酶产物需要在使用前“溶解”。为了稳定液体产物中的酶，通常使用酶抑制剂，优选可逆酶抑制剂，以暂时抑制酶活性直到释放酶抑制剂。
[0130]
本发明的甘露聚糖酶的用途
[0131]
本发明涉及根据本发明的甘露聚糖酶用于降解含甘露聚糖材料中的甘露聚糖的用途。
[0132]
在一个实施方案中，甘露聚糖降解意指至少一种半乳甘露聚糖的降解。优选地，至少一种半乳甘露聚糖的特征在于甘露糖:半乳糖的比率为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1和/或5:1。
[0133]
根据本发明的甘露聚糖酶变体优选在选自≤60℃、≤40℃和≤25℃的温度下发挥甘露聚糖降解活性。
[0134]
酶制剂
[0135]
本发明的酶制剂优选是液体。在酶制剂的上下文中，“液体”涉及在20℃和101.3kpa下的物理外观。
[0136]
本发明的酶制剂包含含有至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体的液体酶浓缩物。本发明的酶制剂仅包含有效稳定酶制剂或其中包含的酶的组分，例如选自至少一种酶稳定剂、至少一种稳定液体酶制剂本身的化合物和至少一种溶剂。
[0137]
在一个方面中，本发明提供了液体酶制剂，其包含与seq id no:2至少75％相同的根据本发明的甘露聚糖酶变体，优选与根据seq id no:3的序列至少75％相同的甘露聚糖酶，至少一种稳定液体酶制剂本身的化合物，至少一种溶剂，和任选地至少一种酶稳定剂。
[0138]
本发明的液体酶制剂优选不含表面活性剂。在一个实施方案中，不含表面活性剂意指本发明的酶制剂中不包含主动添加的表面活性剂。这意味着本发明的酶制剂可以包含表面活性剂，该表面活性剂源自酶浓缩物所源自的发酵过程(作为副产物)。
[0139]
本发明的液体酶制剂优选不含络合剂。在一个实施方案中，不含络合剂意指本发明的酶制剂中不包含主动添加的络合剂。这意味着本发明的酶制剂可以包含络合剂，该络合剂源自酶浓缩物所源自的发酵过程(作为副产物)。
[0140]
在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂不含表面活性剂和不含络合剂。
[0141]
稳定液体酶制剂本身的化合物
[0142]
稳定液体酶制剂本身的化合物意指除以有效地确保储存稳定性的量建立液体制剂的储存稳定性所需的酶稳定剂之外的任何化合物。
[0143]
对于本领域技术人员而言，在液体制剂的情况下的储存稳定性通常包括产品外观和剂量均匀性的方面。
[0144]
产品的外观受产品的ph和化合物如防腐剂、抗氧化剂、粘度调节剂、乳化剂等的存在的影响。
[0145]
剂量的均匀性通常与产品的同质性有关。
[0146]
本发明的酶制剂可以是碱性的或呈现出中性或微酸性的ph值。酶制剂的ph可以在5-12的范围内，优选在6-11的范围内，更优选在选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内。
[0147]
本发明的液体酶制剂可包含至少一种防腐剂。防腐剂以有效防止液体酶制剂，优选水性酶制剂的微生物污染的量添加。
[0148]
在一个方面中，本发明涉及一种保护根据本发明的水性酶制剂免受微生物污染或生长的方法，该方法包括添加相对于包含根据本发明的甘露聚糖酶变体的水性酶浓缩物选自由以下组成的组的抗微生物剂：
[0149]
·
浓度为0.01％至5％、更优选0.1％至2％的2-苯氧乙醇，浓度为2ppm至5000ppm、更优选10ppm至2000ppm的戊二醛，
[0150]
·
浓度为5ppm至5000ppm、更优选20ppm至1000ppm的2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇，
[0151]
·
浓度为0.01％至3％，更优选0.05％至0.5％的酸形式的甲酸或其盐，和
[0152]
·
浓度为0.001％至1％，更优选0.002％至0.6％的4,4'-二氯2-羟基二苯醚。
[0153]
在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂不含防腐剂，这意味着包含的防腐剂的
量少于1ppm。在一个实施方案中，“不含防腐剂”意指本发明的酶制剂中不包含主动添加的防腐剂。这意味着酶制剂可包含来自酶浓缩物所来源的发酵过程的防腐剂(作为副产物)。
[0154]
溶剂
[0155]
在一个实施方案中，本发明的酶制剂是水性的，包含按重量计5％至95％的范围内、按重量计5％至30％的范围内、按重量计5％至25％范围内或按重量计20％至70％的范围内的量的水，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。
[0156]
在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含至少一种选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、乙二醇丙醚和苯氧乙醇，优选乙醇、异丙醇或丙二醇的有机溶剂。另外，本发明的酶制剂可以含有至少一种选自如2-丁氧基乙醇、异丙醇、d-柠檬烯等化合物中的有机溶剂。
[0157]
在优选的实施方案中，本发明的酶制剂包含至少一种水混溶性有机溶剂。本文中的水混溶性意指有机溶剂在水中以所有比例混合，形成均匀溶液的性质。优选地，至少一种水混溶性溶剂选自乙醇、异丙醇或1,2-丙二醇。
[0158]
在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含
[0159]
(a)在约20％至50％的范围内的量的水，和
[0160]
(b)至少一种有机溶剂，其量按重量计为30％至60％的范围内，或按重量计为45％至55％的范围内，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。
[0161]
在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含相对于酶制剂的总重量按重量计为0％至20％范围内的量的有机溶剂。优选地，本发明的酶制剂包含按重量计为约30％至80％范围内的量的水和至少一种按重量计少于10％、按重量计少于5％或按重量计少于1％的量有机溶剂，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。
[0162]
在一个实施方案中，酶制剂包含按重量计为5％至15％的量的水并且没有明显量的有机溶剂，例如按重量计1％或更少，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。
[0163]
酶稳定剂
[0164]
本文的酶的稳定性涉及时间过程中的稳定性(例如储存稳定性)、热稳定性、ph稳定性和化学稳定性。本文中的术语“酶稳定性”优选地涉及作为时间例如在储存或操作期间的函数的酶活性的保留。酶稳定剂使酶稳定在液体，优选水环境中，这意味着它减少或避免了酶活性随着时间的推移而丧失。
[0165]
在一个实施方案中，至少一种酶，优选至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体，通过酶制剂中钙和/或镁离子的水溶性源的存在而稳定。在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自多元醇或水溶性盐。
[0166]
多元醇可选自含有2至6个羟基的多元醇。合适的实例包括二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,4-丁二醇、1,2-戊二醇、1,6-己二醇、乙二醇、己二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、果糖和乳糖。
[0167]
水溶性盐可选自如nacl或kcl的盐，以及乳酸和甲酸的碱金属盐。
[0168]
在本发明的一个实施方案中，水溶性盐可以选自最终组合物中的锌(ii)、钙(ii)和/或镁(ii)离子的水溶性来源，为酶提供这样的离子，以及其他金属离子(例如钡(ii)、钪(ii)、铁(ii)、锰(ii)、铝(iii)、锡(ii)、钴(ii)、铜(ii)、镍(ii)和氧钒(iv))。优选地，水溶
性盐选自cacl2和mgcl2。
[0169]
酶制剂可以包含除根据本发明的甘露聚糖酶变体之外的一种或多种其他酶，这些酶选自由以下组成的组：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、不同于根据本发明的甘露聚糖酶变体的甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、dna酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶。
[0170]
在一个实施方案中，酶制剂还包含蛋白酶，优选丝氨酸蛋白酶(ec 3.4.21)，更优选枯草杆菌蛋白酶ec 3.4.21.62；和/或脂肪酶，优选三酰基甘油脂肪酶(ec 3.1.1.3)，更优选疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。优选地，所述酶制剂包含至少一种选自含硼化合物、多元醇、肽醛、其他稳定剂及其混合物的酶稳定剂。
[0171]
含硼化合物可选自硼酸或其衍生物和亚硼酸或其衍生物，如芳基亚硼酸或其衍生物、其盐及其混合物。硼酸在本文中可称为原硼酸。
[0172]
在一个实施方案中，含硼化合物选自芳基亚硼酸及其衍生物组成的组。在一个实施方案中，含硼化合物选自由苯亚硼酸(bba)(其也称为苯基亚硼酸(pba))，其衍生物及其混合物组成的组。
[0173]
在一个实施方案中，苯基-亚硼酸衍生物选自由以下组成的组：4-甲酰基苯基亚硼酸(4-fpba)、4-羧基苯基亚硼酸(4-cpba)、4-(羟甲基)苯基亚硼酸(4-hmpba)和对甲苯基亚硼酸(p-tba)。
[0174]
在一个实施方案中，酶制剂，优选另外包含枯草杆菌蛋白酶的那些，包含相对于酶制剂的总重量按重量计为约0.1-2％的至少一种含硼化合物。优选地，酶制剂包含相对于酶制剂的总重量按重量计为约0.15-1％、或0.2-0.5％、或约0.3％的至少一种含硼化合物。更优选地，酶制剂包含相对于酶制剂的总重量按重量计为约0.3％的4-fpba。
[0175]
在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自肽稳定剂。至少一种肽稳定剂可以选自式(d)的化合物：
[0176][0177]
式(b)中的r1、r2、r3、r4、r5和z定义如下：
[0178]
r1、r2和r3各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选取代的c
1-8
烷基、任选取代的c
2-6
烯基、任选取代的c
1-8
烷氧基，任选取代的3至12元环烷基和任选取代的6至10元芳基；或其中r1、r2和r3各自独立地选择为
–
(ch2)
3-，其也连接至
–
nh-c(h)-的氮原子，使得
–
n-c(h)r
1,2或3-形成一个5元杂环；
[0179]
r4和r5各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选取代的c
1-8
烷基、任选取代的c
2-6
烯基、任选取代的c
1-8
烷氧基、任选取代的c
1-4
酰基、任选取代的c
1-8
烷基苯基(例如苄基)和任选取代的6至10元芳基；或其中r4和r5连接形成任选取代的5或6元环；
[0180]
z选自氢、n末端保护基团和一个或多个任选地包含n末端保护基团的氨基酸残基。
[0181]
在优选的实施方案中，根据式(d)的肽稳定剂的特征在于
[0182]
·
r1是使得nh-chr
1-co是val的l或d-氨基酸残基的基团，r2是使得nh-chr
2-co是ala的l或d-氨基酸残基的基团，并且r3是使得nh-chr
3-co是leu的l或d-氨基酸残基的基团；和
[0183]
·
n末端保护基团z选自苄氧基羰基(cbz)、对甲氧基苄基羰基(moz)、苄基(bn)、苯甲酰基(bz)、对甲氧基苄基(pmb)、对甲氧基苯基(pmp)、甲酰基、乙酰基(ac)、甲氧基、烷氧基羰基、甲氧基羰基、芴基甲氧基羰基(fmoc)或叔丁氧基羰基(boc)；优选地，n末端保护基团z是苄氧基羰基(cbz)。
[0184]
在一个实施方案中，酶制剂，优选另外包含枯草杆菌蛋白酶的那些,包含相对于酶制剂的总重量按重量计约0.1-2％的至少一种肽稳定剂。优选地，酶制剂包含相对于酶制剂的总重量按重量计约0.15-1％、或0.2-0.5％或约0.3％的至少一种肽稳定剂。
[0185]
甘露聚糖酶应用
[0186]
在一方面，本发明涉及根据本发明的甘露聚糖酶变体被配制成用于洗衣和硬表面清洁的洗涤剂制剂如i&i和家庭护理制剂中的用途，其中根据本发明的至少一种甘露聚糖酶变体和至少一种洗涤剂组分在一个或多个步骤中以无特定顺序与一种或多种洗涤剂组分混合。
[0187]
在一个实施方案中，制剂的ph在6-11的范围内，更优选在选自6-10、7-12、7-9、8-12、8-10和7.5-8.5的范围内。在一个实施方案中，制剂是洗涤剂制剂，优选液体洗涤剂制剂。
[0188]
根据本发明的洗涤剂制剂包含至少一种本发明的甘露聚糖酶和一种或多种洗涤剂组分。所选择的组分(一种或多种)取决于所需的洗涤或清洁应用和/或洗涤剂制剂的物理形式。
[0189]
术语“洗涤剂组分”在本文中定义为意指适用于洗涤剂制剂的任何类型的成分，例如表面活性剂、助洗剂、聚合物、漂白体系。任何本领域已知的承认其已知特性的组分(一种或多种)都是根据本发明的合适的洗涤剂组分(一种或多种)。洗涤剂组分在一个实施方案中意指当以有效量存在时提供洗涤或清洁性能或有效帮助加工(在加工、储存和使用期间保持物理特性；例如流变改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的组分。
[0190]
通常，洗涤剂制剂是超过两种洗涤剂组分的复合制剂。
[0191]
洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中可以具有多于一种功能，因此在本文特定功能的上下文中提及的任何洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中也可以具有另一种功能。特定洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中的功能通常取决于其在洗涤剂制剂中的量，即洗涤剂组分的有效量。
[0192]
术语“有效量”包括提供有效污渍去除和有效清洁条件(例如ph、发泡量)的单个组分的量，有效提供光学益处(例如荧光增白、染料转移抑制)的某些组分的量和有效帮助加工(在加工、储存和使用过程中保持物理特性；例如流变改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的某些组分的量。
[0193]
在一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂制剂是多于两种洗涤剂组分的制剂，其中至少一种组分可有效去除污渍，至少一种组分可有效提供最佳清洁条件，以及至少一种组分可有效保持洗涤剂的物理特性。
[0194]
单独的洗涤剂组分和在洗涤剂制剂中的用途是本领域技术人员已知的。合适的洗涤剂组分尤其包含表面活性剂、助洗剂、聚合物、碱、漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、水溶助长剂和腐蚀抑制剂。进一步的实例描述在例如“complete technology book on detergents with formulations(detergent cake,dishwashing detergents,liquid&paste detergents,enzyme detergents,cleaning powder&spray dried washing powder)”,engineers india research institute(eiri),第6版(2015)。本领域技术人员的另一本参考书可以是“detergent formulations encyclopedia”,solverchem publications,2016。
[0195]
根据本发明的甘露聚糖酶变体优选在选自≤60℃、≤40℃和≤25℃的洗涤或清洁温度下发挥甘露聚糖降解活性。在本文洗涤或清洁的上下文中，甘露聚糖降解活性涉及其去除含甘露聚糖污渍的能力。
[0196]
在一个方面，本发明提供了一种通过使至少一种包含甘露聚糖的污渍与本发明的甘露聚糖酶接触的步骤去除包含甘露聚糖的污渍的方法。甘露聚糖酶在5-12或6-11范围内的ph，更优选在6-10或7-9或7-12或8-12或8-10范围内的ph，并且最优选在7.5-8.5范围内的ph下具有甘露聚糖降解活性。在所述ph下，甘露聚糖酶显示出对包含甘露聚糖的污渍的洗涤性能。优选地，该方法是一种在≤60℃，优选在约5-60℃的范围内，优选在约5-40℃的范围内，更优选在约10-40℃的范围内的温度下去除包含甘露聚糖的污渍的方法。
实施例
[0197]
实施例1：甘露聚糖酶变体的表达和纯化
[0198]
由genscript(new jersey,usa)合成基因并克隆到芽孢杆菌表达载体中。将从genscript获得的构建体作为序列确认的质粒dna，并转化到枯草芽孢杆菌中。将5μl 20-200ng/μl的质粒dna添加到500μl新鲜制备的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，并在37℃下孵育3.5小时。随后将细胞铺板到lb+50ug/ml卡那霉素琼脂板上，并在37℃下生长过夜。为了确认枯草芽孢杆菌中甘露聚糖酶的表达，通过菌落pcr和测序筛选得到的菌落。在pcr之前，每个菌落在含有20mm dtt和0.5mg/ml蛋白酶k的缓冲液中在55℃下裂解5分钟，然后在95℃下裂解6分钟。使用1μl裂解细胞和takara ex taq(takara目录号rr001)聚合酶进行20μl pcr反应如下：在98℃初始变性3分钟、30个循环的变性、退火和分别在95℃下延伸10秒、55℃下延伸30秒和72℃下延伸2.5分钟。最后在72℃下延伸5分钟完成pcr反应。甘露聚糖酶的表达例如以微量滴定板形式进行。在30℃和1000rpm搅拌下进行发酵约48小时。最终的发酵液在4℃下以2500xg离心15分钟以获得无细胞上清液。使用自动毛细管凝胶电泳装置；带有ht proteinexpress和ht protein express reagent试剂盒的gx ii(perkinelmer,usa)评估蛋白质定量。使用regular sensitivity ht protein express 200测定法确定蛋白质纯度和定量，并使用gx reviewer 5.3软件进行分析。分子量确定是通过使用蛋白质标准品的包围梯(作为ht protein express试剂盒的一部分)来指定峰的mw和定量的labchip软件或使用已知的蛋白质标准品和仪器分析软件内的“滴度”功能，或使用源自labchip的一组已知浓度的蛋白质标准品的峰面积，生成标准曲线和目的蛋白质的定量结果进行的。
[0199]
实施例2：甘露聚糖酶表达的表达
[0200]
甘露聚糖酶的表达在384孔深孔板中完成。在37℃和1000rpm搅拌下进行发酵约48小时。最终的发酵液在4℃下以2500xg离心15分钟以获得无细胞上清液。
[0201]
使用自动毛细管凝胶电泳装置；带有ht proteinexpress和ht protein express reagent试剂盒的gx ii(perkinelmer,usa)评估蛋白质定量。使用regular sensitivity ht protein express 200测定法确定蛋白质纯度和定量，并使用gx reviewer 5.3软件进行分析。分子量确定是通过使用蛋白质标准品的包围梯(作为ht protein express试剂盒的一部分)来指定峰的mw和定量的labchip软件或使用已知的蛋白质标准品和仪器分析软件内的“滴度”功能，或使用源自labchip的一组已知浓度的蛋白质标准品的峰面积，生成标准曲线和目的蛋白质的定量结果进行的。
[0202]
甘露聚糖酶变体的降解稳定性通过计算全长酶的量以及全长甘露聚糖酶的百分比(全长的量除以全长甘露聚糖酶和观察到的降解产物(一种或多种)的总和乘以100)来确定。
[0203]
表ex2：与亲本酶相比时，具有如表中所示的单点突变的甘露聚糖酶变体的发酵稳定性
[0204]