具有固有颜色和特性的生物可降解纺织纤维

具有固有颜色和特性的生物可降解纺织纤维
1.本技术要求于2020年3月24日提交的美国临时专利申请第62/994,263号的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。
2.在整个本技术中，引用了各种公开案，包括在括号中引用的公开案。本技术中以整体提及的所有公开案的公开内容在此通过引用并入本技术中，以便提供对本发明所涉及的领域和可与本发明一起使用的领域中的特征的额外描述。
3.本发明是在国家科学基金会(national science foundation)授予的1420634下由政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
4.本技术涉及一种至少部分基于重组表达蛋白质形成的生物聚合物组合物，所述重组表达蛋白质由源蛋白质的dna编码序列(其可任选地被修饰以包含一个或多个增强所述重组表达蛋白质的交联能力的标签)表达，且更具体地，涉及适用于获得例如生物可降解纺织品的这种生物聚合物组合物。生物可降解纺织品可用于形成产品，包括(但不限于)用于衣服、内部用途、绷带、纱布、服装用纺织纤维、配饰、工业应用、内饰、生物塑料和其它用途的织物和针织物。


背景技术：

5.公众对于时尚对环境影响的认识不断提高，推动所述行业转向可持续的商业模式。一些行业领导者是可持续服装联盟(sustainable apparel coalition)和全球时尚议程(global fashion agenda)的成员，除了与政策制定者合作为循环时尚系统开发更广泛的框架外，还衡量了他们在整个价值链中对环境和社会劳动的影响。为了减少对环境的影响，品牌正在积极寻找传统纤维的可持续原材料替代品。
6.传统的纺织品生产严重依赖于石化产品、畜牧业和农业——全球co2排放的最大工业贡献者。时尚产业是气候变化的最大贡献者之一，每年产生12亿吨co2排放，并且是全球最大的微塑料污染唯一来源(快时尚的代价(the price of fast fashion).自然气候变化(nature clim change),8:1(2018)；defalco等人,科学报告(scientific reports)(2019)9:6633)。事实上，合成纺织品的机洗造成海洋中23％的微塑料污染。
7.纺织产业也是地球上化学强度最高、生态毒性最强的产业之一，也是仅次于农业的第二大工业水污染来源，无论是在污水产生量还是毒性方面(sen s,demirer gn.水研究(water research)2003,37(8)1868-1878；ben mansour h等人,国际环境科学与污染研究(environmental science and pollution research international)(2012),数字对象标识符(doi)10.1007/s11356-012-0802-7；rita kant,自然科学(natural science),4,1(2012),17027)。纺织品染整处理造成20％的全球水浪费(r.kirchain等人,可持续服装材料/材料系统实验室(sustainable apparel materials/materials systems laboratory)(2015))。因此，纺织品生产、整理和报废影响是对生物多样性的主要威胁，生物多样性是生态系统对气候变化影响的最大复原力。
8.为了减少时尚对环境的影响，品牌正在积极寻找传统纤维的原材料替代品。随着对可持续原材料的需求不断增长，许多替代品被引入市场，包括再生pet(recycled pet)、可持续生产的再生纤维素纤维、再生羊毛(recycled wool)和新兴生物材料。然而，许多生物材料仍依赖于传统纺织工艺，这可能是有毒和耗水的。纤维替代品(例如再生聚酯(recycled polyester))经过大量加工，依赖合成染料，不可生物降解，并且释放微塑料。


技术实现要素：

9.在产生生物纺织材料的方法中，获得纯化的重组表达蛋白质，且蛋白质的dna编码序列可任选地被修饰以包含一个或多个各自增加蛋白质的交联能力的标签。转谷氨酰胺酶可用作酶以增强生物聚合物组合物中重组表达蛋白质与重组表达蛋白质的另一单元或另一组成蛋白质的交联。如所论述，可通过使用此类生物聚合物组合物来形成生物纺织材料，所述生物聚合物组合物包括其中组成蛋白质的交联已得到增强的组成蛋白质，且以此方式获得的生物纺织材料可表现出与重组表达蛋白质相关的功能特性。举例来说，蛋白质可酶促交联成纤维或薄膜，且功能特性可以是例如拉伸、硬度、颜色、防水、弹性等中的一个或多个。
10.在一个实施例中，生物纺织材料可包括多个纤维或可由其形成，各纤维通过使用生物聚合物组合物形成，所述生物聚合物组合物包括与重组表达蛋白质的另一单元或另一组成蛋白质交联的重组表达蛋白质。添加到重组表达蛋白质的被修饰dna编码序列中的标签增强纤维形成。
11.在另一实施例中，生物纺织材料可包括由交联组合物形成的多个薄膜或可由其形成，其中添加到重组表达蛋白质的被修饰dna编码序列中的标签增强薄膜形成。
12.举例来说，重组表达蛋白质可与明胶蛋白质交联，所述明胶蛋白质形成生物纺织材料的填充材料(bulking material)。在另一实例中，重组表达蛋白质与纤维素蛋白质或纤维素蛋白质复合物交联，所述纤维素蛋白质或纤维素蛋白质复合物形成生物纺织材料的填充材料。另一方面，重组表达蛋白质可替代地与重组表达蛋白质的所述另一单元交联，且重组表达蛋白质的多个交联单元形成生物纺织材料的填充材料。
13.根据另一实施例，在产生生物纺织材料的方法中，获得包含纯化的源蛋白质的生物聚合物组合物。源蛋白质的分子彼此交联或与生物聚合物组合物的另一组分交联。生物纺织材料可由交联的生物聚合物组合物产生，使得生物纺织材料表现出与纯化的源蛋白质相关的功能特性。举例来说，蛋白质可化学或酶促交联成纤维或薄膜，且功能特性可以是例如拉伸、硬度、颜色、防水、弹性等中的一个或多个。
附图说明
14.图1a：刚挤出后的明胶纤维。图1b：24小时后的明胶纤维。
15.图2a：在1％转谷氨酰胺酶浴中挤出的gfp+明胶。图2b：挤出后干燥的gfp纤维，保留蛋白质的颜色。图2c：准备用于机械测试的挤出的gfp+明胶纤维样品。图2d：在di水中保留过夜的gfp+明胶纤维，第二天的照片。
16.图3a至3e：明胶和在1％转谷氨酰胺酶凝固浴中交联的明胶-gfp蛋白质纤维的机械性能，包括杨氏模量(young's modulus)(图3a)、屈服强度(图3b)、韧性(图3c)、极限拉伸
应力(图3d)和延展性(图3e)。图3f：蛋白质工程化纤维与algiknit和细菌纤维素的比较。可通过用变速拉力电机从挤出注射器中拉出纤维来改进延展性和挤出程序。
17.图4a：设计和3d打印的线轴。图4b：编码用于为纤维挤出提供拉力的变速伺服电机的电路。图4c：机械纤维卷绕所基于的流体动力学和机械辅助挤出程序的示意图。根据wijesina,“弹性聚氨酯长丝的流体动力学和机械辅助湿法纺丝(hydrodanymically and mechanically assisted wet spinning of elastometric polyurethane filaments)”,2012年修改得到。
18.图5a：由gfp制成的针织布样的荧光。图5b：含有红色和蓝色荧光蛋白质的复合蛋白质纤维。
19.图6a：gfp:明胶与algiknit和细菌纤维素的拉伸测试比较。图6b：n＝12种gfp:明胶纤维(彩色曲线)的拉伸测试，显示有限的挤出型材控制导致样品间的不一致。
20.图7：按照表1和表2中列出的浓度，在转谷氨酰胺酶中流延的gfp:明胶和rfp:明胶2cm直径薄膜。
21.图8：对于针对表1(a组-mooglue)和表2(b组-anjimoto)中显示的gfp:明胶比率的不同转谷氨酰胺酶来源，在转谷氨酰胺酶浴中流延的gfp+明胶薄膜浸泡24小时后pbs溶液中的蛋白质浓度。试验2表示以表2中所示比率流延的n＝3个薄膜的平均值。pbs溶液中较低的蛋白质浓度表明薄膜中的交联程度较高。
22.图9a：浸没在1.57ml浓度为3.19mg/ml的gfp溶液中的纯化细菌纳米纤维素(bnc)薄层。图9b：24小时后从溶液中取出的经gfp处理的bnc薄层。在冲洗样品并浸入pbs溶液中24小时后，颜色保持不变。
23.图10a：细菌纤维素(bc，黑色曲线)和bc/gfp复合物(绿色曲线)的ftir光谱。图10b：图10a中所示的ftir光谱的部分放大图。
24.图11a：在40℃下烘烤一小时后不成功的mcherry-转谷氨酰胺酶薄膜。图11b：在蒸馏水中24小时后，mcherry分散于溶液中且水凝胶薄膜溶解。图11c：在38℃下烘烤过夜后不成功的gfp-转谷氨酰胺酶胶凝。图11d：在38℃下烘烤过夜后不成功的gfp-转谷氨酰胺酶胶凝。未观测到交联。
25.图12a：根据一个实施例的用于产生生物纺织材料的方法的方案图。图12b：根据另一实施例的用于产生生物纺织材料的方法的方案图。图12c：生物材料纤维形成的简化方案图。
26.图13a至13d：生物薄膜(图1a)和纤维(图1b)中保留的固有颜色(蛋白质结构和功能)。图13a：固定在浸入水中的细菌纳米纤维素中不同时间点的rfp和gfp的酰胺i和ii的傅里叶变换红外光谱(ftir)数据。图13b：水性环境中的纤维颜色稳定性：在水中24小时后用uv-vis测量的荧光蛋白质共振强度。图13c：生物材料蛋白质纤维，其中工程化蛋白质包括gfp(绿色)和rfp(粉红)且在挤出到凝固浴中时与明胶酶促交联。图13d：通过将rfp添加到对uv敏感的蓝色fp中(插图)，在挤出到凝固浴中时与明胶酶促交联而产生的紫色生物材料(“werewool”)针织布样。
27.图14a至14e：随评估为bnc中的荧光蛋白质共振强度的蛋白质电荷而变化的颜色吸收和色牢度，包括：(图14a)并入bnc中的蛋白质浓度；和(图14b)将fp-bnc样品浸没于蒸馏h2o中24小时后损失到溶液中的fp浓度。数据表示为平均值(n＝5)。图14c：随经测量以告
知纤维加工参数的ph而变化的工程化成具有不同端基/电荷的gfp的稳定性，表示为各蛋白质的uv-vis吸收共振的百分比。图14d：随经测量以告知纤维加工参数的ph而变化的工程化成具有不同端基/电荷的mcherry的稳定性，表示为各蛋白质的uv-vis吸收共振的百分比。图14e：挤出到cacl2凝固浴中的蛋白质-多糖复合物(fp/乳清/海藻酸盐)中具有来自gfp(绿色)和mscarlet(粉红色)的颜色的werewool纤维的照片。
28.图15a至15d：用傅里叶变换红外光谱(ftir)评估的蛋白质酶促交联的化学机制和光谱指纹。图15a：在凝固浴中通过1％ tg酶促交联或在流延薄膜或挤出纤维之前直接并入蛋白质纺液中的分离大豆蛋白质(spi)以及其主要球状亚基7s和11s的ftir。7s+tg纺液组中酰胺iii的右移指示7s的线性化学结构。相比之下，11s表现出有利于芳香族化学结构的光谱。4％w/v cacl2中的spi-亚基分离：
[0029][0030]
图15b：分离大豆蛋白质(spi)结构和交联机制，所述交联是通过薄膜和纤维中的转谷氨酰胺酶(tg)将spi薄膜中的胺酶促催化成酰胺。图15c：用ftir吸收强度对交联的评估。图15d：所公开纤维(列为“werewool”，另参见图13b)与新兴生物纺织品的机械测试比较，用配备有25kn测力计的单轴拉伸测试机(英斯特朗(instron)，型号1321，美国马萨诸塞州诺伍德(norwood,ma,usa))进行测量。
[0031]
图16a至16c：使用傅里叶变换红外光谱(ftir)和x射线光电子能谱(xps)对不同蛋白质的酶促连接效果的分子水平分析。图16a：bnc的ftir，其中颜色和酰胺峰(绿色曲线)表明gfp的官能化。使用x射线光电子能谱(xps)测量的具有和不具有gfp的bnc的氮(n 1s)(图16b)和碳(c 1s)(图16c)芯能级谱。n 1s的增加(图16b)和强度向c-n结合能的位移(c 1s，图16c)表明gfp对生物聚合物的官能化，这与ftir一致(图15a)。
[0032]
图17a至17d：制成的spi薄膜的ftir峰积分(n＝3)。用0.1m naoh处理且随后用柠檬酸调节至ph 3、5、7或10的分离大豆蛋白质的ftir分析(n＝3)。展示了未经和经1％v/v或5％v/v甘油处理以及未经和经1％w/w转谷氨酰胺酶(tg)处理的蛋白质。注意：在各曲线图中，检测到的唯一峰位移是当使用ph 3纺液时酰胺iii的右移。图17a：无甘油，无tg。图17b：1％v/v甘油，无tg。图17c：无甘油，1％w/w tg。图17d：5％v/v甘油，1％w/w tg。
[0033]
图18a至18f：制成的spi薄膜的ftir峰分析(n＝3)。用0.1m naoh处理且随后用柠檬酸调节至ph 3、5、7或10的分离大豆蛋白质的ftir峰积分(n＝3)。图18a：c-o伸缩峰面积，无tg。图18b：c-o伸缩峰面积，+tg。图18c：胺伸缩/酰胺i峰面积，无tg。图18d：胺伸缩/酰胺i峰面积，+tg。图18e：胺伸缩/酰胺ii峰面积，无tg。图18f：胺伸缩/酰胺ii峰面积，+tg。
[0034]
图19a至19d：在25℃下真空脱水后的spi薄膜的ftir积分(n＝3)。用0.1m naoh处理且随后用柠檬酸调节至ph 3、5、7或10的分离大豆蛋白质的ftir分析(n＝3)。展示了未经(左列)和经(右列)1％v/v甘油处理以及未经(顶行)和经(底行)1％w/w tg处理的蛋白质。注意：在各曲线图中，检测到的唯一峰位移是当使用ph 3纺液时酰胺iii的右移。图19a：无甘油，无tg。图19b：1％v/v甘油，无tg。图19c：无甘油，1％w/w tg。图19d：1％v/v甘油，1％w/w tg。
[0035]
图20a至20f：在25℃下真空脱水后的spi薄膜的ftir峰分析(n＝3)。用0.1m naoh处理且随后用柠檬酸调节至ph 3、5、7或10的分离大豆蛋白质的ftir峰积分(n＝3)。图20a：
c-o伸缩峰面积，无tg。图20b：c-o伸缩峰面积，+tg。图20c：胺伸缩/酰胺i峰面积，无tg。图20d：胺伸缩/酰胺i峰面积，+tg。图20e：胺伸缩/酰胺ii峰面积，无tg。图20f：胺伸缩/酰胺ii峰面积，+tg。
具体实施方式
[0036]
为了便于理解本文所公开的主题，除非本文另外明确提供，否则如本文所用的以下术语中的各者应具有下文所阐述的含义。
[0037]
如本文所用，“生物聚合物”应指任何聚合生物分子。作为生物聚合物的实例，肽是氨基酸生物分子的聚合物。“生物聚合物组合物”可以指含有一种或多种生物聚合物(例如明胶和分离的重组表达蛋白质；纤维素和分离的重组表达蛋白质；等)的任何组合物。“生物聚合物原材料”是适用于生产纺织材料的过程的任何生物聚合物组合物。
[0038]
如本文所用，“生物纺织材料”应指用于制造由生物聚合物组合物产生的纺织品的任何材料，所述纺织品包括(但不限于)织物、纤维或薄膜。
[0039]
如本文所用，“填充剂”或“填充材料”应指用于为使用本文所描述的任一方法产生的生物纺织材料提供额外结构或体积的任何物质或材料。填充剂或填充材料的实例包括(但不限于)纤维素、细菌或微生物纳米纤维素、甲基纤维素、明胶等。
[0040]
如本文所用，“纤维素”应指由多个β(1-4)连接的d-葡萄糖单元的直链组成的多糖。纤维素由例如大多数植物细胞或某些细菌细胞产生。如本文所用，“纳米纤维素”应指纳米结构的纤维素，其可具有几纳米的原纤维宽度和长达几微米的长度范围。
[0041]
如本文所用，“交联”应指将两个不同分子连接在一起的键的形成，例如两个蛋白质单元可通过转谷氨酰胺酶交联，所述转谷氨酰胺酶在一个蛋白质单元上的谷氨酰胺与另一蛋白质单元上的赖氨酸之间形成共价键。
[0042]
如本文所用，“交联能力”应指分子进行交联的能力。蛋白质的交联能力随其氨基酸组成而变化。举例来说，蛋白质通过交联酶转谷氨酰胺酶与另一蛋白质单元交联的交联能力随蛋白质的谷氨酰胺和赖氨酸含量而变化，例如蛋白质的谷氨酰胺或赖氨酸含量的增加会增强所述蛋白质的转谷氨酰胺酶交联能力。
[0043]
如本文所用，“与蛋白质相关的功能特性”应指作为蛋白质结构表现形式的蛋白质的任何物理性质或特性。举例来说，与绿色荧光蛋白质相关的功能特性是绿色荧光或绿色着色。
[0044]
如本文所用，“明胶”应指通常是衍生自胶原蛋白的肽和蛋白质的粘性混合物的物质，所述胶原蛋白例如获自动物部分、海藻提取物、植物提取物等。如本文所用，“明胶蛋白质”是用于衍生明胶的蛋白质或作为明胶物质的一部分的蛋白质。
[0045]
如本文所使用，“聚合物”是指通过聚合形成且包括重复结构单元的化合物或化合物的混合物。聚合物可以多种形式和组合物或组合物的组合来构造。聚合物可以是天然的或合成的。天然聚合物的实例包括胶原蛋白、纤维素、丝纤蛋白、角蛋白、明胶和多糖，例如壳聚糖和海藻酸盐。
[0046]
如本文所用，“纯化的蛋白质”或“纯化的源蛋白质”应指已从其原始组合物基本上分离或富集的一种或多种蛋白质分子。举例来说，重组蛋白质可以从细菌溶解物中纯化得到。此外，纯化的蛋白质可以从天然产物中纯化得到，例如酪蛋白可以从哺乳动物乳汁中纯
化得到。纯化的源蛋白质可以包含几种不同的蛋白质分子，例如可以从大豆中纯化得到的包含不同类型蛋白质分子的分离大豆蛋白质。
[0047]
如本文所用，“重组表达蛋白质”应指从非天然存在的重组dna构建体表达的任何蛋白质。重组表达蛋白质可以例如从大肠杆菌(e.coli)或酿酒酵母(s.cerevisiae)中的重组dna表达构建体表达。
[0048]
如本文所用，“源蛋白质”应指具有希望由生物纺织材料表现出的功能特性的蛋白质。
[0049]
如本文所用，“标签”应指对源蛋白质的任何氨基酸修饰，其增强蛋白质的分离、检测或交联能力。可以使用重组dna方法将标签序列添加到源蛋白质的dna编码序列中，以将标签表达为重组表达蛋白质的一部分。重组表达蛋白质可以在任何位置进行修饰以含有标签。增强重组表达蛋白质的交联能力的标签长度至少为一个氨基酸。标签可以例如作为附接到源蛋白质末端的至少一个氨基酸，或作为插入源蛋白质中的至少一个氨基酸添加到源蛋白质中。可以通过用另一氨基酸取代源蛋白质的氨基酸来将标签添加到源蛋白质中。举例来说，源蛋白质的氨基酸可以被谷氨酰胺或赖氨酸残基取代，以增强蛋白质的转谷氨酰胺酶交联能力。
[0050]
如本文所用，“转谷氨酰胺酶”应指具有转谷氨酰胺酶活性，即在肽中的谷氨酰胺的甲酰胺基团与赖氨酸的氨基之间形成异肽键的任何酶。转谷氨酰胺酶可以从任何来源，例如细菌或哺乳动物细胞中分离得到。如本文所用，“转谷氨酰胺酶固化浴”是含有一定量的转谷氨酰胺酶的任何溶液，其用于使暴露于所述溶液的分子交联。
[0051]
如本文所用，所提供的所有数值范围意图明确地包括至少端点和落在范围端点之间的所有数值。
[0052]
如上文所提及，时尚产业以农业、畜牧业和石化产品为基础，并且是目前世界上采掘和污染最严重的产业之一，也是全球气候变化的主要贡献者。
[0053]
本文所公开的主题使得能够获得具有所需纤维特性的纺织品。如所公开，制造纺织品的传统方法的许多缺点可以通过使用选定的蛋白质来避免，这些蛋白质可以使用重组dna技术进行工程改造，且通过微生物例如非病原性大肠杆菌(escherichia coli)(大肠杆菌(e.coli))大规模生产作为原材料，同时减少对大量水和能源以及化学密集型工艺的需求。
[0054]
阐述以下实施例和实例(包括其细节)以帮助理解本公开的主题，但不旨在且不应被解释为以任何方式限制所要求保护的本发明。
[0055]
图12a中描绘的方案图概述了根据本公开的一个实施例的用于产生生物纺织材料的方法。所述方法包含对蛋白质进行重组表达以增强蛋白质的交联能力且分离所述蛋白质的步骤(s121)。可以使用重组dna技术来修饰重组表达蛋白质以含有一个或多个增强蛋白质交联能力的标签。举例来说，此类标签可含有谷氨酰胺或赖氨酸残基中的至少一种以增强转谷氨酰胺酶使蛋白质交联的能力。
[0056]
所述方法进一步包含使分离的重组表达蛋白质与重组表达蛋白质的至少一个其它单元或填充材料酶促交联的步骤(s123)。举例来说，分离的重组表达蛋白质可以是生物聚合物组合物的一部分，所述生物聚合物组合物还包含填充材料，例如细菌纳米纤维素或明胶。可将生物聚合物组合物暴露于交联酶(例如转谷氨酰胺酶)，以使分离的重组表达蛋
白质与填充材料交联。或者，可将分离的重组表达蛋白质暴露于交联酶(例如，在转谷氨酰胺酶固化浴中)，同时向转谷氨酰胺酶固化浴中添加填充材料。
[0057]
所述方法进一步包含产生表现出重组表达蛋白质的功能特性的生物纺织材料的步骤(s125)。举例来说，重组表达蛋白质可以是荧光蛋白质，其特征为荧光颜色的功能特性。令人惊讶的是，当包含荧光蛋白质的如本文所公开的生物聚合物组合物酶促交联且由交联的生物聚合物组合物产生生物纺织材料时，所述生物纺织材料(例如用作织物或薄膜或用于织物或薄膜中)表现且保持重组表达蛋白质的功能特性(在此实例中为荧光颜色)。
[0058]
在本公开中，描述一种用于产生生物纺织材料的方法，其包含：
[0059]
a)获得包含纯化的重组表达蛋白质的生物聚合物组合物，所述重组表达蛋白质已从源蛋白质的dna编码序列表达，所述dna编码序列已任选地被修饰以包括至少一个增强所述重组表达蛋白质的交联能力的标签序列；
[0060]
b)将所述组合物暴露于酶以使所述重组表达蛋白质与所述重组表达蛋白质的至少另一单元或所述生物聚合物组合物的另一组分酶促交联；以及
[0061]
c)基于所述交联组合物产生生物纺织材料，所述生物纺织材料表现出与所述重组表达蛋白质相关的功能特性。
[0062]
在一些实施例中，(c)中产生的生物纺织材料包括由交联组合物形成的多个纤维，且(a)中添加到重组表达蛋白质的被修饰dna编码序列中的标签序列增强(c)中的纤维形成。
[0063]
在一些实施例中，(c)中产生的生物纺织材料包括由交联组合物形成的多个薄膜，且(a)中添加到重组表达蛋白质的被修饰dna编码序列中的标签序列增强(c)中的薄膜形成。标签序列增强纤维或薄膜形成，因为其增强了源蛋白质的交联能力，所述源蛋白质原本可能无法以足以产生生物纺织材料的水平酶促交联。值得注意的是，视源蛋白质的氨基酸组成而定，蛋白质可以在不需要通过添加标签进行修饰的情况下充分交联。令人惊讶的是，由生物纺织材料形成的纤维或薄膜在(b)中离体酶促交联之后表现出源蛋白质的功能特性。
[0064]
在一些实施例中，源蛋白质是荧光蛋白质，且重组表达蛋白质至少具有源蛋白质的荧光特性。由包含荧光蛋白质的生物聚合物组合物产生的生物纺织材料表现出的荧光特性(即颜色)消除了使用传统的环境不可持续的方法对纺织品进行染色的需要。
[0065]
在一些实施例中，源蛋白质是绿色荧光蛋白质(gfp)、红色荧光蛋白质(rfp)、近红外荧光蛋白质或蓝色荧光蛋白质(bfp)。近红外荧光蛋白质包括可见为除红色以外的颜色的荧光蛋白质，例如近红外荧光蛋白质包括小红外荧光蛋白质，其实际上发出蓝色荧光。
[0066]
在一些实施例中，所述生物聚合物组合物的另一组分为明胶蛋白质，且在(b)中使用的酶包括转谷氨酰胺酶，并且在(b)中与重组表达蛋白质交联的明胶蛋白质形成生物纺织材料的填充材料。
[0067]
在一些实施例中，其中在(b)中使用的酶包括转谷氨酰胺酶，且在(b)中重组表达蛋白质与所述重组表达蛋白质的另一单元交联，且重组表达蛋白质的多个交联单元形成生物纺织材料的填充材料。
[0068]
在一些实施例中，所述生物聚合物组合物的另一组分是纤维素蛋白质或纤维素蛋白质复合物，且在(b)中使用的酶包括转谷氨酰胺酶，并且在(b)中与重组表达蛋白质交联
的纤维素蛋白质或纤维素蛋白质复合物形成生物纺织材料的填充材料。
[0069]
在一些实施例中，源蛋白质是酪蛋白、弹性蛋白、乳清蛋白质或pelovaterin中的至少一种。源蛋白质可以是被选择以赋予纺织品所需的蛋白质功能特性的任何蛋白质。酪蛋白可以呈任何形式，包括(但不限于)α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。乳清蛋白质可以是乳清中存在的任何蛋白质，包括(但不限于)乳白蛋白、乳球蛋白和白蛋白。
[0070]
在一些实施例中，组合物中重组表达蛋白质的浓度为每单位体积0.1％至0.2％。
[0071]
在一些实施例中，在(a)中获得的生物聚合物组合物呈溶液形式，且溶液中重组表达蛋白质的量在0.84mg/ml至3.495mg/ml的范围内。
[0072]
在一些实施例中，生物聚合物组合物中的重组表达蛋白质是冻干的。
[0073]
在一些实施例中，组合物包含明胶、纤维素或多糖中的至少一种。
[0074]
在一些实施例中，纤维素是甲基纤维素或微生物纳米纤维素。
[0075]
在一些实施例中，在生物聚合物组合物中，重组表达蛋白质与微生物纳米纤维素的比率按质量计为至少1:1000。
[0076]
在一些实施例中，组合物中明胶的浓度为组合物的至少20％。
[0077]
在一些实施例中，在组合物中，重组表达蛋白质与明胶的比率按质量计为至少1:1000。
[0078]
在一些实施例中，酶是转谷氨酰胺酶。
[0079]
在一些实施例中，组合物暴露于的转谷氨酰胺酶的浓度为每单位体积的组合物0.01％至15％。
[0080]
在一些实施例中，在组合物中，重组表达蛋白质与转谷氨酰胺酶的比率在1:1至300:1的范围内。
[0081]
在一些实施例中，交联步骤(b)包含将组合物暴露于温度保持在25℃或更低的转谷氨酰胺酶固化浴。
[0082]
在一些实施例中，转谷氨酰胺酶固化浴的ph在5.6至8.8的范围内。
[0083]
在一些实施例中，组合物暴露于转谷氨酰胺酶固化浴至少15分钟。
[0084]
在一些实施例中，组合物包含填充剂。
[0085]
在一些实施例中，在与重组表达蛋白质酶促交联之前，首先将填充剂分离并纯化成纤维、薄膜或薄层。
[0086]
在一些实施例中，生物纺织材料是纤维、薄膜或生物聚合物原材料中的至少一种。
[0087]
在一些实施例中，进一步包含通过使用生物纺织材料挤出纤维。
[0088]
在一些实施例中，纤维以每分钟1.75至2.0ml的速率挤出。
[0089]
在一些实施例中，在挤出期间对纤维施加恒定的拉力。
[0090]
在一些实施例中，进一步包含通过使用交联组合物来静电纺制纤维。
[0091]
在一些实施例中，进一步包含将交联组合物流延成适合于纺织品生产的薄膜、凝胶或颗粒。
[0092]
在本公开中，还描述一种由通过上述实施例中任一者的方法产生的生物纺织材料形成的产品。
[0093]
在本公开中，描述一种生物纺织材料的组合物，其包含：(i)由源蛋白质的dna编码序列表达的重组表达蛋白质，所述dna编码序列已任选地被修饰以包括至少一个增强所述
重组表达蛋白质的交联能力的标签序列；和(ii)另一蛋白质或所述重组表达蛋白质的另一单元，其与所述重组表达蛋白质交联，所述生物纺织材料表现出与所述重组表达蛋白质相关的功能特性。
[0094]
在一些实施例中，生物纺织材料包括多个纤维，且添加到重组表达蛋白质的被修饰dna编码序列中的标签序列增强纤维形成。
[0095]
在一些实施例中，生物纺织材料包括由交联组合物形成的多个薄膜，且添加到重组表达蛋白质的被修饰dna编码序列中的标签增强薄膜形成。
[0096]
在一些实施例中，源蛋白质是荧光蛋白质，且重组表达蛋白质和生物纺织材料两者各自至少具有源蛋白质的荧光特性。
[0097]
在一些实施例中，源蛋白质是绿色荧光蛋白质(gfp)、红色荧光蛋白质(rfp)、近红外荧光蛋白质或蓝色荧光蛋白质(bfp)。近红外荧光蛋白质包括可见为除红色以外的颜色的荧光蛋白质，例如近红外荧光蛋白质包括小红外荧光蛋白质，其实际上发出蓝色荧光。
[0098]
在一些实施例中，重组表达蛋白质与明胶蛋白质交联，所述明胶蛋白质形成生物纺织材料的填充材料。
[0099]
在一些实施例中，重组表达蛋白质与所述重组表达蛋白质的另一单元交联，且重组表达蛋白质的多个交联单元形成生物纺织材料的填充材料。
[0100]
在一些实施例中，重组表达蛋白质与纤维素蛋白质或纤维素蛋白质复合物交联，所述纤维素蛋白质或纤维素蛋白质复合物形成生物纺织材料的填充材料。
[0101]
在一些实施例中，作为重组表达的替代方案，从原材料中分离组合物的蛋白质。举例来说，在一些实施例中蛋白质是以下中的任一种：从牛奶中分离的酪蛋白、来自食用后牡蛎的展肌的弹性蛋白、从中国软甲龟蛋壳中分离的pelovaterin或来自大豆的分离大豆蛋白质。
[0102]
图12b中描绘的方案图概述了根据另一实施例的用于产生生物纺织材料的方法。所述方法包含获得纯化的源蛋白质的步骤(s121b)。纯化的源蛋白质可以从表达所述蛋白质的细胞溶解物中纯化得到或从天然组合物中纯化得到。
[0103]
所述方法进一步包含使纯化的源蛋白质与纯化的源蛋白质的至少一个其它单元或填充材料交联的步骤(s123b)。举例来说，纯化的源蛋白质可以是生物聚合物组合物的一部分，所述生物聚合物组合物还包含填充材料、明胶、纤维素、多糖、蛋白质-多糖混合物或分离大豆蛋白质或其亚基。可将生物聚合物组合物暴露于交联酶(例如转谷氨酰胺酶)和/或氯化钙溶液，以使生物聚合物组合物的组分交联。
[0104]
所述方法进一步包含产生表现出重组表达蛋白质的功能特性的生物纺织材料的步骤(s125b)。举例来说，纯化的源蛋白质可以是弹性蛋白，其特征为弹性的功能特性。当包含弹性蛋白的生物聚合物组合物酶促交联且由交联的生物聚合物组合物产生生物纺织材料时，生物纺织材料(例如用作织物或薄膜或用于织物或薄膜中)表现且保持纯化的源蛋白质的功能特性(在此实例中为弹性)。
[0105]
在一些实施例中，生物聚合物组合物包含重组表达蛋白质或从原材料中分离的蛋白质，所述从原材料中分离的蛋白质在不添加增强蛋白质的交联能力的标签的情况下能够与生物聚合物组合物的组分充分酶促交联。
[0106]
在本公开中，描述一种用于产生生物纺织材料的方法，其包含：
[0107]
a)获得包含纯化的源蛋白质的生物聚合物组合物；
[0108]
b)使所述纯化的源蛋白质的分子与所述纯化的源蛋白质的至少另一分子或所述生物聚合物组合物的另一组分交联；以及
[0109]
c)基于所述交联组合物产生生物纺织材料，所述生物纺织材料表现出与所述纯化的源蛋白质相关的功能特性。
[0110]
在一些实施例中，源蛋白质是重组表达蛋白质，且所述重组表达蛋白质由所述源蛋白质的dna编码序列表达。在一些实施例中，纯化的源蛋白质获自天然资源且不需要重组表达，例如酪蛋白可以直接从哺乳动物乳汁中分离。
[0111]
在一些实施例中，进一步包含对源蛋白质的dna编码序列进行修饰以包括至少一个增强重组表达蛋白质的交联能力的标签序列。
[0112]
在一些实施例中，交联在(b)中通过将组合物暴露于交联酶和/或包含氯化钙的溶液来进行。在一些实施例中，交联溶液中氯化钙的浓度为0.1％至10％w/v氯化钙，优选3％至5％w/v氯化钙。
[0113]
在一些实施例中，交联酶是转谷氨酰胺酶。
[0114]
在一些实施例中，源蛋白质是酪蛋白、弹性蛋白、pelovaterin、乳清蛋白质或荧光蛋白质中的至少一种。源蛋白质可以是被选择以赋予纺织品所需的蛋白质功能特性的任何蛋白质。酪蛋白可以呈任何形式，包括(但不限于)α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。乳清蛋白质可以是乳清中存在的任何蛋白质，包括(但不限于)乳白蛋白、乳球蛋白和白蛋白。
[0115]
在一些实施例中，(a)中获得的生物聚合物组合物包含以下中的至少一种：明胶、纤维素、多糖、蛋白质-多糖混合物、分离大豆蛋白质或分离大豆蛋白质的主要球状亚基，例如7s或11s亚基。
[0116]
在一些实施例中，(a)中获得的生物聚合物组合物包含填充剂。
[0117]
在一些实施例中，生物聚合物组合物在(a)中以ph在3与10之间的溶液形式获得。
[0118]
在一些实施例中，进一步包含将(a)中获得的生物聚合物组合物暴露于甘油溶液，其中溶液中甘油的浓度为0.1％至10％v/v。
[0119]
在一些实施例中，进一步包含将(a)中获得的生物聚合物组合物暴露于甘油溶液，其中(a)中获得的生物聚合物组合物包含分离大豆蛋白质，且其中交联在(b)中通过将组合物暴露于转谷氨酰胺酶来进行。
[0120]
在本公开中，提供一种由通过上文所公开方法中的任一种产生的生物纺织材料形成的产品。
[0121]
本文公开了具有固有颜色和性能的生物可降解高性能纤维的方法和组合物。识别编码生物体中特定属性的蛋白质，所述特定属性例如拉伸、硬度、颜色、防水、弹性等，且改变编码所述蛋白质的dna序列以将所述蛋白质工程改造成适合于生物纺织材料的纤维产生。蛋白质酶促交联成纤维或薄膜。
[0122]
本发明的纤维开发平台通过消除染料的生态毒性和合成纤维的报废影响而减少时尚产业对我们日益减少的自然资源的影响。酶促交联的纤维通过在使用寿命结束时将营养物质返回生态系统，从而消除纺织品染整和微塑料污染，从而实现循环寿命周期。
[0123]
此外，所公开的方法可遵守astm、aatcc和iso纺织品测试标准。为了确保在闭环系统中生产本发明的纤维，本文描述的方法可以与绿色化学和负责任的废物管理一起使用。
广泛认可的时尚产业工具，例如higg指数、寿命周期评估、蓝色(blue)标志和摇篮到摇篮(cradle to cradle)认证，可以监测、量化和持续减少纤维生产对环境和社会的影响。实际上，与传统聚酯的生产相比，寿命周期评估表明，即使不考虑消除有毒合成染料的使用和报废微塑料污染，所公开纤维的生产也具有55％的碳排放减少，且使用的水减少了84％，这相当于比棉花生产少1000倍的水。
[0124]
从技术角度来看，本文所描述的纤维开发平台利用大自然在过去38亿年中进化出的颜色、多样性和广泛的性能来产生高性能的生物可降解纺织纤维。这是一种扩展方法，允许开发一系列具有各种不同功能的纤维。已开发出产生本文所描述的生物纺织材料和高性能纤维的新方法以展现高可持续性和循环性。
[0125]
在生产的原材料阶段，生物纺织材料是在实验室中制造的，且其不依赖于农业、畜牧业或石化产品，这是三个全球最大的工业co2贡献者。产生新型生物纺织材料的方法使用糖等输入物，可能是废流糖，例如为其微生物原材料加工步骤提供原料。这种方法最大限度地减少了水、化肥等投入，以及传统畜牧业/农业饲养过程中化学径流引起的富营养化等地方环境影响。
[0126]
本文所描述的方法和生物纺织组合物在纤维中提供纺织产业固有的结构颜色，从而减少了与纺织染色相关的大量用水和毒性。本文所描述的替代生物纺织材料还具有在不牺牲性能的情况下替代广泛使用的生态毒性高性能纤维和整理工艺的潜力。举例来说，虽然弹性纤维只占服装的一小部分，但仅1％的这种纤维的存在就会使得服装不可回收，且防水等化学整理剂会将甲醛浸入公共水系统中。生物可降解纤维使用蛋白质结构来提供这些特性，且将对人类健康和环境的影响降至最低。事实上，虽然合成纺织品是微塑料污染的主要来源，但本文所描述的低冲击纤维具有循环寿命周期，且设计为不会超过生态系统中的人类寿命。
[0127]
受自然启发并使用生物技术工具，已如本文所描述制造出具有固有颜色和性能的生物可降解高性能纤维。通过进化，自然界已经发展出无数的性能特性，这些特性取决于蛋白质结构且由蛋白质结构决定。已经开发并在本文中公开了对蛋白质进行工程改造并将它们整合到织物中以使织物继承蛋白质的有益特性从而制造可持续高性能纺织品的方法。已经开发并在本文中描述了蛋白质和蛋白质复合纤维的设计和工程改造，其用以开发具有有益特性(例如颜色、吸湿排汗性、拉伸和防水性)并且满足当今消费者的性能要求的材料。
[0128]
利用转谷氨酰胺酶使细胞和工程改造的蛋白质和生物聚合物复合物酶促交联成用于纺织应用的原材料和纤维，其中蛋白质的所需功能(例如荧光颜色)离体保留。通过利用例如被修饰的红色和绿色荧光蛋白质(fp)，产生工程改造的蛋白质，且使用其来制造具有一系列固有结构颜色和天然荧光的生物可降解纤维。已制造出原型纤维，并且已经测试了这些原型纤维的材料特性。举例来说，对于粉红色纤维，使用来自迪斯科马珊瑚(discosoma coral)的红色荧光蛋白质(rfp)来离体赋予纤维红色。此蛋白质不仅提供颜色，还为珊瑚提供uv保护特性。令人惊讶的是，当使用酶促交联方法来产生如本文所描述的高性能生物纺织品时，这些相同的特性保留在纤维中。这表明所述方法可以产生用于纺织应用的在活细胞外保留蛋白质的性能和功能特性的纤维，从而在没有传统纺织品染色方法的毒性和水需求的情况下实现纺织品的颜色。
[0129]
因此，在识别感兴趣的性能特性之后，分离且编辑或以其它方式工程改造具有所
需特性的蛋白质的dna序列以使其适合于纤维形成。使用大肠杆菌等微生物作为原材料生产工厂，表达具有所需特征的蛋白质，以产生纤维的原料。使用转谷氨酰胺酶使蛋白质交联成用于纺织应用的生物可降解生物聚合物高性能纤维，挤出和静电纺制纤维，或将材料流延成适用于纺织品生产和纺丝工艺的薄膜、胶凝和或颗粒。
[0130]
转谷氨酰胺酶使生物聚合物和生物聚合物复合物交联，所述生物聚合物和生物聚合物复合物为蛋白质的组合和/或蛋白质与多糖的组合，其可在挤出或流延之前直接并入生物聚合物水凝胶“纺液”中。或者，可以将蛋白质复合物纺液挤出到转谷氨酰胺酶固化浴中。凝固浴中或纺液中转谷氨酰胺酶的浓度在0.01％至15％的范围内，最佳浓度为1％，其中蛋白质:转谷氨酰胺酶比率在1:1至300:1的范围内。纺液组合物可以是单一蛋白质或复合物，其可包括多种蛋白质并且还可并有用于复合纤维和薄膜的其它生物聚合物，包括多糖。复合物包括不同的蛋白质组合，例如红色和蓝色蛋白质、荧光蛋白质和酪蛋白或明胶，以及蛋白质-纤维素复合物，包括甲基纤维素和微生物纳米纤维素。可以用这种方法制造纯荧光蛋白质纤维。在先前测试中，已使用含20％明胶和约0.15％ gfp的1ml pbs成功地挤出纤维。含有浓度范围为0.84至3.495mg/ml的被修饰gfp的溶液已用于挤出纤维和流延薄膜。更高的浓度也可以通过将蛋白质溶液冻干来实现，从而获得更高的荧光蛋白质浓度。优选地，使用获得颜色所需的最小蛋白质浓度；以及大肠杆菌表达蛋白质的基本培养基。对于复合物，具有可见颜色的最小gfp:明胶或gfp:细菌纳米纤维素比率按质量计为1:》1000。
[0131]
如本文所描述，已证实通过在大肠杆菌或酵母中表达和扩增的细胞和/或工程改造蛋白质的酶促交联所产生的生物织物材料的功能性，其中对所述蛋白质进行选择或设计以将所需纺织品特性映射到适用于工业纺丝工艺的功能性纤维、薄膜或生物聚合物原材料中。可以用增强蛋白质的交联能力的标签来进行修饰的此类蛋白质包括(但不限于)：酪蛋白、分离大豆蛋白质、绿色和红色荧光蛋白质(gfp、rfp)、蓝色蛋白质和弹性蛋白，所述弹性蛋白是一种在食用后牡蛎的展肌中富含的蛋白质。此类蛋白质交联成生物纺织材料，例如纤维、薄膜和生物聚合物原材料，使得生物纺织材料表现出以下特性，包括(但不限于)颜色、拉伸、防水、抗微生物活性等。
[0132]
举例来说，已使用本文所描述的方法，通过组合红色和蓝色蛋白质来制造不含染料或色素的紫色纤维；在这种情况下，红色荧光蛋白质(rfp)为蓝色荧光蛋白质提供uv保护，从而使颜色能够在功能性纤维中离体保留。本文公开了与用于多种蛋白质的转谷氨酰胺酶的酶促交联，所述蛋白质包括有色和荧光蛋白质、酪蛋白、大豆蛋白质和弹性蛋白，包括来自食用后牡蛎壳中剩余的展肌的弹性蛋白。弹性蛋白是一种存在于结缔组织、弹性韧带和软骨中的结构蛋白质。它是一种不同于胶原蛋白的结构蛋白质，且由主要含有甘氨酸和缬氨酸以及被修饰的丙胺酸和脯氨酸残基的可溶性原弹性蛋白构成。弹性蛋白具有弹性的特定结构特性——允许生物组织在拉伸或收缩后恢复其原始形状。举例来说，展肌负责牡蛎壳的打开和关闭，且主要由弹性蛋白组成。此论证可表明基于蛋白质纤维的生物可降解弹力纤维替代品的可能性，所述替代品是使用如本文所描述的用于产生生物纺织材料的新平台和方法制造。
[0133]
本文所描述的纤维产生平台创造了将低冲击原材料，例如细胞和工程改造的蛋白质和生物聚合物复合物，转化成可堆肥的高性能纤维的机会，其促进时尚产业的循环性。所述技术使时尚产业摆脱了传统纺织纤维、有毒染料和整理工艺对气候和水的影响，并为品
牌提供了遵守环境法则和污水处理法的机会，同时保护人类健康。
[0134]
从取代传统(天然、人造、合成、再生)纤维的平台制造的每千克纤维最大限度地减少时尚产业对社会和环境的影响。生物可降解高性能纤维还可以减小产品的报废影响，不会造成微塑料污染或有毒的渗滤液，而是作为健康生态系统的营养物质返回地球。商业化后，生物可降解高性能纤维提供消费者所需的固有纤维颜色、功能和性能的潜在无限变化。
[0135]
随着生物材料市场的持续增长，本文所描述的纤维开发平台能够探索和设计天然产品，通过制造新型纺织品来引领纤维产业创新，所述新型纺织品具有循环寿命周期，同时保持市场所需的性能属性(例如颜色、吸湿排汗性和拉伸)，但不会出现传统投入和工艺的环境影响。
[0136]
总之，本发明的技术是一种产生用于纺织品的大量可定制的生物可降解蛋白质纤维的平台。工程改造蛋白质在大肠杆菌中合成且与转谷氨酰胺酶酶促交联，以将蛋白质和生物聚合物复合物形成为功能性纤维。已使用这种方法产生并测试了几种纤维原型。出乎意料地，含有工程改造蛋白质的组合物在离体酶促交联后产生的生物纺织材料表现出所述工程改造蛋白质的功能特性。因此，这个平台可用于产生一系列具有一系列色素和功能特性(例如uv保护、防水、弹性等)的纺织物。这种技术在鼓励时尚和纺织产业的可持续发展方面具有潜在应用。可以整合或使用各种其它发明性方面，如下文所论述。
[0137]
实验细节-第一组
[0138]
实例1：使用酶促交联的蛋白质纤维发现平台
[0139]
在实例1中，测试不同蛋白质组合的纤维挤出；测试挤出纤维的机械特性；且开发了一种变速纤维卷绕机构以更好地控制挤出和纤维形成。解决了挤出挑战，且描述了蛋白质浓度、转谷氨酰胺酶在溶液中的溶解性以及用于纤维凝固浴的不同转谷氨酰胺酶浓度探索的测量结果。
[0140]
结果
[0141]
测试用于纤维挤出的蛋白质配方：明胶+转谷氨酰胺酶(tg)
[0142]
通过在1％转谷氨酰胺酶浴中交联来实现20％明胶+pbs缓冲液水凝胶的交联，如下文所论述。然后挤出纤维且进行机械测试(机械特性参见图3).
[0143]
根据以下挤出方法，从在1％转谷氨酰胺酶浴中交联的gfp+明胶水凝胶(3ml gfp+2ml pbs+1000mg明胶)挤出纤维且进行机械测试。所述纤维在pbs溶液中过夜后未溶解，且gfp保留在纤维中，荧光颜色未受损(图2)。
[0144]
表1.荧光蛋白质-转谷氨酰胺酶比率
[0145][0146]
表2.荧光蛋白质-转谷氨酰胺酶比率明胶
[0147][0148][0149]
明胶+gfp
[0150][0151]
表2.在1％ tg凝固浴中交联的明胶和gfp的不同挤出操作(各挤出操作的方案相同)的机械特性概述。可变性主要归因于对挤出型材和速度的有限控制，这个问题通过变速纤维卷绕机构得到解决。
[0152]
提供拉力的纤维卷绕机构
[0153]
为了制造提供纤维挤出工艺所需的拉力的机器，由arduino uno微处理器、伺服电机和3d打印机部件制成一台机器。制造这台机器的挑战是对电机程序尽心编码，使得电机以受控的变速运行。起初，这涉及尝试创建电路且用电位器进行编码，但最终证明，将芯片和电机连接到计算机的代码是一种更简单但更精确的设计。
[0154]
挤出挑战
[0155]
以下参数都对纤维的结果有影响，且已考虑所述参数以确定纤维形成的最佳条
件：
[0156]
ph：优选使用pbs浴(ph 7.2)，因微生物转谷氨酰胺酶通常更喜欢较低ph水平而尝试过更酸性的浴(乙酸盐缓冲液ph 5.5)，但在酸性浴中并未同样地形成纤维，且水凝胶沉到浴液的底部而没有形成可用纤维。
[0157]
在转谷氨酰胺酶凝固浴中的时间：优选将纤维暴露于浴液约一小时，因为暴露15分钟会导致纤维在从凝固浴中取出时散开。
[0158]
温度：较热的溶液(且因此粘度较低的溶液)使得挤出的线材更光滑，但在约20℃时线材不能保持一致的形状。约14至15℃的较冷温度有助于保持纤维完整，并且凝固立即且更一致地发生，使得以此方式获取更长、更均匀的纤维。
[0159]
针/挤出型材：更精细的挤出型材可能会产生更粘稠的溶液。针头较钝，可使纤维更长且更均匀。
[0160]
挤出速率：
[0161]
在14℃下以1.75ml/min，对于整个注射器溶液，纤维保持完整，且纤维的质地非常珠状，可能是由于雷诺不稳定性(reynold's instability)。
[0162]
在14℃下以2ml/min，流出的纤维更光滑，但很难保持纤维长度完整。
[0163]
拉力：当产生本质上呈珠状的纤维时，表明在挤出期间对纤维施加一致的拉力可改进纤维强度和均匀性。在此基础上，使用了被编码成控制以特定速度将纤维卷绕到线轴上的电子纤维卷绕机，从而提供控制纤维在挤出时的张力的能力。
[0164][0165][0166]
表a1：通过uv-vis测定的每毫升溶液的浓度百分比(重量百分比)。
[0167]
溶液％tg量测量值(ti)所添加液体可溶/不可溶0.50％6.8mg1ml pbs可溶
2.50％22.2mg1ml pbs可溶5％58.6mg1ml pbs可溶10％100.8mg1ml pbs可溶25％253.9mg1ml pbs可溶50％508.8mg1ml pbs可溶a.5％5.2mg1ml di水可溶b2.5％20.1mg1ml di waler可溶c5％50.1mg1ml di水可溶d10％101.2mg1ml di水可溶e25％249.5mg1ml di水可溶f50％508.8mg1ml di水可溶
[0168]
表a2：通过目测确定的转谷氨酰胺酶在di水和pbs溶液中的溶解性。转谷氨酰胺酶可溶于所有测试溶液中。
[0169]
不成功的mcherry和gfp交联尝试
[0170]
在镍柱纯化和悬浮于含有转谷氨酰胺酶的洗脱缓冲液中之后使mcherry交联的不成功尝试如下：1ml mcherry+25％(252.5mg)或50％(497.4mg)转谷氨酰胺酶。将mcherry-转谷氨酰胺酶混合物的薄膜在40℃下烘干一小时。将干燥的水凝胶片留在pbs溶液中过夜以测试交联。水变成粉红色，表明水凝胶没有交联。水凝胶似乎也完全溶解于pbs溶液中。参见图11a和图11b。
[0171]
使用gfp(对照和带正尾(positive tail)的gfp)，尝试在上述段落中描述的条件下与转谷氨酰胺酶交联且流延薄膜。复合物形成凝胶，其在38℃下烘烤过夜后变成脆性的薄膜。如mcherry所发现，在pbs中浸泡过夜表明蛋白质并未交联，因为它们溶解到了溶液中。参见图11c和图11d。
[0172]
实例2：明胶作为填充材料或载体来形成含有荧光蛋白质的生物聚合物纤维和薄膜以制造具有结构颜色的纺织纤维
[0173]
实例2评估明胶与绿色荧光蛋白质(gfp)的比率对纤维结构和gfp保留的影响。具体来说，测定仍可形成纤维且保留gfp的明胶的最少量。对于某些配方，gfp保留在明胶小纤维内，然而，尚不清楚这是共价结合的结果还是仅仅是纤维基质内的物理截留。在这里，降低明胶:gfp的比率，且评定纤维完整性(视觉、拉伸)和gfp保留(dih
2 o培育，接着测试溶液荧光/浊度/吸光度)。然后可以通过dsc、ftir和nmr测试样品以确定grp的截留方法，例如化学与物理。
[0174]
首先确定gfp和明胶蛋白质能够酶促交联形成保持gfp的荧光特性的纤维，例如如图5a中所示。然而，缺乏对挤出型材的控制会导致基于拉伸测试数据的机械特性发生显著变化，如图6a和图6b中所示。在这里，通过流延薄膜降低了纤维挤出工艺中多个参数所引入的不确定性，以评定gfp:明胶比率和转谷氨酰胺酶对交联和机械特性的影响。
[0175]
材料和方法
[0176]
蛋白质复合物纤维挤出和薄膜流延
[0177]
由于明胶在低于室温下形成固体凝胶，因此可以将完整的纤维挤出到冷却(《10℃)浴中，同时经由物理交联维持其结构。为了在室温和较热的温度下形成维持纤维结构的
化学交联，对赖氨酸/谷氨酰胺具有反应性的转谷氨酰胺酶(tg)可溶解于冷却浴中，在其中转谷氨酰胺酶可以在明胶聚合物链之间形成共价键以产生纤维。
[0178]
纤维挤出
[0179]
通过在pbs中挤出明胶浓度百分比在10％至20％范围内且明胶:gfp比率在115:1与400:1之间的明胶-gfp复合物纺液，接着在冷却的缓冲液浴(100ml)中使用1％转谷氨酰胺酶进行1小时交联来形成纤维。使用以下方案记录明胶、gfp和转谷氨酰胺酶的成功纤维形成：
[0180]
使用1000mg tg和100ml pbs缓冲液制备1％ tg浴。蛋白质水凝胶“纺液”的制备如下：
[0181]
1.在50ml falcon管中混合3ml gfp+2ml pbs。
[0182]
2.向溶液中添加1000mg明胶并涡旋混合。
[0183]
3.在50℃下加热以消除气泡，且使溶液达到一定温度以获得将纺液吸入注射器中所需的粘度。
[0184]
4.用纺液填充注射器，且尖端朝上地放回烘箱以消除气泡(约2分钟)。
[0185]
5.在注射器中将纺液冷却到大约室温，且使用浸没于在冰上冷却至12℃的50ml凝固浴中的1ml bd塑料尖端以1.75ml/min的速率机械挤出纤维。初步挤出是利用移动托盘，但也成功使用了用于纤维卷绕/卷线的变速电机，所述电机可实现固定浴槽。
[0186]
6.将纤维在凝固浴中培育以酶促交联至少1小时，取出并在环境条件下在铁氟龙(teflon)覆盖的箔托盘上干燥。
[0187]
薄膜/凝胶流延
[0188]
如上挤出的纤维之间的不一致(长度、扭结、直径、成珠)会给拉伸测试数据带来不确定性。为了解决如表3中关于蛋白质复合物的交联密度和机械特性所示的gfp:明胶比率的影响，如图7中所示流延2cm直径的薄膜。流延较小薄膜(2cm直径)以最大限度地减少对整个较大薄膜主体的交联的质量扩散限制。使用了以下方法：
[0189]
1.在1.5ml eppendorf管中根据表3中的量组合荧光蛋白和pbs，根据表3中的量添加明胶，且立即涡旋各溶液以确保溶液均匀。在50℃的烘箱中加热管子15分钟，或直到明胶混合物具有所需粘度以吸入(18g)注射器中。
[0190]
2.将1％ tg浴在冰上冷却，直到其达到不高于14℃(也可以接受更低的温度)。将200微升tg浴移入96孔板的适当数目个孔中，然后放在冰上。
[0191]
3.将蛋白质混合物(“纺液”)分配到板的各孔中，直到充满。应注意，纺液立即开始凝胶化。使用带标签的6孔板，在各孔中放置一个2cm橡胶圈，且将混合物均匀地分配在环中，让凝胶冷却五分钟。
[0192]
4.向各孔中添加转谷氨酰胺酶浴以覆盖溶液
[0193]
5.将板覆盖且在4℃培育过夜以进行交联。
[0194]
6.从冰箱中取出，且放在铁氟龙覆盖的箔片上以在环境条件下干燥。
[0195]
作为此方案的额外注意点，请确保明胶混合物在注射器中没有气泡，然后再排出到橡胶圈中。将注射器尖端朝上地放入烘箱中，直到气泡浮到注射器顶部，排出，然后继续填充圈。
[0196]
对于sem样品，使用4.5mm皮肤活检打孔器来制作样品。
[0197]
对于机械测试，样品的长度至少是矩形/骨形的宽度的三倍。
[0198]
蛋白质复合物纤维挤出和薄膜流延
[0199]
在此实验中评估了两个研究组，a组(moo glue)和b组(anjimoto的activa)，以研究交联机制的潜在差异。
[0200]
表3(a组)和表4(b组)中概述的蛋白质范围的目标是将明胶的浓度保持在恒定20％。应注意，明胶浓度影响组合物的粘度，从而影响纤维挤出能力。因为溶液中的gfp是稀释的，所以使用0.5ml的gfp溶液来达到1.75mg的目标，且因此在此实例中使用至少100mg明胶以保持在或高于20％的目标。
[0201]
样品组的gfp浓度和方案
[0202]
本测试使用浓度为3.495mg/ml的gfp溶液。在先前测试中，已使用含20％明胶和0.15％ gfp的1ml pbs成功地挤出纤维。
[0203]
1.合并目标gfp体积与目标pbs体积，如表3中所描述。
[0204]
2.称重且将目标量的明胶溶解于各溶液中。在1ml eppendorf管中混合，涡旋合并，然后置于50℃的培育箱中20分钟以帮助混合。
[0205]
3.在150ml pyrex瓶中制备两种配方的1％转谷氨酰胺酶浴，盖上盖子，置于搅拌板上10分钟，然后置于冰浴中直至温度12至14℃：
[0206]
a)100ml di-h2o+1001.5mg tg(moo glue)
[0207]
b)100ml di-h2o+1001mg tg(activa)
[0208]
4.从烘箱中取出蛋白质胶凝，并且直接倒入装有大约5000μl冷却(12至14℃)转谷氨酰胺酶凝固浴的12孔板中。在tg浴中培育薄膜以交联1小时，使用镊子取出且置于铁氟龙覆盖的箔片上，在室温下放置两天。保存凝固浴以读取蛋白质浓度并评估交联。
[0209]
5.将干燥的薄膜放入2000μl di水中。
[0210]
结果
[0211]
gfp:明胶比率和转谷氨酰胺酶对蛋白质复合物凝胶的交联的影响
[0212]
表3.a组-moo glue凝固浴
[0213][0214]
表4.b组-anjimoto activa酶浴
[0215][0216]
实例3：用荧光蛋白质修饰细菌纳米纤维素
[0217]
材料和方法
[0218]
a.细菌纳米纤维素(bnc)生物合成
[0219]
制备bnc纳米纤维的方案如下。为了减少使用蔗糖对环境的影响，利用从啤酒厂废料的废麦芽提取的糖，使热水流过所述麦芽直到测量到所需的糖浓度。在1000ml烧杯中：
[0220]
1.用热水冲泡2至3袋绿茶。
[0221]
2.溶解58克糖。
[0222]
3.等待溶液恢复到室温。
[0223]
4.向液体培养基中添加一小块scoby(细菌和酵母的共生培养物)。
[0224]
5.向溶液中添加10％发酵剂培养物(100ml)或康普茶(kombucha)。
[0225]
6.用经乙醇处理过的奶酪原料盖住烧杯以防止污染。
[0226]
7.静置培养7天。
[0227]
8.从培养物中去除微生物纤维素薄层。
[0228]
9.继续静置培养以获得更多纤维素薄层。
[0229]
b.微生物纤维素薄层纯化
[0230]
a.将薄层浸入90℃的dih2o中2小时。
[0231]
b.在室温下置于0.5m naoh水溶液中24小时以使附着的细菌细胞溶解(0.5m naoh
→
1g于50ml dih2o中)。
[0232]
c.在dih2o中反复洗涤薄层以去除碱且恢复到ph 7.0。
[0233]
d.如果储存，请将薄层置于4℃的dih2o中以防止脱水。
[0234]
c.用gfp浸渍bnc
[0235]
在生物合成和纯化bnc薄层之后，确定用gfp/rfp蛋白质浸渍bnc的条件，包括用gfp/rfp涂覆和浸泡细菌纤维素，且通过将交联样品置于pbs中来测试交联。
[0236]
使用表5中所示的转谷氨酰胺酶和gfp浓度，将(n＝5)纯化的bnc薄层浸没于gfp/rfp中24小时(保留至少n＝3个纯化的bnc薄层作为ftir的参考样品)。由于bnc薄层很可能平铺在表面上，因此请务必翻转以获得均匀的涂层。
[0237]
表5：f4机械测试方案中的转谷氨酰胺酶和gfp浓度
[0238][0239]
d.简单交联测试(n＝3)
[0240]
将至少三(3)个样品置于pbs中24小时，然后测量溶液中的蛋白质浓度。
[0241]
e.傅里叶变换红外光谱(ftir)
[0242]
使用傅里叶变换红外(ftir)光谱(lumos，bruker)来评定微生物纤维素生物膜的化学构象特征(bnc与gfp/rfp之间的键合/相互作用)。使用200次扫描，以衰减全反射(atr)模式收集600至4000cm-1
的光谱，分辨率为4cm-1
。对于各生物膜，检查至少三个相同条件的样品(纯化的bnc和纯化/经涂覆的gfp/bnc)。为了比较，测量未纯化的，如生长的bnc。
[0243]
结果
[0244]
gfp-bc复合物
[0245]
gfp成功地固定在bnc纳米纤维网中。gfp-bnc薄层浸没于pbs溶液中24小时后没有观察到颜色变化，这与gfp和bnc之间的化学相互作用一致。浸泡后pbs中蛋白质浓度的测量结果证实了这一观察结果。
[0246]
gfp浸没于pbs中24小时后没有落入溶液中，表明蛋白质与多糖之间存在相互作用(例如范德华力(van der waals)、氢键或静电)。这种相互作用使gfp能够固定在bnc纳米纤维的基质中，如由纳米纤维的颜色变化所证明。
[0247]
由于bnc的厚度和gfp的低浓度，没有观察到由于gfp固定在bnc上而引起的重大差异。然而，gfp/bnc样品在1531cm-1
和1634cm-1
处出现了新的峰，其可分别归属于gfp的酰胺i和酰胺ii。
[0248]
新吸收峰的出现表明gfp与bnc之间的化学相互作用。变化的微妙性和峰位置没有位移可能是由于bnc样品的厚度。如果gfp只是简单地固定在生物膜中，那么预期蛋白质会在几小时或更短的时间内显著泄漏到溶液中。
[0249]
实验细节-第二组
[0250]
概述
[0251]
受自然界中发现的蛋白质固有的美学和性能特性的启发，人们对功能性蛋白质进行了工程改造，且利用绿色化学来制造具有所需特征(例如颜色)的生物可降解纺织纤维。所述技术能够产生具有一系列固有颜色(例如红色、紫色、蓝色和绿色)和天然荧光的纤维，这些特性归因于蛋白质结构，且通过纤维加工保留。这种概念验证可以扩展到设计适合于工业纺丝工艺的具有吸湿排汗性、抗微生物特性和uv保护等性能特征的纤维。
[0252]
本文所描述的纤维开发平台跨越三个主要研究领域：生物技术/蛋白质设计、绿色化学/材料科学和纺织品开发。此平台用于开发大规模影响纺织产业的可扩展解决方案，同时使用低冲击营养培养基、可快速再生和可堆肥的原料来获得具有归因于蛋白质形状的所需特性的纤维，并且使用可以适应现有的纤维生产基础设施的纤维形成工艺。
[0253]
本公开还展示了蛋白质和蛋白质-纤维素复合物酶促交联的效果，以及制造具有由低浓度重组蛋白质提供的所需特性(例如颜色)的纤维的能力。此外，用于生物合成的培养基营养物以及生物聚合物原料也可以来源于废料流，这降低了环境影响和生产成本。
[0254]
1.结构颜色的蛋白质设计
[0255]
1.1考虑因素
[0256]
1.1.1.固有颜色：所产生的生物材料具有优选至少5mm-1
cm-1
的亮度，其定义为光吸收(消光系数)与荧光量子产率(荧光光子/所吸收光子的比率)的组合，并且用吸收和发射光谱来测量。
[0257]
1.1.2.颜色稳定性：优选地，在将生物材料浸没于水溶液中7天后保留至少65％的亮度，通过uv-vis光谱测定。
[0258]
1.1.3.保色阈值：纺织产业色牢度标准(aatcc 107-1991/iso 105e01)。
[0259]
1.2达到的里程碑
[0260]
1.2.1.保留在生物聚合物薄膜(图13a)和纤维(图13b)形成中的固有颜色(蛋白质结构和功能)。
[0261]
1.2.2.在水环境中24小时后纤维的颜色稳定性(图13b)。
[0262]
1.2.3.由红色荧光提供的uv保护，利用其并入对uv敏感的蓝色荧光蛋白质，得到uv稳定的紫色纤维(图13d-紫色针织布样)。
[0263]
1.2.4.设计用于扩展颜色供应的蛋白质，包括红色、粉红色、蓝色、紫色和绿色蛋白质：红色荧光蛋白质(rfp)、mscarlet和gfp(图14e)-展示粉红色和绿色纤维以及有色蛋白质的照片。
[0264]
表6：美国纺织化学家和染色师协会(american association of textile chemists and colorists，aatcc)定义的色牢度行业标准
[0265][0266][0267]
2.纤维形成的蛋白质设计
[0268]
2.1考虑因数
[0269]
对优选地在最少化学干预下自组装的蛋白质进行工程改造以形成具有所需特性的稳定纤维(定义于第3节：纤维形成中)，用以下评估：
[0270]
2.1.1.生物材料中蛋白质浓度的uv-可见光光谱，其作为颜色吸收和色牢度的度量，随蛋白质上的工程改造电荷变化。
[0271]
2.1.2.纤维加工中的蛋白质稳定性(颜色)。
[0272]
2.1.3.充分交联，在水溶液中溶胀最小(优选在24小时后《80％)。
[0273]
2.2达到的里程碑
[0274]
2.2.1.设计了具有不同端基的绿色荧光蛋白质，以评估蛋白质电荷对生物聚合物复合物中颜色保留(蛋白质功能)的影响(图14a和14b)。
[0275]
2.2.2.评估蛋白质的ph稳定性以识别和优化加工条件(图14c和14d)。
[0276]
2.3附加任务
[0277]
2.3.1.使用生物材料平台评估一系列蛋白质对纤维形成的亲和力，基于第1.1节中定义的颜色和亮度标准进行迭代和优化。
[0278]
2.3.2.设计结合位点以促进蛋白质自组装成受控形状因子；即，具有必需的旦尼尔(denier)和挤出型材的纤维。
[0279]
2.3.3.设计基于蛋白质的结构性能特性(拉伸、吸湿排汗性、uv保护)。
[0280]
3.纤维形成
[0281]
3.1考虑因数
[0282]
3.1.1.纤维保色性：所产生的纤维在纤维加工后在37℃下优选保持至少70％的颜色。纤维颜色可通过uv-vis光谱测量。此优选水平是基于色牢度测试的纺织品标准(美国纺织化学家和染色师协会，aatcc 107-1991/iso 105e01)。
[0283]
3.1.2.纤维机械特性：优选约150mpa至4gpa杨氏模量，优选约115mpa最大拉伸强度，以及优选约6.7％的延展性，例如通过使用英斯特朗装置进行拉伸测试来确认。
[0284]
3.2达到的里程碑
[0285]
3.2.1.蛋白质酶促交联的机制和化学指纹(图15a和15b)。
[0286]
3.2.2.通过绿色化学纤维加工的颜色稳定性(图13b至13d)。
[0287]
3.2.3.通过纤维组合物和蛋白质设计测试和迭代机械特性(图15c)。
[0288]
3.3附加任务
[0289]
3.3.1.机械纤维挤出和卷绕，控制纺液流速、张力、速度、温度和气流。
[0290]
表7：3.3.2.astm和aatc纺织产业测试标准
[0291][0292]
4.多样性纤维原料
[0293]
4.1考虑因素
[0294]
4.1.1.确定用于生物材料纤维的可扩展、大批量/可快速再生、低成本的原料(例如使用每千克聚酯的成本作为基准)。
[0295]
4.1.2.生物材料纤维优选表现出必需的机械特性和颜色亮度(分别定义于第1.1节和第3.1节中)。
[0296]
4.1.3.生物材料纤维优选在天然陆地和水生环境中是生物可降解的。实例度量：
[0297]
din en iso 11721-1：纺织品-测定含纤维素纺织品对微生物的抵抗力。
[0298]
土埋测试-纺织品质量损失。通过真菌和细菌等微生物与土壤中的氧气结合来检查产品的腐烂过程。
[0299]
4.1.4.确认生物降解产物是非细胞毒性和非细胞遗传的；即，生物材料纤维优选是可堆肥的。可使用水芹和蚯蚓测试来评定生物纺织品对环境的影响以及其生态毒理学安
全性。
[0300]
4.2达到的里程碑
[0301]
4.2.1.利用一系列蛋白质和多糖复合物获得生物材料纤维，包括明胶(图1a至1d)、细菌纳米纤维素(bnc)(图14a、14b和15c)、蛋白质-多糖混合物(图14e)以及分离大豆蛋白质(spi)和其主要球状亚基(图15a和15b)。
[0302]
4.2.2.不同蛋白质酶促连接效果的分子水平分析(图16至16c以及图17a至17d、18a至18f、19a至19d和20a至20f)。
[0303]
4.2.3.甘油改变了spi中的键合，观察到在ph 3、5、7和10下，无论是否包括转谷氨酰胺酶，制成的和真空脱水的spi薄膜的c-o伸缩峰面积均增加(图18a至18f和图20a至20f)。
[0304]
4.3附加任务
[0305]
4.3.1.进一步扩大生物聚合物原料库，以实现系统的成本效益分析。
[0306]
5.补充数据
[0307]
5.1实验
[0308]
分离大豆蛋白质用0.1m naoh处理，随后用柠檬酸分别调节到ph 3、5、7或10，进行和不进行1％v/v甘油处理和1％w/w tg处理。
[0309]
图19a至19d：制成的spi薄膜的ftir峰积分(n＝3)。
[0310]
图18a至18f：制成的spi薄膜的ftir峰分析(n＝3)。
[0311]
图19a至19d：在25℃下真空脱水后的spi薄膜的ftir积分(n＝3)。
[0312]
图20a至20f：在25℃下真空脱水后的spi薄膜的ftir峰分析(n＝3)。
[0313]
5.2spi交联的主要结果概述
[0314]
5.2.1键合机制
[0315]
转谷氨酰胺酶(tg)使氨基(nh2)互相反应，形成氨(nh3，放气)和nh，nh交联形成酰胺(nh-c＝o)。
[0316]
7s-由于其线性结构而在tg浴中表现出强烈的键变化，其中空间位阻较小。
[0317]
11s-迄今为止通过物理观察、化学分析和溶胀测试得到的最佳交联原材料。
[0318]
5.2.3结构差异
[0319]
7s经由其线性结构交联(经由酰胺iii位移观察到)，而spi和11s是芳香族的。
[0320]
5.2.4ftir化学指纹
[0321]
胺伸缩/酰胺ii(nh)：用tg处理的spi中没有形成nh键。
[0322]
7s在tg浴中形成nh键且在tg纺液中形成较少nh键，而11s仅在tg纺液中形成nh键。
[0323]
胺伸缩/酰胺i(c＝o)：用tg处理的spi中没有形成c＝o键。7s在tg浴中形成c＝o键且在tg纺液中形成较少c＝o键，而11s仅在tg纺液中形成c＝o键。
[0324]
标准方法
[0325]
标准分子生物学方法描述于以下文献中：sambrook、fritsch和maniatis(1982年和1989年第2版，2001年第3版)分子克隆实验指南(molecular cloning,a laboratory manual),冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),纽约冷泉港(cold spring harbor,ny)；sambrook和russell(2001年)分子克隆(molecular cloning),第3版,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港；wu(1993年)重组dna(recombinant dna),第217
卷,学术出版社(academic press),加利福尼亚州圣地亚哥(san diego,ca)。标准方法还出现在以下文献中：ausbel等人(2001年)现代分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology),第1至4卷,纽约州纽约市的约翰
·
威利父子出版公司(john wiley and sons,inc.new york,ny)，所述文献描述了细菌细胞和dna诱变中的克隆(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。
[0326]
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶(coligan等人(2000年)现代蛋白质科学实验指南(current protocols in protein science),第1卷,纽约的约翰
·
威利父子出版公司)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白产生、蛋白质糖基化(参见例如coligan等人(2000年)现代蛋白质科学实验指南,第2卷,纽约的约翰
·
威利父子出版公司；ausubel等人(2001年)现代分子生物学实验指南,第3卷,纽约州纽约市的约翰
·
威利父子出版公司,第16.0.5-16.22.17页；西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich,co.)(2001年)生命科学研究产品(products for life science research),密苏里州圣路易斯(st.louis,mo)；第45-89页；安玛西亚法玛西亚生物技术(amersham pharmacia biotech)(2001年)biodirectory,新泽西州皮斯卡塔威(piscataway,n.j.),第384-391页)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(coligan等人(2001年)现代免疫学实验指南(current protcols in immunology),第1卷,纽约的约翰
·
威利父子出版公司；harlow和lane(1999年)使用抗体(using antibodies),冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港；harlow和lane,同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的(参见例如coligan等人(2001年)现代免疫学实验指南,第4卷,纽约的约翰
·
威利父子出版公司)。
[0327]
其它
[0328]
本文引用的所有参考文献均通过引用并入，引用程度如同各个别出版物、数据库条目(例如，genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利出于所有目的被专门且单独地指示其整体通过引用并入一般。根据37c.f.r.
§
1.57(b)(1)，本引用并入声明旨在关联每个单独的出版物、数据库条目(例如，genbank序列或geneid条目)、专利申请或专利，其各自根据37c.f.r.
§
1.57(b)(2)明确地识别，即使此类引用文件与专门的引用并入声明不直接相邻。在本说明书中包括专门的引用并入声明(如存在)不会以任何方式削弱此通用的引用并入声明。本文引用参考文献并非旨在承认所述参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。
[0329]
虽然已经参照各种实施例具体地示出和描述了本发明，但相关领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。