一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用

1.本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用。


背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis)是一种以骨密度和骨质量减少、骨组织微观结构破坏为特点的全身代谢性疾病，最常见于绝经后妇女。2020年全国骨质疏松患者近3亿人，估计2050年将上升至5.333亿。随着人口老龄化进程的加速，骨质疏松症及骨折等并发症已成为我国面临的严重公共卫生问题。目前治疗骨质疏松的主要途径包括减少骨吸收、增加骨形成等。抗骨吸收类药物包括双磷酸盐类药物、破骨细胞分化因子抑制剂等。双磷酸盐类药物通过结合于骨组织中的羟基磷灰石，在破骨细胞行使骨吸收功能时进入成熟破骨细胞，阻碍破骨细胞进一步发挥功能并诱导破骨细胞凋亡，从而有效抑制骨吸收。然而，双磷酸盐亦存在一定的局限性，包括：沉积于骨组织中以致在体内的代谢速率较慢、仅影响成熟破骨细胞的功能而不影响破骨细胞的分化和形成、导致功能丧失的破骨细胞大量积聚等。
3.破骨细胞分化因子抑制剂地诺单抗是核因子κb受体活化因子配体rankl的特异性单克隆抗体，通过与rankl结合，阻断rankl与其受体rank结合，抑制rankl-rank信号通路的激活，从而有效减少破骨细胞的分化形成并削弱其骨吸收功能。但由于rankl-rank信号通路同样在免疫、炎症、感染等过程中发挥重要作用，因此阻断rankl-rank信号通路在减少破骨细胞形成及功能的同时，可能会增加感染风险等副作用。
4.可见现有治疗骨质疏松的药物均存在一定问题。研究一种可以抑制破骨细胞分化和形成，但不会增加感染风险的药物对于治疗骨质疏松症具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物及其在骨质疏松治疗中的应用。
6.本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，它是在豇豆褪绿斑驳病毒表面接枝多肽而得的复合物；所述多肽为seq id no.1所示的氨基酸序列。所述接枝的含义为多肽通过酰胺键连接在豇豆褪绿斑驳病毒表面。
7.进一步地，制备豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物时，所述豇豆褪绿斑驳病毒和多肽的质量比为1：(0.1～50)。
8.进一步地，所述豇豆褪绿斑驳病毒和多肽的质量比为1：50。
9.本发明还提供了前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备方法，它包括如下步骤：
10.将多肽上的羧基活化后，与豇豆褪绿斑驳病毒混合，在溶剂中，活化的羧基与豇豆褪绿斑驳病毒上的氨基发生缩合反应，将反应混合物洗脱、透析，即得。
11.进一步地，
12.所述活化为使用edc和nhs活化多肽上的羧基；
13.和/或，所述溶剂为pbs缓冲液或tris缓冲液；
14.和/或，所述缩合反应为在4～25℃孵育1～12小时；
15.和/或，所述洗脱为通过脱盐柱洗脱；
16.和/或，所述透析为在pbs缓冲液中透析。
17.进一步地，
18.所述多肽、edc和nhs的摩尔比为1:0.9:1；
19.和/或，所述洗脱的洗脱液为pbs缓冲液；和/或，所述洗脱时淋洗速度为0.5ml/min；和/或，所述洗脱时淋洗体积为24ml；
20.和/或，所述透析时分子截留量为14kda；和/或，所述透析时间为12小时；和/或，所述透析时每隔3小时换一次透析液。
21.本发明还提供了前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物中的用途。
22.进一步地，所述药物为抑制破骨细胞形成的药物。
23.进一步地，所述药物为抑制c-fos、ctsk和/或acp5基因表达的药物。
24.本发明还提供了一种药物，它是以前述的豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
26.本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，本发明复合物能够有效抑制破骨细胞的形成和分化，可有效改善骨质疏松的骨量和骨质，用于预防和/或治疗骨质疏松。此外，本发明复合物安全性强，无细胞毒性，且可以减少rankl-rank信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。
27.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
28.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
29.图1为实施例2制备的rm-ccmv的表征结果：a为体积排除色谱(fplc)洗脱结果；b为紫外分光光度计表征rm-ccmv的紫外吸收光谱；c为ccmv和rm-ccmv的动态力学粒径测试结果；d为ccmv和rm-ccmv的zeta电位测试结果；e为ccmv的tem检测结果；f为rm-ccmv的tem检测结果；e和f中bar＝50nm。
30.图2为实施例2制备的rm-ccmv对骨髓巨噬细胞(bmdm)生长影响的cck-8检测结果：a为不同浓度rm-ccmv处理1天的检测结果；b为不同浓度rm-ccmv处理2天的检测结果；c为不同浓度rm-ccmv处理3天的检测结果。
31.图3为流式细胞术检测实施例2制备的rm和rm-ccmv的入胞率及稳定性结果：a为处
15min，活化rm氮端的羧基，然后将得到的混合液加入ccmv溶液(溶剂为pbs缓冲液)中，使rm活化的羧基与ccmv表面的氨基反应形成酰胺键，其中ccmv和rm的质量比为5:1，所述反应为4℃孵育2小时。然后将反应混合物通过脱盐柱洗脱，洗脱液为pbs缓冲液(ph＝7.2)，淋洗速度为0.5ml/min，淋洗体积为24ml。洗脱后将洗脱液放入分子截留量为14kda的透析袋，在pbs透析液中透析12小时，每隔3小时换一次透析液，透析后得到豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物(rm-ccmv)，将所得溶液保存在-20℃。
50.实施例2、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备
51.按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将ccmv和rm的质量比改为1:50，制备得到rm-ccmv。
52.实施例3、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备
53.按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将ccmv和rm的质量比改为1:1，制备得到rm-ccmv。
54.实施例4、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备
55.按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将ccmv和rm的质量比改为1:5，制备得到rm-ccmv。
56.实施例5、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备
57.按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将ccmv和rm的质量比改为1:10，制备得到rm-ccmv。
58.实施例6、本发明豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物的制备
59.按照实施例1所述方法，仅在步骤3时，将ccmv和rm的质量比改为1:20，制备得到rm-ccmv。
60.以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
61.试验例1、豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物(rm-ccmv)的表征
62.1、实验方法
63.利用体积色谱排除柱(fplc)、紫外分光光度计、zeta电位、透射电镜等对实施例2制备的rm-ccmv和ccmv进行表征。
64.其中，体积色谱排除柱(fplc)的流动相为pbs缓冲液(ph＝7.2)，缓冲液的淋洗速度为0.5ml/min，淋洗体积为24ml，检测样品均分散在pbs缓冲液中，上样前需对样品进行过滤(过滤器孔径为200μm)，以除掉大的杂质避免堵塞柱子。
65.紫外分光光度计检测波长为220-700nm，扫描速度100nm/min，检测样品为fplc分离提纯后的rm-ccmv溶液。
66.zeta电位检测所用样品池为石墨电极，所需样品体积为1ml，检测样品为fplc分离提纯后的rm-ccmv溶液。
67.透射电镜检测电压为400v，并将为fplc分离提纯后的rm-ccmv溶液取5μl滴在铜网上，用滤纸轻轻吸掉多余液体，然后滴加5μl乙酸双氧铀染色液，室温染色45-60s，再次用滤纸吸去多于液体，室温干燥等待检测。
68.2、实验结果
69.rm-ccmv的表征结果如图1所示。图1a为通过fplc对所制备的rm-ccmv进行分离提纯，实验结果显示rm-ccmv在约11.5ml左右的淋洗体积洗出，收集该组分并进行下一步的表
征。图1b为紫外分光光度计表征rm-ccmv的紫外吸收光谱，说明rm改性后的ccmv在紫外吸收光谱上并未发生明显变化。图1c为动态力学粒径测试(dls)结果，结果显示改性后rm-ccmv粒径与改性前的ccmv相比并无显著变化，大小均在30nm左右。图1d的zeta电位测试结果显示，改性后的rm-ccmv与ccmv均略带负电，且并无明显差异。图1e为ccmv的tem检测结果，显示其大小与dls测试结果一致；图1f为rm-ccmv的tem检测结果，表明其大小以及形貌与ccmv类似，这与dls测试结果一致。
70.上述实验结果说明rm-ccmv与ccmv在理化性质上并未发生明显的变化。
71.试验例2、rm-ccmv的细胞实验
72.一、cck-8检测rm-ccmv是否存在细胞毒性
73.1、实验方法
74.取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞(bmdm)，将其配置成细胞悬液(细胞密度为1.5万)，然后在200μl细胞悬液中分别加入5μm、1μm、0.2μm、0.04μm浓度的实施例2制备的rm-ccmv(培养基配制)，37℃孵育骨髓巨噬细胞(bmdm)1天、2天和3天，孵育后分别使用cck8检测细胞活性。使用不加rm-ccmv处理的骨髓巨噬细胞作为对照组(ctrl)。
75.2、实验结果
76.不同浓度rm-ccmv处理骨髓巨噬细胞(bmdm)1天、2天和3天后，cck8检测结果如图2所示。与对照组(ctrl)相比，所有浓度的rm-ccmv处理1天、2天和3天后的bmdm的cck8检测结果均没有显著的统计学差异，说明本发明制备的rm-ccmv不影响骨髓巨噬细胞生长，没有细胞毒性。
77.二、流式细胞术检测rm-ccmv的入胞率及稳定性
78.1、实验方法
79.使用rodamine b标记的rm按照实施例2所述方法制备rm-ccmv，进行下述试验：
80.取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞(bmdm)，将其配置成细胞悬液(细胞密度为10万)，然后在1.5ml细胞悬液中加入1μm浓度的rodamine b标记的rm或rm-ccmv(均使用培养基配制)，37℃孵育骨髓巨噬细胞(bmdm)1天、3天和5天，孵育后通过流式细胞术检测rm或rm-ccmv进入细胞的效率以及在细胞中存在的时间。使用不处理的骨髓巨噬细胞作为对照组(ctrl)。
81.2、实验结果
82.实验结果如图3所示：rm的摄取率明显低于rm-ccmv，rm-ccmv能够被细胞高效摄取且能够在细胞中稳定存在，相较于单纯的多肽来讲，提高了其入胞效率和稳定性。同时，流式细胞术检测基于荧光信号，只有在ccmv上成功接枝rm后，才能检测到荧光信号，因此进一步证明了rm-ccmv制备成功。
83.三、qpcr检测rm-ccmv对破骨相关基因的抑制效果
84.1、实验方法
85.qpcr检测rw-ccmv对破骨相关基因的抑制效果。取处于对数生长期的骨髓巨噬细胞(bmdm)，将其配置成细胞悬液(细胞密度为100万)，然后在3ml细胞悬液中分别加入5μm、1μm、0.2μm、0.04μm浓度的实施例2制备的rm-ccmv(培养基配制)，37℃孵育骨髓巨噬细胞(bmdm)1天，然后加入rankl进行体外破骨细胞诱导，rankl加入的浓度为100ng/ml，诱导4天。诱导后对细胞c-fos、ctsk和acp5基因的表达水平进行检测。以不加rm-ccmv，只加rankl
ccmv具有很好的生物相容性，在改善骨质疏松小鼠骨量和骨微结构的同时，并未对心、肝、脾、肺、肾等其他器官造成明显的损伤。
106.综上，本发明提供了一种豇豆褪绿斑驳病毒-多肽复合物，本发明复合物能够有效抑制破骨细胞的形成和分化，可有效改善骨质疏松的骨量和骨质，用于预防和/或治疗骨质疏松。此外，本发明复合物安全性强，无细胞毒性，且可以减少rankl-rank信号通路被完全阻断所产生的副作用，对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏等脏器无明显副作用。本发明复合物具有安全、无毒性、稳定、效果好等优势，在治疗骨质疏松方面具有良好的应用前景。