一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法

一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法。一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，包括以下步骤：清洗、粉碎、加稀碱液、微波处理、粗过滤、酶解、灭酶活、微滤、超滤、浓缩和喷雾干燥。本发明的利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法具有收率高、纯度高、溶剂消耗少、成本低和易于工业化生产的优点。本发明整个工艺流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。
【专利说明】
一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多 肽的方法。
【背景技术】
[0002] 动物脑蛋白的水解物，能治疗一些脑功能疾病，已被临床所证明。上世纪七十年代 末期，奥地利一家名叫伊比威(Ebewe)的药厂研制出脑活素，临床用于治疗神经系统疾病， 特别是阿尔茨海默病的治疗(AD、俗称老年痴呆症），能明显延缓老年痴呆病变的进展，改善 痴呆症状，对脑中风、脑震荡、脑损伤、脑动脉硬化、新生儿脑缺血缺氧性脑病等的治疗也有 较好的疗效。如果用到淡水鱼的脑活素效果会更好。淡水鱼的脑活素，是用淡水鱼脑蛋白经 水解并进一步提纯制得的一种生物制剂，含有75%的游离氨基酸和25%的小分子肽。研究 表明脑活素的药理作用与其所含的小分子肽类的多种活性存在量的关系。据分析，鲜鱼脑 中含水率在78-82%，蛋白质9-11 %，磷脂6-7%，胆固醇2-2.5%。
[0003] 目前，由动物脑制备脑多肽和脑小分子肽的方法，从公开的文献资料中主要是以 下几种：
[0004] (1)-种猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备:将猪脑去膜、洗净后切碎，投入索氏 提取器内、用丙酮回流12小时后，取出压碎晾干，再用丙酮回流12个小时。所得固形物再用 乙醚按上述方法回流提取共24小时，晾干后即得猪脑脱脂蛋白粉。将脱脂蛋白粉加入5倍的 纯净水混合并加入鱼脑蛋白粉重量2%的酸性蛋白酶、混匀后用冰醋酸调PH值在2.0-4.0之 间，然后过滤、滤液50°C减压蒸干后分别用石油醚和无水乙醇搅拌24小时、抽滤，滤饼真空 干燥即得猪脑蛋白水解物，水解物溶解，用Sephade XG15凝胶柱吸附，以0.9%Nacl为洗脱 液进行分离纯化，分段收集各流份并脱盐，冷冻干燥后既可得到不同分子量范围的小分子 肽组份。
[0005] (2) -种猪脑水解蛋白和单唾液酸四己糖神经节苷脂联产工艺（选择鱼水解蛋白 部分），包括以下步骤：
[0006] 步骤1)将猪脑粉碎后加入1-4倍体积的极性有机溶剂，匀浆2-4小时后过滤、分别 收集滤饼和滤液。
[0007] 步骤2)向步骤1所得的滤饼中加入1-3倍体积的丙酮，匀浆1-2小时脱去磷脂、过 滤、减压浓缩、20_30°C干燥，获得脱脂猪脑粉，向脱脂猪脑粉中加入盐缓冲液调节PH值为5-7，按照l_3g/L的比例分别加入2种或3种水解酶，在25-42 °C条件下水解2-10小时，水解结束 后，70-100°C灭活5-10分钟，室温放置降温之后将水解物液经一定分子量的超滤膜过滤，所 得滤液再经截留分子量为100-500的纳滤膜浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋 白。
[0008] (3) -种猪脑蛋白水解液的提取方法，包括以下各步骤：
[0009] 步骤1)取新鲜猪脑或冷冻淡水猪脑，并去除大脑组织表面的筋膜。用纯化水或注 射用水清洗干净，加入1-2倍纯化水或注射用水，用胶体磨匀浆2-3次。
[0010] 步骤2)取步骤(1)的匀浆液、加热至35-45°C、调PH值至7.5-8.5，加衆重0.5-2.5% 的胰蛋白酶，搅拌反应2-8小时，调节:PH值至2.0-2.5，加热至90°C以上保温10-30分钟，冷 却至温室度、离心。
[0011] 步骤3)取步骤⑵离心上清液，按体积比1-3:1-3加入40-50W/V%羟胺溶液，调节 PH值为1.5-2.5，在80-100 °C密闭条件下反应10_30h，冷却至40 °C以下，调PH值至6.9-7.5， 离心过滤。
[0012] 步骤4)取步骤(3)的离心上清液、超滤，收集滤液即为蛋白水解物溶液。
[0013] (4)-种从动物脑中提取淡水脑活素的方法，包括以下步骤：
[0014] 步骤1)将鱼脑加蒸馏水、用Ca(OH)2调PH值7-9。
[0015]步骤2)加牛胰酶、甲苯、蒸馏水在37-50条件下，搅拌10-20h，用磷酸调PH值为5.7-5.8.
[0016] 步骤3)煮沸、过滤、滤液用He 1调PH值为6.7、减压浓缩，低温冷却再浓缩，用NaOH。 调PH为7-9减压浓缩干燥。
[0017]步骤4)将浓缩至干的物料加水溶解，过滤、滤液用HCl调PH值为4-5,用活性炭脱 色、过滤、滤液浓缩后用截留分子量为10000的透析袋进行对水透析24h，过滤，透析液加 NaHS〇3，过滤，分装灭菌而成。
[0018] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

【发明内容】

[0019] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多 肽的方法。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0021] -种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，包括如下步骤：
[0022] (1)取出鲜淡水鱼头或解冻的冰冻淡水鱼头，用纯净水洗净表面的污物、血水及杂 质，摘除鱼鳃，机械粉碎至20目，得鱼头浆液；
[0023] (2)按鱼头浆液与纯净水重量比为1:8混合后，用胶体磨研磨匀浆，用NaOH溶液调 pH值至9.0，得到调节好的鱼头匀浆液；
[0024] (3)将调节好的鱼头匀浆液置于带搅拌装置的微波罐中，先微波升温至60°C，持续 保温60min;
[0025] (4)冷却至40°C，添加按分离蛋白质量5%的胰蛋白酶，在胶体磨中匀浆循环，当pH 值下降至7.5时，取酶解液检验肽含量达到多15mg/ml时；结束酶解；当酶解液含肽量< 15mg/ml时，将酶解液置于微波罐中进行微波辅助酶解，微波时间15-20min。温度55-60 °C ;
[0026] (5)结束酶解，启动微波罐最大微波功率，将酶解液升温至85°C时，保持5-1 Omin， 灭酶活完成，得到已灭酶活的酶解液；
[0027] (6)将已灭酶活的酶解液排出，酶解液温度降至低于50°C时，边搅拌边加入用15% 醋酸溶解1.5%壳聚糖溶液，调节pH值至4.8-5.0,沉析未酶解的脑蛋白、磷脂及其它大分子 杂质;沉析物用400目滤布离心，过滤，去除沉淀，得到离心液；
[0028] (7)将步骤(6)所得的离心液，用0.45um中空纤维膜进行微滤，滤液用能拦截分子 量I OOOODa的超滤膜过滤，透过液即为淡水鱼脑多肽溶液，若只做多肽时，将此溶液减压浓 缩，然后冷冻干燥，即得多肽粉；
[0029] (8)当要制备小分子脑肽时，将多肽液进一步用能拦截分子量1000 Da的纳滤膜过 滤，滤液再用RO膜浓缩，将浓缩液冷冻，干燥，即得到小分子脑肽。
[0030] 作为优选，步骤(2)中的所述的调节好的鱼头匀浆液的细度60-120目。
[0031]作为优选，步骤(3)中的微波罐的频率为2450mHZ，功率为20KW。
[0032]作为优选，步骤(4)中的胰蛋白酶的活力为5000u/g。
[0033]作为优选，步骤(6)中的离心时，离心液的温度38-50°C。
[0034]作为优选，步骤(8)中的RO膜为能拦截> 150Da的膜。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0036] 1.本发明的方法改进淡水鱼头蛋白酶解工艺与技术，解决淡水鱼头蛋白不易被动 物消化吸收问题，通过釆用微波辅助酶解技术制备具有生物活性的寡肽，不仅提高淡水鱼 头蛋白的消化吸收率，而且扩大淡水鱼头蛋白应用领域，使从单纯养鱼拓展到畜禽饲料、饲 料添加剂到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长养鱼产业链，全面提高 养鱼产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动一带一路建设有重大意义。
[0037] 2.本发明的方法采用微波与壳聚糖沉析磷脂的方法，替代用有机溶剂提取淡水鱼 脑分离蛋白，工艺简单，时间短，效率高，生产和劳动安全可靠。
[0038] 3.本发明整个工艺流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排 放，达到清洁生产目标。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明的利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 实施例1:
[0043] -种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，包括如下步骤：
[0044] (1)取出鲜淡水鱼头或解冻的冰冻淡水鱼头，用纯净水洗净表面的污物、血水及杂 质，摘除鱼鳃，机械粉碎至20目，得鱼头浆液；
[0045] (2)按鱼头浆液与纯净水重量比为1:8混合后，用胶体磨研磨匀浆，用NaOH溶液调 pH值至9.0，得到调节好的鱼头匀浆液;所述的调节好的鱼头匀浆液的细度60目；
[0046] (3)将调节好的鱼头匀浆液置于带搅拌装置的微波罐中，先微波升温至60°C，持 续保温60min;微波罐的频率为2450mHZ，功率为20KW;
[0047] (4)冷却至40°C，添加按分离蛋白质量5%的胰蛋白酶，在胶体磨中匀浆循环，当pH 值下降至7.5时，取酶解液检验肽含量达到多15mg/ml时；结束酶解；当酶解液含肽量< 15mg/ml时，将酶解液置于微波罐中进行微波辅助酶解，微波时间15min。温度55°C;胰蛋白 酶的活力为5000u/g;
[0048] (5)结束酶解，启动微波罐最大微波功率，将酶解液升温至85 °C时，保持5min，灭酶 活完成，得到已灭酶活的酶解液；
[0049] (6)将已灭酶活的酶解液排出，酶解液温度降至低于50°C时，边搅拌边加入用15% 醋酸溶解1.5%壳聚糖溶液，调节pH值至4.8,沉析未酶解的脑蛋白、磷脂及其它大分子杂 质;沉析物用400目滤布离心，过滤，去除沉淀，得到离心液;离心液的温度38-50°C ;
[0050] (7)将步骤(6)所得的离心液，用0.45um中空纤维膜进行微滤，滤液用能拦截分子 量I OOOODa的超滤膜过滤，透过液即为淡水鱼脑多肽溶液，若只做多肽时，将此溶液减压浓 缩，然后冷冻干燥，即得多肽粉；
[0051 ] (8)当要制备小分子脑肽时，将多肽液进一步用能拦截分子量1000 Da的纳滤膜过 滤，滤液再用RO膜浓缩，将浓缩液冷冻，干燥，即得到小分子脑肽;RO膜为能拦截> 150Da的 膜。
[0052] 实施例2:
[0053] 一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，包括如下步骤：
[0054] (1)取出鲜淡水鱼头或解冻的冰冻淡水鱼头，用纯净水洗净表面的污物、血水及杂 质，摘除鱼鳃，机械粉碎至20目，得鱼头浆液；
[0055] (2)按鱼头浆液与纯净水重量比为1:8混合后，用胶体磨研磨匀浆，用NaOH溶液调 pH值至9.0,得到调节好的鱼头匀浆液;所述的调节好的鱼头匀浆液的细度120目；
[0056] (3)将调节好的鱼头匀浆液置于带搅拌装置的微波罐中，先微波升温至60°C，持 续保温60min;微波罐的频率为2450mHZ，功率为20KW;
[0057] (4)冷却至40°C，添加按分离蛋白质量5%的胰蛋白酶，在胶体磨中匀浆循环，当pH 值下降至7.5时，取酶解液检验肽含量达到多15mg/ml时；结束酶解；当酶解液含肽量< 15mg/ml时，将酶解液置于微波罐中进行微波辅助酶解，微波时间20min。温度60°C;胰蛋白 酶的活力为5000u/g;
[0058] (5)结束酶解，启动微波罐最大微波功率，将酶解液升温至85°C时，保持5-1 Omin， 灭酶活完成，得到已灭酶活的酶解液；
[0059] (6)将已灭酶活的酶解液排出，酶解液温度降至低于50°C时，边搅拌边加入用15% 醋酸溶解1.5%壳聚糖溶液，调节pH值至5.0,沉析未酶解的脑蛋白、磷脂及其它大分子杂 质;沉析物用400目滤布离心，过滤，去除沉淀，得到离心液;离心液的温度50°C;
[0060] (7)将步骤(6)所得的离心液，用0.45um中空纤维膜进行微滤，滤液用能拦截分子 量I OOOODa的超滤膜过滤，透过液即为淡水鱼脑多肽溶液，若只做多肽时，将此溶液减压浓 缩，然后冷冻干燥，即得多肽粉；
[0061] (8)当要制备小分子脑肽时，将多肽液进一步用能拦截分子量1000 Da的纳滤膜过 滤，滤液再用RO膜浓缩，将浓缩液冷冻，干燥，即得到小分子脑肽;RO膜为能拦截> 150Da的 膜。
[0062] 实施例3:
[0063] -种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，包括如下步骤：
[0064] (1)取出鲜淡水鱼头或解冻的冰冻淡水鱼头，用纯净水洗净表面的污物、血水及杂 质，摘除鱼鳃，机械粉碎至20目，得鱼头浆液；
[0065] (2)按鱼头浆液与纯净水重量比为1:8混合后，用胶体磨研磨匀浆，用NaOH溶液调 pH值至9.0,得到调节好的鱼头匀浆液;所述的调节好的鱼头匀浆液的细度100目；
[0066] (3)将调节好的鱼头匀浆液置于带搅拌装置的微波罐中，先微波升温至60°C，持 续保温60min;微波罐的频率为2450mHZ，功率为20KW;
[0067] (4)冷却至40°C，添加按分离蛋白质量5%的胰蛋白酶，在胶体磨中匀浆循环，当pH 值下降至7.5时，取酶解液检验肽含量达到多15mg/ml时；结束酶解；当酶解液含肽量< 15mg/ml时，将酶解液置于微波罐中进行微波辅助酶解，微波时间18min。温度58°C;胰蛋白 酶的活力为5000u/g;
[0068] (5)结束酶解，启动微波罐最大微波功率，将酶解液升温至85 °C时，保持8min，灭酶 活完成，得到已灭酶活的酶解液；
[0069] (6)将已灭酶活的酶解液排出，酶解液温度降至低于50°C时，边搅拌边加入用15% 醋酸溶解1.5%壳聚糖溶液，调节pH值至4.9,沉析未酶解的脑蛋白、磷脂及其它大分子杂 质;沉析物用400目滤布离心，过滤，去除沉淀，得到离心液;离心液的温度42°C;
[0070] (7)将步骤(6)所得的离心液，用0.45um中空纤维膜进行微滤，滤液用能拦截分子 量I OOOODa的超滤膜过滤，透过液即为淡水鱼脑多肽溶液，若只做多肽时，将此溶液减压浓 缩，然后冷冻干燥，即得多肽粉；
[0071] (8)当要制备小分子脑肽时，将多肽液进一步用能拦截分子量1000 Da的纳滤膜过 滤，滤液再用RO膜浓缩，将浓缩液冷冻，干燥，即得到小分子脑肽;RO膜为能拦截> 150Da的 膜。
[0072] 表1本发明利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法的有益效果
[0074] 从表1可知，本发明利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法得到鱼头多肽的 纯度均在61%以上，鱼脑蛋白酶解得到多肽的酶解率均在60%以上。可见，本发明的方法釆 用微波辅助与膜过滤技术，不需溶剂，酸碱用量少，酶解时间短，转化率高，具有良好的市场 前景。
[0075] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 取出鲜淡水鱼头或解冻的冰冻淡水鱼头，用纯净水洗净表面的污物、血水及杂质， 摘除鱼鳃，机械粉碎至20目，得鱼头浆液； (2) 按鱼头浆液与纯净水重量比为1:8混合后，用胶体磨研磨匀浆，用NaOH溶液调pH值 至9.0，得到调节好的鱼头匀浆液； (3) 将调节好的鱼头匀浆液置于带搅拌装置的微波罐中，先微波升温至60°C，持续保温 60min； (4) 冷却至40°C，添加按分离蛋白质量5%的胰蛋白酶，在胶体磨中匀浆循环，当pH值下 降至7.5时，取酶解液检验肽含量达到多15mg/ml时；结束酶解；当酶解液含肽量< 15mg/ml 时，将酶解液置于微波罐中进行微波辅助酶解，微波时间15_20min。温度55-60°C; (5) 结束酶解，启动微波罐最大微波功率，将酶解液升温至85 °C时，保持5-1 Omin，灭酶 活完成，得到已灭酶活的酶解液； (6) 将已灭酶活的酶解液排出，酶解液温度降至低于50°C时，边搅拌边加入用15%醋酸 溶解1.5%壳聚糖溶液，调节pH值至4.8-5.0,沉析未酶解的脑蛋白、磷脂及其它大分子杂 质;沉析物用400目滤布离心，过滤，去除沉淀，得到离心液； (7) 将步骤（6)所得的离心液，用0.45um中空纤维膜进行微滤，滤液用能拦截分子量 lOOOODa的超滤膜过滤，透过液即为淡水鱼脑多肽溶液，若只做多肽时，将此溶液减压浓缩， 然后冷冻干燥，即得多肽粉； (8) 当要制备小分子脑肽时，将多肽液进一步用能拦截分子量lOOODa的纳滤膜过滤，滤 液再用R0膜浓缩，将浓缩液冷冻，干燥，即得到小分子脑肽。2. 根据权利要求1所述的利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，其特征在于，步 骤(2)中的所述的调节好的鱼头匀浆液的细度60-120目。3. 根据权利要求1所述的利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，其特征在于，步 骤(3)中的微波罐的频率为2450mHZ，功率为20KW。4. 根据权利要求1所述的利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，其特征在于，步 骤(4)中的胰蛋白酶的活力为5000u/g。5. 根据权利要求1所述的利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，其特征在于，步 骤(6)中的离心时，离心液的温度38-50°C。6. 根据权利要求1所述的利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法，其特征在于，步 骤(8)中的R0膜为能拦截> 150Da的膜。
【文档编号】C07K1/30GK106086139SQ201610652811
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610652811.9, CN 106086139 A, CN 106086139A, CN 201610652811, CN-A-106086139, CN106086139 A, CN106086139A, CN201610652811, CN201610652811.9
【发明人】郭凤兰, 刘计汕, 梁尚文
【申请人】柳江县渡庄生物科技有限公司