APRIL和BAFF抑制性免疫调节蛋白及其使用方法与流程

文档序号:33507375发布日期:2023-03-18 04:37阅读:529来源:国知局
APRIL和BAFF抑制性免疫调节蛋白及其使用方法与流程
april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求对2020年5月8日提交的标题为“具有和不具有t细胞抑制蛋白的april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法(april and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof)”的美国临时申请63/022,373、2020年6月3日提交的标题为“具有和不具有t细胞抑制蛋白的april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法(april and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof)”的美国临时申请63/034,361、以及2020年9月18日提交的标题为“具有和不具有t细胞抑制蛋白的april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法(april and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof)”的美国临时申请63/080,643的优先权,所述申请中每一申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入。通过引用并入序列表
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技术领域
3.本公开文本提供免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白展现baff和april(或baff/april异三聚体)的中和活性。所述免疫调节蛋白包括跨膜激活剂和caml相互作用子(taci)的变体结构域。所提供的免疫调节蛋白包括taci-fc融合蛋白。本公开文本还提供编码所述免疫调节蛋白的核酸分子。所述免疫调节蛋白提供针对多种免疫疾病、障碍或病症的治疗效用。提供了用于制备和使用这样的蛋白质的组合物和方法。


背景技术:

4.通过在涉及可溶配体与其受体之间的相互作用的过程中进行干预来调节免疫应答越来越引起医学方面的兴趣。目前,用于增强或抑制免疫应答的生物制品通常限制于抗体(例如,抗pd-1抗体)或针对单一细胞表面分子的可溶受体(例如,fc-ctla-4)。需要改进的治疗剂,所述治疗剂可以调节免疫应答,特别是b细胞免疫应答。提供了满足这种需求的实施方案。


技术实现要素:

5.本文提供一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白含有至少一种taci多肽,所述taci多肽是截短的野生型taci细胞外结构域或者是其变体,其中所述截短的野生型taci细胞外结构域含有富半胱氨酸结构域2(crd2)但缺少完整的富半胱氨酸结构域1(crd1),其中
所述变体taci多肽包含所述截短的野生型taci细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。
6.本文提供一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白含有至少一种taci多肽,所述taci多肽是截短的野生型taci细胞外结构域或者是其变体,其中关于seq id no:122中所示的位置,所述截短的野生型taci细胞外结构域由氨基酸残基67-118内所含的由氨基酸残基71-104组成的连续序列组成,其中所述变体taci多肽包含所述截短的野生型taci细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。在一些任何实施方案中,所述截短的野生型taci细胞外结构域的长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50或51个氨基酸。在一些任何实施方案中,所述截短的野生型taci细胞外结构域由seq id no:122中所示的氨基酸残基68-110组成。在一些任何实施方案中,所述taci多肽由seq id no:13中所示的氨基酸序列组成,或者是其含有seq id no:13中所示序列中的一个或多个氨基酸取代的变体。
7.本文提供一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白含有至少一种taci多肽,所述taci多肽是由seq id no:13中所示的氨基酸序列组成的截短的taci多肽或其含有seq id no:13中所示序列中的一个或多个氨基酸取代的变体。在一些任何实施方案中,所述截短的taci多肽或其变体与april、baff或baff/april异三聚体结合。在一些任何实施方案中,所述taci多肽是由seq id no:1中所示的序列组成的截短的野生型taci细胞外结构域。在一些任何实施方案中,所述taci多肽是由seq id no:13中所示的序列组成的截短的野生型taci细胞外结构域。
8.本文提供一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白含有由seq id no:13中所示的序列组成的截短的taci多肽。在一些任何实施方案中,所述taci多肽是变体taci多肽,其中与所述截短的taci多肽相比,所述变体taci多肽具有增加的与april和baff中的一种或两种的结合亲和力。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽包含在对应于seq id no:122中所示编号的选自74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处的一个或多个氨基酸取代。
9.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代选自e74v、q75e、q75r、g76s、k77e、f78y、y79f、l82h、l82p、l83s、r84g、r84l、r84q、d85e、d85v、c86y、i87l、i87m、s88n、i92v、q95r、p97s、k98t、q99e、a101d、y102d、f103s、f103v、f103y或其保守氨基酸取代。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括e74v、k77e、y79f、l82h、l82p、r84g、r84l、r84q、d85v或c86y中的至少一个。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是d85e/k98t、i87l/k98t、l82p/i87l、g76s/p97s、k77e/r84l/f103y、y79f/q99e、l83s/f103s、k77e/r84q、k77e/a101d、k77e/f78y/y102d、q75e/r84q、q75r/r84g/i92v、k77e/a101d/y102d、r84q/s88n/a101d、r84q/f103v、k77e/q95r/a101d或i87m/a101d。在一些实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是k77e/f78y/y102d。在一些实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是q75e/r84q。在一些实施方案中,所述变体taci多肽示于seq id no:26中。在一些实施方案中,所述变体taci多肽示于seq id no:27中。
10.在一些任何实施方案中,所述taci多肽是变体taci多肽,所述变体taci多肽包含参考taci多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代位于对应于seq id no:122中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。
11.本文提供一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白含有至少一种变体taci多肽,其中所述至少一种变体taci多肽包含参考taci多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代位于对应于seq id no:122中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。
12.本文提供一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白是变体taci-fc融合蛋白,所述变体taci-fc融合蛋白含有变体taci多肽、fc区以及所述taci多肽与所述fc区之间的接头,其中所述变体taci多肽包含参考taci多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代位于对应于seq id no:122中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。
13.在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽是截短的多肽,所述截短的多肽由taci的细胞外结构域或其与april、baff或baff/april异三聚体结合的特异性结合部分组成。
14.在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽包含(i)seq id no:122中所示的氨基酸序列,(ii)具有与seq id no:122的至少95%序列同一性的氨基酸序列;或者(iii)(i)或(ii)的含有crd1结构域和crd2结构域中的一个或两个的部分,所述部分与april、baff或baff/april异三聚体结合。
15.在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽缺少n末端甲硫氨酸。
16.在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽包含所述crd1结构域和所述crd2结构域。
17.在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽包含seq id no:1中所示的序列。在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽由seq id no:1中所示的序列组成。
18.在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽基本上由所述crd2结构域组成。
19.在一些任何实施方案中,参考taci多肽包含seq id no:13中所示的序列。在一些任何实施方案中,所述参考taci多肽由seq id no:13中所示的序列组成。
20.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代选自w40r、q59r、r60g、t61p、e74v、q75e、q75r、g76s、k77e、f78y、y79f、l82h、l82p、l83s、r84g、r84l、r84q、d85e、d85v、c86y、i87l、i87m、s88n、i92v、q95r、p97s、k98t、q99e、a101d、y102d、f103s、f103v、f103y或其保守氨基酸取代。
21.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括e74v、k77e、y79f、l82h、l82p、r84g、r84l、r84q、d85v或c86y中的至少一个。
22.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括选自以下的氨基酸取代:q75e、k77e、f78y、r84g、r84q、a101d和y102d或其任何组合。
23.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代q75e。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代k77e。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代f78y。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代r84g。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代r84q。在一些任何实施方案中,所述一个或多
个氨基酸取代包括至少氨基酸取代a101d。
24.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/r84q。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/k77e。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/f78y。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f77e/f78y。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括k77e/r84q。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括k77e/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括k77e/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f78y/r84q。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f78y/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f78y/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括r84q/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括r84q/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括a101d/y102d。
25.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是d85e/k98t、i87l/k98t、r60g/q75e/l82p、r60g/c86y、w40r/l82p/f103y、w40r/q59r/t61p/k98t、l82p/i87l、g76s/p97s、k77e/r84l/f103y、y79f/q99e、l83s/f103s、k77e/r84q、k77e/a101d、k77e/f78y/y102d、q75e/r84q、q75r/r84g/i92v、k77e/a101d/y102d、r84q/s88n/a101d、r84q/f103v、k77e/q95r/a101d或i87m/a101d。
26.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是r84g、a101d、k77e/r84q、k77e/a101d、k77e/f78y、k77e/f78y/y102d、q75e/r84q、k77e/a101d/y102d、r84q、k77e、a101d、q75e、k77e/f78y/r84q、f78y、f78y/r84q、f78y/a101d、f78y/y102d或k77e/y102d。
27.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是k77e/f78y/y102d。
28.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是q75e/r84q。
29.在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代是k77e/a101d/y102d。
30.在一些任何实施方案中,与所述参考taci多肽相比,所述变体taci多肽具有多达10个氨基酸修饰。在一些任何实施方案中,与所述参考taci多肽相比,所述变体taci多肽具有多达5个氨基酸修饰。
31.在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽具有与seq id no:122或其包含所述crd1结构域和/或所述crd2结构域的特异性结合片段的至少90%序列同一性。在一些实施方案中,所述变体taci多肽具有与seq id no:122或其包含所述crd1结构域和/或所述crd2结构域的特异性结合片段的至少95%序列同一性。在一些实施方案中,所述特异性结合片段示于seq id no:1、seq id no:13、seq id no:130或seq id no:131中。
32.在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽具有与seq id no:13的至少90%序列同一性。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽具有与seq id no:13的至少95%序列同一性。
33.在一些任何实施方案中,与所述参考taci多肽相比,所述变体taci多肽具有增加的与april和baff中的一种或两种的结合亲和力。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽具有增加的与april的结合亲和力。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽具有增加的与baff的结合亲和力。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽具有增加的与april和
baff的结合亲和力。
34.在一些任何实施方案中,所述增加的对baff或april的结合亲和力是独立地增加超过约1.2倍、约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍或约60倍。
35.在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽包含seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的序列;或者所述变体taci多肽包含seq id no:14-20、23-35、92-100或177-192中任一项中所示的序列。
36.在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽由seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成;或者所述变体taci多肽由seq id no:14-20、23-35、92-100或177-192中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。
37.在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽由seq id no:26中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽由seq id no:27中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽由seq id no:107中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中,所述变体taci多肽由seq id no:20中所示的序列组成或基本上由其组成。
38.在一些任何实施方案中,所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自gsggs(seq id no:76)、ggggs(g4s;seq id no:77)、gsggggs(seq id no:74)、ggggsggggs(2xggggs;seq id no:78)、ggggsggggsggggs(3xggggs;seq id no:79)、ggggsggggsggggsggggs(4xggggs;seq id no:84)、ggggsggggsggggsggggsggggs(5xggggs;seq id no:91)、ggggssa(seq id no:80)、或gsggggsggggs(seq id no:194)或其组合。
39.在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白含有与所述至少一种taci多肽连接的异源部分。在一些任何实施方案中,所述异源部分是半衰期延长部分、多聚化结构域、与细胞表面上的分子结合的靶向部分或可检测标记。在一些任何实施方案中,所述半衰期延长部分包括多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺素的β亚基的c末端肽(ctp)、聚乙二醇(peg)、长非结构化亲水氨基酸序列(xten)、羟乙基淀粉(hes)、白蛋白结合小分子或其组合。在一些任何实施方案中,所述至少一种taci多肽与免疫球蛋白的fc区连接。在一些实施方案中,作为taci-fc融合蛋白的任何本文所提供的实施方案的免疫调节蛋白包括与免疫球蛋白的fc区连接的至少一种taci多肽。
40.在一些实施方案中,本文提供的免疫调节蛋白不包括与另一靶向部分连接的taci多肽,所述另一靶向部分与细胞表面上的分子结合。在一些实施方案中,本文提供的免疫调节蛋白不包括与靶向部分连接的taci多肽,所述靶向部分是t细胞刺激性受体的结合配偶体或t细胞刺激性受体的配体。在一些实施方案中,本文提供的免疫调节蛋白不包括与靶向部分连接的taci多肽,所述靶向部分是cd28的结合配偶体或cd28的配偶体(例如cd80或cd86)。在一些实施方案中,本文提供的免疫调节蛋白不包括与ctla-4多肽或者ctla-4的细胞外结构域或结合部分或其变体连接的taci多肽。例如,在所提供的方面,本文提供的免疫调节蛋白不包括与野生型ctla-4多肽或者其细胞外结构域或结合部分连接的taci多肽。在所提供的方面,本文提供的免疫调节蛋白不包括与变体ctla-4多肽或者其细胞外结构域或结合部分(如含有ctla-4的细胞外结构域中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)例如以增加与一种或多种同源结合配偶体的结合亲和力的变体ctla-4或其结合部分)连接的taci多
肽。
41.在一些任何实施方案中,所述免疫球蛋白fc是igg4 fc结构域,或者是其变体。在一些实施方案中,所述igg4 fc结构域具有seq id no:139中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述igg4 fc结构域是其含有突变s228p的变体。在一些实施方案中,所述igg4 fc结构域具有seq id no:140或seq id no:220中所示的氨基酸序列。
42.在一些任何实施方案中,taci-fc的fc融合蛋白是二聚体。在一些任何实施方案中,所述免疫球蛋白fc区是同二聚fc区。
43.在一些任何实施方案中,所述免疫球蛋白fc是igg1 fc结构域,或者是展现降低的与fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的变体fc,任选地如与野生型igg1 fc结构域相比。在一些任何实施方案中,所述免疫球蛋白fc示于seq id no:71中。在一些实施方案中,所述免疫球蛋白fc是igg1 fc结构域,并且所述fc包括seq id no:81中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中,所述免疫球蛋白fc是变体igg1 fc结构域,其含有按照eu编号选自l234a、l234v、l235a、l235e、g237a、s267k、r292c、n297g和v302c的一个或多个氨基酸取代。在一些任何实施方案中,所述免疫球蛋白fc区含有按照eu编号的氨基酸取代l234a、l235e和g237a或者按照eu编号的氨基酸取代r292c、n297g和v302c。在一些实施方案中,所述fc区包含按照eu编号的氨基酸取代l234a、l235e和g237a。在一些实施方案中,所述fc区示于seq id no:73、75、83、136或221中。在一些实施方案中,所述免疫球蛋白fc区还包含氨基酸取代a330s和p331s。在一些实施方案中,所述免疫球蛋白fc区示于seq id no:175或seq id no:176中。
44.在一些实施方案中,所述fc是包括seq id no:73中所示的氨基酸序列的变体fc。
45.在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白是异二聚体,其中所述二聚体的每个多肽与单独含有野生型fc结构域中的一个或多个氨基酸修饰的免疫球蛋白fc结构域连接,以在所述多肽之间实现异二聚体形成。在一些任何实施方案中,所述野生型免疫球蛋白fc是igg1 fc结构域。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸修饰选自杵臼结构(knob-into-hole)修饰和电荷突变以减少或防止由于电荷排斥所致的自缔合。
46.在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白含有一个或多个氨基酸取代以降低与fc受体的结合亲和力和/或降低效应子功能,任选地如与野生型igg1 fc结构域相比。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代按照eu编号选自l234a、l234v、l235a、l235e、g237a、s267k、r292c、n297g和v302c。在一些任何实施方案中,所述免疫球蛋白fc区含有按照eu编号的氨基酸取代l234a、l235e和g237a或者按照eu编号的氨基酸取代r292c、n297g和v302c。
47.在一些任何实施方案中,所述taci-fc融合蛋白包含以下结构:taci多肽(taci)-接头-fc区。在一些实施方案中,所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:168中。在一些实施方案中,所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:170中。在一些实施方案中,所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:167中。在一些实施方案中,所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:169中。在一些实施方案中,所述免疫调节蛋白是包含所述taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
48.本文提供一种免疫调节性taci-fc融合蛋白,所述免疫调节性taci-fc融合蛋白是包含通过共价二硫键连接的seq id no:167中所示的taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的
同二聚体。
49.本文提供一种免疫调节性taci-fc融合蛋白,所述免疫调节性taci-fc融合蛋白是包含通过共价二硫键连接的seq id no:168中所示的taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
50.本文提供一种免疫调节性taci-fc融合蛋白,所述免疫调节性taci-fc融合蛋白是包含通过共价二硫键连接的seq id no:169中所示的taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
51.本文提供一种免疫调节性taci-fc融合蛋白,所述免疫调节性taci-fc融合蛋白是包含通过共价二硫键连接的seq id no:170中所示的taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
52.在一些任何实施方案中,所述taci-fc融合蛋白包含以下结构:(taci)-接头-fc区-接头-(taci)。在一些实施方案中,所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:201中。在一些实施方案中,所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:202中。在一些实施方案中,所述免疫调节蛋白是包含所述taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
53.在一些任何实施方案中,所述taci-fc融合蛋白包含以下结构:(taci)-接头-(taci)-接头-fc区。在一些实施方案中,所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:198中。在一些实施方案中,所述免疫调节蛋白是包含所述taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
54.在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)阻断april、baff或april/baff异三聚体与bcma或taci的结合;并且所述免疫调节蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环april、baff或april/baff的水平。在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)阻断april、baff或april/baff异三聚体与bcma或taci的结合。在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)在施用至受试者之后降低血液中循环april、baff或april/baff的水平。
55.在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)降低或抑制b细胞成熟、分化和增殖。在一些任何实施方案中,所述免疫调节蛋白降低或抑制b细胞成熟、分化或增殖。
56.在一些实施方案中,所述fc融合蛋白中和april和baff。在一些实施方案中,中和april的ic50是小于100pm、小于50pm、小于40pm、小于30pm、小于20pm、小于10pm、小于5pm或小于1pm,或者是前述任一项之间的任何值;和/或中和baff的ic50是小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于75pm、小于50pm、小于25pm或小于10pm,或者是前述任一项之间的任何值。
57.本文提供一种或多种核酸分子,所述核酸分子编码任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)。在一些任何实施方案中,所述核酸分子是合成核酸。在一些任何实施方案中,所述核酸分子是cdna。
58.本文提供一种载体,所述载体含有任何本文所述的实施方案的核酸分子。在一些任何实施方案中,所述载体是表达载体。在一些任何实施方案中,所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
59.本文提供一种细胞,所述细胞含有任何本文所述的实施方案的核酸或任何本文所
述的实施方案的载体。在一些任何实施方案中,所述细胞是哺乳动物细胞。在一些任何实施方案中,所述细胞是人细胞。
60.本文提供一种产生免疫调节蛋白的方法,所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将任何本文所述的实施方案的核酸分子或任何本文所述的实施方案的载体引入所述细胞中。在一些任何实施方案中,所述方法包括从所述细胞分离或纯化所述免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)。本文提供一种产生fc融合蛋白的方法,所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将任何本文所提供的实施方案的核酸分子或任何本文所提供的实施方案的载体引入所述细胞中。
61.本文提供一种通过任何本文所述的实施方案的方法产生的免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)。本文提供一种通过任何本文所述的实施方案的方法产生的fc融合蛋白。
62.本文提供一种药物组合物,所述药物组合物含有任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白(例如fc融合蛋白)。在一些任何实施方案中,所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。在一些任何实施方案中,所述药物组合物是无菌的。
63.本文提供一种制品,所述制品包括在小瓶或容器中的任何本文所述的实施方案的药物组合物。在一些任何实施方案中,所述小瓶或容器是密封的。
64.本文提供一种试剂盒,所述试剂盒含有任何本文所提供的实施方案的药物组合物和使用说明书。在一些任何实施方案中,所述试剂盒包括任何本文所述的实施方案的制品和使用说明书。
65.本文提供一种降低受试者的免疫应答的方法,所述方法包括将任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。
66.本文提供一种降低受试者的免疫应答的方法,所述方法包括将任何本文所述的实施方案的fc融合蛋白施用至有需要的受试者。
67.本文提供一种降低受试者的免疫应答的方法,所述方法包括将任何本文所述的实施方案的药物组合物施用至有需要的受试者。在一些任何实施方案中,b细胞免疫应答在受试者中降低,借此使b细胞成熟、分化和/或增殖降低或抑制。在一些任何实施方案中,april、baff或april/baff异三聚体的循环水平在所述受试者中降低。
68.本文提供一种降低受试者的april、baff或april/baff异三聚体的循环水平的方法,所述方法包括将任何本文所述的实施方案的药物组合物施用至所述受试者。在一些任何实施方案中,t细胞免疫应答在所述受试者中降低,借此使t细胞共刺激降低或抑制。在一些任何实施方案中,降低所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。
69.本文提供一种治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法,所述方法包括将任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。
70.本文提供一种治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法,所述方法包括将任何本文所述的实施方案的fc融合蛋白施用至有需要的受试者。
71.本文提供一种治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法,所述方法包括将任何本文所述的实施方案的药物组合物施用至有需要的受试者。在一些任何实施方案中,所述疾病、障碍或病症是自身免疫性疾病、炎性病症、b细胞癌、抗体介导的病状、肾病、移植物排斥、移植物抗宿主病或病毒感染。在一些任何实施方案中,所述疾病、障碍或病症选自:系统性红斑狼疮(sle);舍格伦综合征、硬皮病、多发性硬化、糖尿病、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬
fc融合分子。
82.图5显示相对于taci 13-118-fc、taci 30-110-fc和贝利木单抗,用于阻断人april(上图)和baff(下图)介导的信号传导的人taci td fc融合分子。
83.图6a-图6i显示在人sle的nzb/nzw鼠模型中评估的参数的分析。在20周龄开始评估蛋白尿得分(图6a)、体重的平均变化百分比(图6b)和存活率百分比(图6c)。针对抗双链dna igg滴度(图6d)和血尿素氮(bun)(图6e)分析血清(****相比于fc,通过student's t检验,对于抗dsdna igg,p《0.0001;***相比于fc,通过student'st检验,对于bun-4,p=0.0008)。对肾进行处理并在重复过碘酸希夫(pas)染色切片中通过组织学加以分析,且单独的组分和总组织学得分描绘于图6f中。还将冷冻的肾脏切片并染色用于小鼠igg和补体c3肾小球沉积的免疫组织化学分析,分别如图6g和图6h中所示。图6i显示组织学得分
±
sem。
84.图7显示taci突变(k77e/f78y/y102d)抑制april(左图)和baff(右图)介导的信号传导的能力,通过jurkat/nf-κb/taci细胞中的萤光素酶产生来定量。
85.图8a和图8b描绘示例性taci-fc融合蛋白的示意性代表图。图8a描绘含有两个富半胱氨酸假重复序列(crd)的示例性taci-fc融合蛋白。图8b描绘含有一个富半胱氨酸假重复序列(crd,例如crd2)的示例性taci-fc融合蛋白。
86.图9描绘用于鉴定与参考序列相比序列中的相应残基的示例性序列比对。两个比对的氨基酸之间的符号“*”指示比对的氨基酸是相同的。符号
“‑”
指示比对中的空位。用于本文所述的氨基酸取代的示例性非限制性位置用粗体文本指示。基于具有共有的相同残基的两个类似序列的比对,技术人员可以通过使用保守且相同的氨基酸残基作为指导与参考序列相比较来鉴定序列中的“相应”位置。图9提供seq id no:122中所示的参考taci细胞外结构域序列(含有具有crd1和crd2以及起始甲硫氨酸残基的完整细胞外结构域)与seq id no:13中所示的taci细胞外结构域序列(仅含有单一crd,即crd2)的示例性比对;比对相同残基显示,例如,seq id no:13中的氨基酸残基e7对应于seq id no:122中的残基e74,seq id no:13中的氨基酸残基k10对应于seq id no:122中的残基k77,seq id no:13中的氨基酸残基y12对应于seq id no:122中的y79,seq id no:13中的氨基酸残基l15对应于seq id no:122中的l82,seq id no:13中的氨基酸残基r17对应于seq id no:122中的r84;并且seq id no:13中的氨基酸残基d16对应于seq id no:122中的d85。技术人员可以熟练地在两个类似蛋白质序列之间进行类似比对以鉴定对应残基,包括基于本文的例示和描述来进行。
87.图10a-图10d显示鼠钥孔血蓝蛋白(klh)模型中评估的参数的分析。将血清-klh igm od水平评估为初次应答(图10a)和再次应答(图10b)。类似地,将血清抗klh igg1 od水平评估为初次应答(图10c)和再次应答(图10d)二者。
88.图11a-图11b显示从鼠钥孔血蓝蛋白(klh)免疫模型评估的收获的脾的分析。对脾进行处理并通过重量(图11a)以及总细胞数量(图11b)加以分析。
89.图12描绘从鼠钥孔血蓝蛋白(klh)模型针对细胞亚型群体组成评估的脾的分析,并且显示相对于组平均值的b细胞子集数量的结果。
90.图13描绘从鼠钥孔血蓝蛋白(klh)模型针对细胞亚型表型组成评估的脾的分析,并且显示生发中心b细胞和浆细胞的数量的结果(图13)。
91.图14a-图14d描绘鼠钥孔血蓝蛋白(klh)模型中的t细胞数量。脾cd3+、cd8+、cd4+
和滤泡辅助t细胞分别描绘于图14a、图14b、图14c和图14d中。
92.图15描绘鼠钥孔血蓝蛋白(klh)模型中的tcm和tem细胞群体。
93.图16a-图16b和图17a-图17b描绘在用所测试分子治疗后,在易患糖尿病的小鼠中涎腺炎(图16a-图16b)和胰岛炎(图17a-图17b)的总体发病率和程度。
具体实施方式
94.本文提供免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白与一种或多种配体(例如作为可溶因子产生的)接合,以抑制或降低b细胞应答或活性。所提供的免疫调节蛋白包括与baff或april配体结合以中和其活性并阻断或拮抗b细胞刺激性受体(如taci或bcma)的活性的蛋白质。所提供免疫调节蛋白可以是taci细胞外结构域或其结合部分(下文的taci ecd)与多聚化结构域的融合蛋白,如免疫球蛋白fc。例如,本文提供taci-fc融合蛋白。在一些实施方案中,本文提供的免疫调节蛋白可以用于治疗与失调的免疫应答相关,如与炎性或自身免疫性症状相关的疾病、障碍或病症,包括炎性疾病或自身免疫性疾病。
95.免疫系统依赖于免疫检查点来预防自身免疫(即,自身耐受)并防止组织在免疫应答期间(例如在针对病原体感染的攻击期间)受到过度损伤。然而,在一些情形中,免疫系统可能变得失调并且可能针对正常身体部分或组织发动异常免疫应答,从而导致自身免疫性疾病或病症或自身免疫性症状。在其他情形中,可能对外来组织如移植物发动不期望的免疫应答,从而导致移植排斥。
96.在一些方面,改变免疫细胞活性(如b细胞活性)的免疫疗法可以治疗免疫应答失调的某些疾病、障碍和病症。特定地,免疫应答(如b细胞应答)的抑制或减弱对于减少或预防不期望的炎症、自身免疫性症状和/或移植排斥可能是合意的。然而,追求调节配体与其受体之间的介导免疫应答的相互作用的治疗方法并不完全令人满意。在一些情形中,用于干预和改变免疫细胞(例如或b细胞)激活的免疫调节作用的疗法受制于空间定向要求以及免疫突触界限所施加的大小限制。在一些方面,现有的治疗药物(包括抗体药物)可能无法同时与调节这些相互作用中所涉及的多种靶蛋白相互作用。例如,可溶受体和抗体通常竞争性结合(例如,一次结合不超过一个靶种类),并因此缺少同时结合多个靶标的能力。另外,独立地靶向这些受体中的一种的药物之间的药代动力学差异可能在整个治疗过程中在适当维持靶向两个不同靶标的药物组合的所需血液浓度方面造成困难。
97.baff和april是结合b细胞上的taci和bcma二者的tnf超家族成员;baff还结合第3种受体baff-r。baff和april一起支持b细胞发育、分化和存活,特别是对于浆母细胞和浆细胞,并且在b细胞相关自身免疫性疾病的发病机制中起作用。它们的共中和明显降低b细胞功能,包括抗体产生,而对单独的baff或april的抑制介导相对不大的效应。野生型(wt)taci的fc融合物(例如阿塞西普和泰它西普)靶向baff和april二者,并且已经在例如系统性红斑狼疮(sle)和iga肾病中显示有前景的临床潜力,但是尚未明确展现长期和/或完全疾病缓解。尽管b细胞靶向疗法已经显示有前景的治疗潜力,但它们并不完全令人满意。例如,可溶重组taci显示作为治疗药的很大前景,但它的有用性似乎受到对april的低至中亲和力妨碍。
98.所提供的实施方案包括提供改进的中和活性以及对b细胞应答的抑制或降低的那些。在一些实施方案中,所述改进的活性由所提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc融合蛋白)
与baff和/或april的增加的或改进的结合或相互作用介导。所提供的免疫调节蛋白阻断或拮抗baff或april(如baff或april的同三聚体、baff/april的异三聚体或baff 60聚体)与同源b细胞刺激性受体的相互作用,从而中和baff和/或april配体的活性。在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白降低一种或多种b细胞应答或活性,包括b细胞产生免疫球蛋白的能力。在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc融合蛋白)在施用至受试者时减少循环血清免疫球蛋白。在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白降低b细胞成熟、分化和增殖中的一种或多种。在所提供的方面,这样的活性相比于通过wt taci-fc融合蛋白(例如泰它西普或阿塞西普)实现的活性是改进的或更优的。在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白(taci-fc融合蛋白)是用于多种自身免疫性和炎性疾病、特别是b细胞相关疾病(如sle、sjs和其他结缔组织病)的治疗的候选治疗药。
99.所提供的实施方案涉及变体taci多肽的鉴定,所述变体taci多肽在taci的第二富半胱氨酸结构域(crd2)(跨越残基68-110)的随机诱变和定向进化后被工程化以具有对april和/或baff的改进的亲和力。如本文所示,亲和力成熟包括在april与baff之间交替的五次选择,其中选择试剂浓度并行降低以维持选择压力。结果显示,如与野生型taci相比,变体taci多肽展现显著增强的对baff和april的亲和力。例如,本文提供含有一个或多个氨基酸取代(替代或突变)的变体taci多肽,所述取代赋予所述蛋白质对baff和/或april改进的结合亲和力。特定地,所提供的实施方案包括提供改进的组合baff和april抑制的那些。因此,所提供的免疫调节蛋白在自身免疫性或炎性疾病(包括严重的b细胞相关自身免疫性疾病,如sle)的治疗中提供有效且持久的疾病抑制。
100.例如,所提供的实施方案是基于如下发现:通过对taci的胞外域的tnfr结构域(td)的亲和力修饰进行的定向进化有利于对april和/或baff具有改进的亲和力的分子的开发。因此,所述亲和力修饰产生含有变体tnfr结构域(vtd)的变体taci。这样的分子与免疫球蛋白fc的融合得到抑制b细胞活性和应答的免疫调节蛋白。例如,再格式化为可溶fc融合蛋白,亲和力成熟的taci变体输出展现对april和baff的抑制,如本文在taci依赖性报告物测定中所示,并且其ic
50
值低于野生型taci-fc和贝利木单抗比较物。此外,所评价的动物模型中的结果显示快速且显著减少的关键淋巴细胞子集,包括浆细胞、生发中心b细胞和滤泡t辅助细胞。此外,所测试的变体分子在小鼠模型中展现改进的活性,包括自发sjs模型中显著减少的自身抗体和涎腺炎、bm12诱导的狼疮模型中受抑制的肾小球igg沉积以及nzb/w狼疮模型中有效抑制的抗dsdna自身ab、血尿素氮水平、蛋白尿、涎腺炎、肾病变和肾免疫复合物沉积。此外,如与野生型taci-fc相比,所测试的taci-fc融合物在小鼠中展现显著且持续降低的血清igm、igg和iga抗体滴度。本文的发现证实,这些免疫调节蛋白在体外和体内始终展现强效免疫抑制活性和功效,表现得优于现有的和/或批准的免疫调节剂,如贝利木单抗、阿巴西普、阿塞西普或泰它西普。这样的生物制品因此可以是用于治疗严重自身免疫性和/或炎性疾病(包括b细胞相关疾病,如sle、舍格伦综合征和其他结缔组织疾病)的有吸引力的开发候选物。
101.将在本技术中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入,其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致,则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
102.本文所用的章节标题仅用于组织目的,而不应解释为限制所描述的主题。i.定义
103.除非另外定义,否则本文所用的所有领域术语、符号以及其他技术和科学术语或命名都旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情形中,为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语,并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
104.除非上下文明确另有指示,否则如在本说明书和所附权利要求书中所用,单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述”包括复数指示物。
105.如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知晓的对应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如,提及“约x”的描述包括“x”的描述。
106.如在蛋白质的结构域的情况下使用的术语“亲和力修饰的”意指如下哺乳动物蛋白,其在细胞外结构域或其特异性结合部分中具有改变的氨基酸序列(相对于相应野生型亲代或未修饰的结构域),使得与亲代野生型或未修饰的(即,非亲和力修饰的结构域)蛋白质相比,其具有增加的或降低的与其结合配偶体(可替代地“反结构”)中的至少一种的结合活性(如结合亲和力)。在一些实施方案中,亲和力修饰的结构域可以含有野生型或未修饰的结构域中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸差异(如氨基酸取代)。结合活性(例如结合亲和力)的增加或降低可以使用熟知的结合测定(包括流式细胞术)来确定。larsen等人,american journal of transplantation,第5卷:443-453(2005)。还参见linsley等人,immunity,1:7930801(1994)。蛋白质与其一种或多种结合配偶体的结合活性(例如亲和力)的增加是增加至如下值:比野生型对照大至少10%,并且在一些实施方案中,比野生型对照值大至少20%、30%、40%、50%、100%、200%、300%、500%、1000%、5000%或10000%。蛋白质与其结合配偶体中的至少一种的结合活性(例如亲和力)的降低是降低至如下值:不大于对照的90%但不小于野生型对照值的10%,并且在一些实施方案中,不大于野生型对照值的80%、70%、60%、50%、40%、30%或20%但不小于10%。亲和力修饰的蛋白质在细胞外结构域或其特异性结合部分的一级氨基酸序列中通过氨基酸残基的取代、添加或缺失发生改变。术语“亲和力修饰的”不被视为对借之产生亲和力修饰的蛋白质的任何特定的起始组合物或方法强加任何条件。因此,亲和力修饰的蛋白质不限于随后通过任何特定的亲和力修饰过程转化为亲和力修饰的结构域的野生型蛋白质结构域。亲和力修饰的结构域多肽可以例如从野生型哺乳动物结构域序列信息开始生成,然后在电脑中针对与其结合配偶体的结合进行建模,最后进行重组或化学合成以产生物质的亲和力修饰的结构域组合物。在仅一个替代性例子中,亲和力修饰的结构域可以通过野生型结构域的定点诱变来产生。因此,亲和力修饰的td结构域表示产物,并且不一定是通过任何给定方法产生的产物。可采用多种技术,包括重组方法、化学合成或其组合。
107.术语“亲和力修饰的td结构域”是指肿瘤坏死受体超家族(tnfrsf)蛋白的成员或其tnf配体的亲和力修饰的结构域,其分别在其中具有tnfr结构域或tnf结构域的改变的氨基酸序列。例如,tnfrsf蛋白的亲和力修饰的td结构域具有tnfr结构域的改变的氨基酸序
列,所述改变的氨基酸序列由tnfrsf蛋白的细胞外结构域或其特异性结合部分内的至少一个富半胱氨酸结构域(crd)构成(相对于相应野生型亲代或未修饰的结构域),使得与含有非亲和力修饰的或未修饰的td结构域的亲代野生型或未修饰的蛋白质相比,其具有增加的或降低的与其结合配偶体(可替代地“反结构”)中的至少一种的结合活性(如结合亲和力)。
[0108]“亲和力修饰的taci”(也称为变体taci)是指拮抗或阻断b细胞刺激性受体的活性的taci蛋白分子。例如,taci与april和/或baff(其为b细胞刺激性受体的配体)结合,所述b细胞刺激性受体即b细胞成熟抗原(bcma)、b细胞激活因子受体(baff-r)以及跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci)。在特定实施方案中,bim包括taci的细胞外结构域,或者taci的细胞外结构域的与同源配体april和/或baff以及april和baff的异三聚体结合的含有tnf受体家族结构域(例如td,例如crd)的部分。taci的细胞外结构域或其部分的亲和力修饰的变体可以包括td中的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代),所述氨基酸修饰增加对同源配体(例如april和/或baff,以及april和baff的异三聚体)的结合亲和力。
[0109]
如本文所用,“b细胞刺激性受体”是指以下中的一种或多种:b细胞成熟抗原(bcma)、b细胞激活因子受体(baff-r),以及跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(taci),它们是在b细胞上表达的相关的肿瘤坏死因子(tnfr)超家族受体。这些相关受体与其同源配体baff和/或april或者april和baff的异三聚体的接合或连接调节b细胞稳态,包括b细胞存活、b细胞成熟和分化以及免疫球蛋白类别转换。b细胞刺激性受体通常含有细胞外部分、跨膜结构域和胞质区,其中所述胞质区含有一个或多个tnf受体相关因子(traf)结合位点。将各种traf分子募集至胞质结构域可以激活各种转录因子,如nf-κb(例如nf-κb1或nf-κb2),介导调节b细胞稳态的b细胞信号传导途径。
[0110]
如本文所用,“结合(bind)”、“结合(bound)”或其语法变型是指分子参与和另一种分子的任何有吸引力的相互作用,导致稳定缔合,其中这两种分子彼此非常靠近。结合包括但不限于非共价键、共价键(如可逆和不可逆共价键),并且包括分子之间的相互作用,所述分子如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子,如包括药物在内的化学化合物。
[0111]
如本文所用,结合活性是指分子(例如多肽)的与其是否以及如何结合一种或多种结合配偶体相关的特征。结合活性可以包括一种分子对结合配偶体的结合的任何量度。结合活性包括结合一种或多种结合配偶体的能力、其与结合配偶体结合的亲和力(例如高亲和力)、其与结合配偶体结合的亲合力、与结合配偶体的键合的强度和/或与结合配偶体结合的特异性或选择性。
[0112]
如本文所用术语“结合亲和力”意指在特异性结合条件下蛋白质对其结合配偶体(即,其反结构)的特异性结合亲和力。结合亲和力是指两种或更多种分子(如结合配偶体)之间的相互作用的强度,通常为两种结合配偶体之间的非共价相互作用的强度。亲和力修饰的结构域或含有亲和力修饰的结构域的免疫调节蛋白与结合配偶体的结合亲和力的增加或减弱是相对于未修饰的结构域(例如,天然或野生型td结构域)的结合亲和力确定的。用于确定结合亲和力或相对结合亲和力的方法是本领域中已知的,固相elisa免疫测定、fortebio octet、biacore测量或流式细胞术。参见例如,larsen等人,american journal of transplantation,第5卷:443-453(2005);linsley等人,immunity,第1卷(9):793-801(1994)。在一些实施方案中,结合亲和力可以通过流式细胞术来测量,如在流动结合测定中
基于平均荧光强度(mfi)来测量。
[0113]
如本文所用术语“结合亲合力”意指在特异性结合条件下蛋白质对其结合配偶体(即,其反结构)的特异性结合亲合力。在生化动力学中,亲合力是指单独非共价结合相互作用(如在蛋白质与其结合配偶体(即,其反结构)之间)的多重亲和力的累积强度。因此,亲合力与描述单一相互作用的强度的亲和力不同。
[0114]
术语“生物半衰期”是指物质(如免疫调节蛋白)丧失其药理学或生理学活性或浓度的一半所花费的时间长度。生物半衰期可能受以下影响:物质的消除、排泄、降解(例如,酶促降解/消化),或者在身体某些器官或组织中的吸收和浓缩。在一些实施方案中,生物半衰期可以通过确定物质的血浆浓度达到其稳态水平的一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估。可以用于衍生并增加蛋白质的生物半衰期的缀合物是本领域中已知的,并且包括但不限于多聚化结构域(例如fc免疫球蛋白结构域)、聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、xten(延长的重组肽;参见wo 2013130683)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、脂质(酰化),以及聚-pro-ala-ser(pas)、聚谷氨酸(谷氨酰化)。
[0115]
如本文所用术语“细胞表面反结构”(可替代地“细胞表面结合配偶体”)是在哺乳动物细胞上表达的反结构(可替代地是结合配偶体)。通常,所述细胞表面结合配偶体是跨膜蛋白。在一些实施方案中,所述细胞表面结合配偶体是受体。
[0116]
关于蛋白质(如受体、可溶配体)或关于其细胞外结构域或部分或其亲和力修饰的变体的术语“结合配偶体”或“反结构”是指参考蛋白质在特异性结合条件下特异性结合的至少一种分子(通常为天然哺乳动物蛋白)。在一些方面,亲和力修饰的结构域或含有亲和力修饰的结构域的免疫调节蛋白与天然或野生型蛋白质的相应结构域的结合配偶体特异性结合,但是亲和力有所增加或减弱。“细胞表面结合配偶体”是在哺乳动物细胞上表达的结合配偶体。通常,所述细胞表面结合配偶体是跨膜蛋白。在一些实施方案中,所述细胞表面结合配偶体是在形成免疫突触的细胞(如哺乳动物细胞,例如免疫细胞)上表达或由所述细胞表达的受体或受体的配体。
[0117]
关于与细胞表面分子结合的术语“顺式”是指与两种或更多种不同的细胞表面分子结合,其中每种存在于相同细胞的表面上。在一些实施方案中,顺式意指,所述两种或更多种细胞表面分子仅存在于形成is的两种哺乳动物细胞中的一种上或者仅存在于另一种(但并非两种)上。
[0118]
如本文所用的术语“保守氨基酸取代”意指如下氨基酸取代,其中氨基酸残基被另一氨基酸残基取代,所述另一氨基酸残基具有化学特性(例如,电荷或疏水性)相似的侧链r基。具有化学特性相似的侧链的氨基酸的组的例子包括:1)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;2)脂肪族-羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸;3)含酰胺的侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺;4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸;6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸;以及7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团为:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0119]
关于蛋白质位置的术语“对应于”,如核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置的叙述,如序列表中所述,是指在基于结构序列比对或使用标准比对算法(如gap算法)与所公开序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列,本领
域技术人员可例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴别相应残基。图9例示通过比对两个序列来鉴定对应残基。
[0120]
如本文所用,“结构域”(通常是3个或更多个,一般5或7个或更多氨基酸,例如10至200个氨基酸残基)是指分子(例如蛋白质或编码核酸)的一部分,其在结构上和/或功能上与所述分子的其他部分不同,并且是可鉴别的。例如,结构域包括多肽链的那些部分,所述部分可在由一个或多个结构基序构成的蛋白质内形成独立折叠的结构和/或借助功能活性(例如结合活性)而被识别。蛋白质可以具有一个或超过一个独特结构域。例如,结构域可以按照一级序列或结构与相关家族成员的同源性(如与基序的同源性)来鉴定、定义或区分。在另一个例子中,结构域可以通过其功能来区分,例如与生物分子(例如同源结合配偶体)相互作用的能力。结构域可独立地展现生物学功能或活性,使得结构域可独立地或与另一份子融合后发挥活性,例如结合。结构域可以是线性氨基酸序列或非线性氨基酸序列。多种多肽含有多个结构域。这样的结构域是已知的,并且可由本领域技术人员来鉴定。为了本文的示例,提供了定义,但应理解,通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要,可以使用适当的软件来鉴定结构域。应理解,提及氨基酸,包括提及用于描述结构域组织(例如td结构域的结构域组织)的示为seq id no的具体序列,是出于说明性目的,并不欲限制所提供的实施方案的范围。应理解,多肽和对其结构域的描述在理论上是基于与相似分子的同源性分析和比对而导出的。同样,在一些情形中,给定结构域(例如td)的相邻n和/或c末端氨基酸也可以包括在序列中,例如以确保所述结构域在表达时的适当折叠。因此,确切基因座可变,并且对于每种蛋白质不一定相同。例如,特定td结构域(如特定crd结构域)可能长或短几个氨基酸(1-10,如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。
[0121]
在本文中可互换使用的术语“胞外域”、“细胞外结构域”或“ecd”是指在从细胞表达全长形式的膜蛋白(如跨膜蛋白)时,所述膜蛋白的位于液泡膜外部(例如,细胞外部的空间)的区域。出于本文的目的,应理解,提及ecd时是指构成该区域的序列和结构域,且不要求含有ecd的蛋白质是膜蛋白或所述结构域存在于细胞外部。例如,可溶免疫调节蛋白可以含有与另一部分(如多聚化结构域,例如fc区)融合的膜蛋白的ecd序列。胞外结构域通常与特异性配体或特异性细胞表面受体相互作用,例如通过特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域来相互作用。结合结构域的例子包括富半胱氨酸结构域(crd)。tnfr超家族成员的胞外域含有td结构域(例如crd结构域)。因此,本文中提及ecd时包括膜蛋白的ecd的全长序列,以及其与配体或同源结合配偶体结合的含有crd的特异性结合片段。
[0122]
术语“有效量”或“治疗有效量”是指治疗组合物(如含有免疫调节蛋白或fc融合蛋白)在单独地(即,作为单一疗法)或与另外的治疗剂组合地离体(通过与来自患者的细胞接触)或体内(通过施用至患者体内)施用时,对疾病进展产生统计学显著的抑制(如例如通过改善或消除疾病的症状和/或病因)的量和/或浓度。用于治疗疾病、病症或障碍(如免疫系统疾病、病症或障碍)的有效量可以是减轻、减少或缓解与所述疾病、病症或障碍相关的至少一种症状或生物反应或效应、预防所述疾病、病症或障碍的进展或者改进患者的身体机能的量。在细胞疗法的情形中,有效量是施用于患者的细胞的有效剂量或数量。在一些实施方案中,所述患者是人患者。
[0123]
如本文所用,融合蛋白是指由含有两种或更多种蛋白质(在一些情形中,2、3、4、5或更多种蛋白质)的编码序列的核酸序列编码的多肽,其中所述编码序列位于同一阅读框
中,使得当在宿主细胞中转录并翻译融合构建体时,产生含有所述两种或更多种蛋白质的蛋白质。所述两种或更多种蛋白质中的每一种可以与构建体中的另一种蛋白质相邻,或者被接头多肽隔开,所述接头多肽含有1、2、3或更多个氨基酸,但通常少于20、15、10、9、8、7或6个氨基酸。由融合构建体编码的蛋白质产物被称为融合多肽。根据所提供的实施方案的融合蛋白的例子是fc融合蛋白,其含有与免疫球蛋白fc结构域连接的亲和力修饰的结构域(例如taci细胞外结构域或其含有crd的部分的变体)。
[0124]
术语“半衰期延长部分”是指多肽融合物或化学缀合物的部分,与未与所述部分如此缀合的蛋白质的半衰期相比,所述部分延长蛋白质在哺乳动物血清中循环的半衰期。在一些实施方案中,半衰期被延长大于或约1.2倍、约1.5倍、约2.0倍、约3.0倍、约4.0倍、约5.0倍或约6.0倍。在一些实施方案中,与没有半衰期延长部分的蛋白质相比,在体内施用后,半衰期被延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。半衰期是指蛋白质丧失其浓度、量或活性的一半所花费的时间长度。半衰期可例如通过使用elisa测定或活性测定来确定。示例性半衰期延长部分包括fc结构域、多聚化结构域、聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、xten(延伸的重组肽;参见,wo 2013130683)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、脂质(酰化)、和聚-pro-ala-ser(pas)以及聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
[0125]
免疫球蛋白分子的fc(可结晶片段)区或结构域(也称为fc多肽)主要对应于免疫球蛋白重链的恒定区,并且其在一些情形中负责多种功能,包括抗体的一种或多种效应子功能。fc结构域含有免疫球蛋白分子的部分或全部铰链结构域加上ch2和ch3结构域。在用于包括在所提供的融合蛋白中的一些情形中,fc铰链序列的全部或一部分可能缺失。fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中,fc是变体fc,其展现降低(例如降低大于约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)的活性以促进效应子功能。在一些实施方案中,除非关于具体的seq id no进行描述,否则提及fc区中的氨基酸取代是按照eu编号系统。eu编号是已知的,并且符合最新更新的imgt scientific chart(国际immunogenetics信息系统,http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/hu_ighgnber.html(创建:2001年5月17日,最后更新:2013年1月10日)和如以下文献中报道的eu索引:kabat,e.a.等人sequences of proteins of immunological interest.第5版us department of health and human services,nih公开号91-3242(1991)。
[0126]
免疫球蛋白fc融合物(“fc融合物”)(如免疫调节fc融合蛋白)是包含与免疫球蛋白的fc区可操作地连接的一种或多种多肽的分子。fc融合物可以包含例如与taci细胞外结构域或其含有crd的部分(包括其任何所提供的亲和力修饰的变体)可操作地连接的fc区。免疫球蛋白fc区可以与一种或多种多肽间接或直接连接。多种接头是本领域中已知的,并且可以任选地用于将fc与融合配偶体相连接以生成fc融合物。相同种类的fc融合物可以二聚化以形成fc融合物同二聚体。不同种类的fc融合物(例如杵臼结构工程化)可以用于形成fc融合物异二聚体。在一些实施方案中,fc是哺乳动物fc,如鼠或人fc。
[0127]
术语“宿主细胞”是指可用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的任何细胞。宿主细胞可以是原核生物,例如大肠杆菌(e.coli),或其可以是真核生物,例如,单细胞真核生物(例如,酵母或其他真菌)、植物细胞(例如,烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如,人类
细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物,例如在无血清培养基中生长的veggie cho和相关细胞系,或缺乏dhfr的cho株系dx-b11。
[0128]
本文所用的术语“免疫突触(immunological synapse)”或“免疫突触(immune synapse)”意指表达mhc i(主要组织相容性复合物)或mhc ii的哺乳动物细胞(如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(如效应t细胞或自然杀伤(nk)细胞)之间的界面。
[0129]
如本文所用术语“免疫球蛋白”(缩写为“ig”)与术语“抗体”(缩写为“ab”)同义,并且是指哺乳动物免疫球蛋白,包括5个人类类别中的任一类别:iga(其包括子类iga1和iga2)、igd、ige、igg(其包括子类igg1、igg2、igg3和igg4)和igm。所述术语还包括小于全长的免疫球蛋白,不论是完全或部分合成的(例如,重组或化学合成)还是自然产生的,包括其含有所述免疫球蛋白分子的可变重(vh)链和/或可变轻(vl)链区的至少一部分的任何片段,所述片段足以形成抗原结合位点并且在组装时足以特异性结合抗原。所述抗体还可包括恒定区的全部或一部分。这样的片段包括抗原结合片段(fab)、含有vh和vl的可变片段(fv)、含有连接在一条链中的vh和vl的单链可变片段(scfv)以及其他抗体v区片段,如fab'、f(ab)2、f(ab')2、dsfv双抗体、fc和fd多肽片段。因此,应理解,本文中提及抗体时包括全长抗体和抗原结合片段。术语抗体还包括具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、双抗体和单链分子。同双特异性和异双特异性的双特异性抗体包括在所述术语的含义内。抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体。抗体还包括合成抗体或重组产生的抗体。对于不同抗体类别的结构和特性,参见例如,basic and clinical immunology,第8版,daniel p.sties,abba i.terr和tristram g.parsolw(编辑),appleton&lange,norwalk,ct,1994,第71页和第6章。
[0130]
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用,指代呈其基本上完整形式的抗体,与抗体片段相反。全长抗体是典型地具有两个全长重链(例如,vh-ch1-ch2-ch3或vh-ch1-ch2-ch3-ch4)和两个全长轻链(vl-cl)以及铰链区的抗体,如通过分泌b细胞的抗体从哺乳动物物种(例如人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物等)产生的抗体和合成产生的具有相同结构域的抗体。具体地,全抗体包括具有重链和轻链(包括fc区的)的那些。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如,人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下,完整抗体可具有一种或多种效应物功能。
[0131]“抗体片段”包含完整抗体的一部分、所述完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段(包括但不限于fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、二硫键连接的fv(dsfv)、fd片段、fd'片段;双抗体;线性抗体(参见美国专利号5,641,870,实施例2;zapata等人,protein eng.8(10):1057-1062[1995]);单链抗体分子,包括单链fv(scfv)或单链fab(scfab);上文任一种的抗原结合片段以及来自抗体片段的多特异性抗体。
[0132]“fv”由通过非共价缔合连接的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域构成。从这两个结构域的折叠发散出六个互补决定区(cdr)(重链和轻链各有3个),它们贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而,即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的cdr的fv的一半)具有识别并结合抗原的能力,但是在一些情形中,其亲和力低于整个结合位点。
[0133]“dsfv”是指具有稳定v
h-v
l
对的工程化的分子间二硫键的fv。
[0134]“fd片段”是含有抗体重链的可变结构域(vh)和一个恒定区结构域(ch1)的抗体片段。
[0135]“fab片段”是通过用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白得到的抗体片段,或者具有合成(例如,通过重组方法)产生的相同结构的片段。fab片段含有轻链(含有v
l
和c
l
)以及含有重链可变结构域(vh)和重链的一个恒定区结构域(ch1)的另一条链。
[0136]“f(ab')2片段”是通过在ph 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白得到的抗体片段,或者具有合成(例如,通过重组方法)产生的相同结构的片段。f(ab')2片段基本上含有两个fab片段,其中每个重链部分含有另外几个氨基酸,包括形成接合两个片段的二硫键的半胱氨酸残基。
[0137]“fab'片段”是含有f(ab')2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
[0138]“fd'片段”是含有f(ab')2片段的一个重链部分的抗体片段。
[0139]“fv'片段”是仅含抗体分子的vh和v
l
结构域的片段。
[0140]“scfv片段”是指含有通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(v
l
)和可变重链(vh)的抗体片段。所述接头的长度使得两个可变结构域在不被严重干扰的情况下桥接。示例性接头是(gly-ser)n残基,其中一些glu或lys残基遍布各处以增加溶解性。
[0141]“双抗体”是二聚scfv;双抗体通常具有短于scfv的肽接头,并且优先发生二聚化。
[0142]
如本文所用术语“免疫活性”是指免疫细胞(如t细胞或b细胞)的一种或多种活性,包括例如激活、细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生(例如干扰素-γ)、细胞毒性活性或者激活nf-κb途径或导致激活免疫细胞中的转录因子的其他信号传导级联的能力。可以将用于评估免疫调节蛋白的免疫活性的测定与具有抑制活性的对照蛋白相比较。
[0143]“免疫调节蛋白”或“免疫调节多肽”是调节免疫活性的蛋白质。“调节(modulation)”或“调节(modulating)”免疫应答意指增强或阻抑免疫活性。这样的调节包括对免疫细胞(如b细胞或t细胞)的免疫活性的任何诱导、或者程度或范围的改变、或者抑制。例如,本文中的可溶fc融合蛋白可以抑制b细胞的免疫活性。免疫调节蛋白可以是单一多肽链或通过例如链间二硫键相互共价键结的至少两条多肽链的多聚体(二聚体或更高级多聚体)。因此,单体、二聚和更高级多聚蛋白在所定义术语的范围内。多聚蛋白可以是同多聚(具有相同多肽链)或异多聚(具有不同多肽链)。
[0144]
如本文所用,修饰是关于对多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰,并且分别包括序列的氨基酸或核苷酸的变化。氨基酸修饰或变化可以分别是氨基酸或核苷酸缺失、插入或替代(取代)。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的,如通过使用重组dna方法。
[0145]
术语“多聚化结构域”是指促进两种或更多种多肽的多聚体形成的氨基酸序列。多聚化结构域包括促进多肽分子与一种或多种另外的多肽分子的稳定相互作用的序列,每种另外的多肽分子含有互补多聚化结构域(例如第一多聚化结构域和第二多聚化结构域),所述互补多聚化结构域可以是相同或不同的多聚化结构域。互补多聚化结构域之间的相互作用(例如,第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的相互作用)形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用,以产生多肽分子与另外的多肽分子的多聚体。在一些情况下,多聚化结构域是相同的并且与自身相互作用,以在两条多肽链之间形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。通常,多肽与多聚化结构域直接或间接接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列
或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区和相容的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。例如,多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域,如例如来自igg(包括igg1、igg2、igg3或igg4亚型)、iga、ige、igd和igm及其修饰形式的fc结构域或其部分。
[0146]
术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用,是指呈单链或双链形式的核酸残基(例如,脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。除非明确限制,否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,并且所述类似物具有与天然核苷酸类似的结合特性,并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有指示,否则特定核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指示的序列。具体地,简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语核酸或多核苷酸涵盖基因编码的cdna或mrna。
[0147]
如本文所用术语“呈可操作的组合”、“按可操作的顺序”和“可操作地连接的”是指核酸序列的连接方式或定向使得区段的排列使它们协同作用于其既定目的。在一些实施方案中,所述术语是指核酸连接以产生能够引导给定基因的转录的核酸分子,和/或产生具有功能性的所需蛋白质分子。例如,dna序列的区段(例如编码序列和一个或多个调节序列)以这样的方式连接以允许在适当分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时进行基因表达。
[0148]
术语“药物组合物”是指适合于哺乳动物受试者(通常是人)的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如,免疫调节蛋白)以及载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0149]
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。所述术语并非是指特定长度的产物。因此,“肽”和“寡肽”包括于多肽的定义内。所述术语包括多肽的翻译后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。所述术语还包括其中包括一个或多个氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸的分子,如可合成或使用已知的蛋白质工程化技术重组表达的。另外,蛋白质可通过熟知的有机化学技术如本文所述来衍生。
[0150]
如应用于核酸(如编码免疫调节蛋白或蛋白质(例如免疫调节蛋白)的核酸)的术语“纯化的”通常表示如通过本领域熟知的分析技术所确定基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如,纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散谱带)。例如,在电泳凝胶中产生基本上一个谱带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或蛋白质是至少约50%纯的,通常至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、99%或更高纯度(例如,重量百分比或以摩尔计)。
[0151]
术语“重组”表明,材料(例如,核酸或多肽)已通过人为干预发生人工(即非天然)改变。所述改变可以对处于其自然环境或状态内的材料进行,或者对从其自然环境或状态取出的材料进行。例如,“重组核酸”是例如在克隆、亲和力修饰、dna改组或其他熟知的分子生物学程序期间通过重组核酸来制备的核酸。“重组dna分子”是由借助此类分子生物学技术接合在一起的dna区段构成。如本文所用术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组dna分子表达的蛋白质分子(例如,免疫调节蛋白)。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸或以其他方式通过遗传工程化改变的细胞,例如通过向细胞中引入编码重组蛋白(例如本文所提供的免疫调节蛋白)的核酸分子来改变。真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由dna序列的短阵列组成,所述序列与参与转录的细胞蛋
白特异性相互作用。已经从多种真核来源分离出启动子和增强子元件,所述来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件,即启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于要使用何种细胞类型来表达目的蛋白质。
[0152]
如本文所用术语“重组表达载体”是指含有所需编码序列(例如,编码免疫调节蛋白)和在特定细胞中表达可操作连接的编码序列所需的适当核酸序列的dna分子。在原核生物中表达所需的核酸序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由重组表达载体编码,所述重组表达载体与编码序列可操作地连接使得所表达的蛋白质可以由重组宿主细胞分泌,如用于其作为可分泌蛋白质的表达或者用于更容易地从细胞分离或纯化免疫调节蛋白(如果需要的话)。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。所述载体包括病毒载体,如慢病毒载体。
[0153]
如本文所用术语“序列同一性”是指基因或蛋白质之间分别在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。“序列同一性”是蛋白质之间在氨基酸水平上的同一性量度以及核酸之间在核苷酸水平上的同一性量度。蛋白质序列同一性可通过比较在比对序列时每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定。类似地,核酸序列同一性可通过比较在比对序列时每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定。用于比对序列以供比较的方法是本领域中熟知的,这样的方法包括gap、bestfit、blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件、fasta和tfasta。blast算法计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计学分析。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)网站公开获得。在一些情形中,可以将序列同一性百分比确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后,候选序列中与参考序列中的氨基酸残基(或核苷酸残基)相同的氨基酸残基(或核苷酸残基)的百分比。提及序列同一性时包括横跨所比较的每个序列的全长的序列同一性。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数,包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
[0154]
如本文关于蛋白质使用的术语“可溶的”意指,所述蛋白质并非膜蛋白或者未锚定于细胞膜中。可以通过仅包括细胞外结构域或其部分且不具有跨膜结构域将蛋白质构建为可溶蛋白。在一些情形中,可以通过直接或经由接头间接连接或附接至fc结构域或其他半衰期延长分子来改进蛋白质的溶解性,所述fc结构域或其他半衰期延长分子在一些情形中也可以改进所述蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面,可溶蛋白是fc融合蛋白。
[0155]
如本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质在特异性结合条件下与靶蛋白结合,使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质与足够统计量的随机肽或多肽集合的平均亲和力或亲合力的至少10倍,但是任选地50、100、250或500倍,或甚至至少1000倍的能力。特异性结合蛋白无需仅与单一靶标分子结合,而是可以与超过一种靶标分子特异性结合。在一些情形中,特异性结合蛋白可以与结构构象与靶蛋白类似的蛋白质(例如,旁系同源物或直系同源物)结合。技术人员将认识到,特异性结合至在不同物种的动物中具有相同功能的分子(即,直系同源物)或与靶分子具有基本上类似的表位的分子(例如,旁系同源物)是可能的,并且不会减弱相对于独特非靶标(例如,随机多肽)的统计学上有效的集合来确定的结合特
异性。因此,本发明的免疫调节蛋白可以由于交叉反应性而与超过一个不同种类的靶分子特异性结合。固相elisa免疫测定、fortebio octet或biacore测量可以用于确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常,两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数(kd)小于约1x10-5
m,并且通常低至约1x10-12
m。在本公开文本的某些方面,两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数小于约1x10-6
m、1x10-7
m、1x10-8
m、1x10-9
m、1x10-10
m或1x10-11
m或更小。
[0156]
如本文关于蛋白质使用的术语“特异性结合片段”或“片段”意指如下多肽,其短于全长蛋白或其特定结构域或区域,并且在体外和/或体内与所述全长蛋白或特定结构域或区域的结合配偶体特异性结合。特异性结合片段是关于多肽或多肽的结合结构域的全长细胞外结构域的片段,但是仍与所述结合结构域的结合配偶体结合。例如,特异性结合片段是关于全长tnfr家族成员或其全长tnfr结构域(td)(例如crd)的细胞外结构域的片段,但是仍与所述tnfr家族成员或tnfr家族成员的crd的结合配偶体结合。在一些实施方案中,所述特异性结合片段具有细胞外结构域或者细胞外结构域的结构域或区域的全长序列的至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列长度。在一些实施方案中,特异性结合片段可具有至少50个氨基酸,例如至少60、70、80、90、100或110个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中,特异性结合片段包括crd1和/或crd2结构域。在一些实施方案中,特异性结合片段包括crd2结构域。
[0157]
如本文所用,“受试者”是哺乳动物,如人或其他动物,并且通常是人。受试者可以是雄性或雌性,并且可以是任何合适的年龄,包括婴儿、幼年、青少年、成年和老年受试者。
[0158]
如本文所用,关于例如合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
[0159]
如本文所用术语“tnf受体超家族”或“tnfrsf”意指细胞表面细胞因子受体的组,所述细胞因子受体都是i型(n末端细胞外)跨膜糖蛋白,在其细胞外结构域中含有一至六个富半胱氨酸结构域(crd)。基于共有的结构特征将分子分类为该超家族的成员,所述结构特征包括存在于其n末端细胞外区域中的一个或多个富半胱氨酸结构域(crd),所述富半胱氨酸结构域通常在蛋白质与其同源结合配偶体或配体的结合中发挥作用。tnfrsf蛋白可以仅具有一个或几个crd(例如crd1、crd2等)。通常,tnfrsf成员的ecd或胞外域含有1与6个之间的crd假重复序列。例如,baff受体和bcma各自含有一个crd,而taci含有两个crd(crd1和crd2)。tnfrsf成员通常为三聚或多聚复合物,它们通过其半胱氨酸内二硫键来稳定。tnfrsf蛋白与其配体的结合促进细胞中的多种生物活性,如凋亡性细胞死亡或细胞存活和增殖的诱导。
[0160]
术语“td”是指tnfrsf蛋白或tnf家族配体的一个或多个结构性结构域。例如,tnfrsf蛋白的td是约40个氨基酸的富半胱氨酸结构域(crd)模块,其含有六(6)个保守半胱氨酸。因此,提及crd时也可以与关于tnfrsf蛋白的td的术语td互换使用。所述六个半胱氨酸参与链内二硫键的形成。tnfrsf成员的细胞外结构域(ecd)含有一个或多个crd结构域;因此,术语td也关于这样的蛋白质分子的ecd来使用。提及变体td(vtd)时是指td的变体或修饰的序列。
[0161]
关于与细胞表面分子的结合的术语“反式”是指与两种不同的细胞表面分子结合,其中每种存在于不同细胞的表面上。在一些实施方案中,反式意指,关于两种不同的细胞表面分子,第一种仅存在于形成is的两种哺乳动物细胞中的一种上,并且第二种仅存在于形
成is的两种哺乳动物细胞中的另一种上。
[0162]
如本文所用的术语“跨膜蛋白”意指基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白,所述脂质双层如在生物膜(如哺乳动物细胞)中或在人工构建体(如脂质体)中发现的那些脂质双层。跨膜蛋白包含跨膜结构域(“跨膜结构域”),所述跨膜蛋白通过所述跨膜结构域整合至脂质双层中,并且所述整合通过所述跨膜结构域在生理条件下是热力学稳定的。跨膜结构域通常可通过很多的市售生物信息学软件应用,基于其相对于与水性环境(例如胞质溶胶、细胞外液)相互作用的蛋白质区域提高的疏水性,从其氨基酸序列来预测。跨膜结构域通常为跨越膜的疏水性α螺旋。跨膜蛋白可一次或多次穿过脂质双层的两个层。
[0163]
如本文所用的术语疾病或障碍的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”意指减慢、停止或逆转疾病、病症或障碍的进展,如通过临床或诊断症状的减少、停止或消除所证实的,通过施用单独的或与如本文所述的另一种化合物组合的本发明的免疫调节蛋白或工程化细胞来实现。“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”还意指急性或慢性疾病、病症或障碍的症状严重程度的降低,或如例如在复发型或缓解型自身免疫性疾病病程或炎性病症的情形中复发率的降低,或在自身免疫性疾病或炎性病症的炎症方面的情形中炎症的减少。如在本发明的情况下使用的对疾病、病症或障碍的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”是指施用单独的或与另一种化合物组合的本发明的免疫调节蛋白,以预防疾病、病症或障碍或者疾病、病症或障碍的一些或所有症状的发生或发作,或者减小疾病、病症或障碍发作的可能性。
[0164]
如关于变体蛋白或多肽使用的术语“变体”(也称为“修饰的”或“突变体”,它们可以互换使用)意指通过人为干预产生的蛋白质,如哺乳动物(例如,人或鼠)蛋白质。变体是相对于未修饰的或野生型蛋白质或者相对于其结构域,具有改变的或修饰的氨基酸序列的多肽,如通过一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或其组合来改变或修饰。变体多肽可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸差异(如氨基酸取代)。变体多肽通常展现与相应形式的野生型或未修饰的蛋白质(如其成熟序列(缺少信号序列)或其含有细胞外结构域或其结合结构域的部分)的至少约50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性。非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸包括在可允许的取代或添加的范围内。变体蛋白不限于任何特定的制备方法,并且包括例如化学合成、重组dna技术或其组合。本发明的变体蛋白与至少一种或多种结合配偶体特异性结合。在一些实施方案中,改变的氨基酸序列导致改变的(即,增加的或降低的)与一种或多种结合配偶体的结合活性,如结合亲和力或亲合力。变体蛋白因此可以是如本文所述的“亲和力修饰的”蛋白质。
[0165]
如本文所用的可互换使用的术语“野生型”或“天然的(natural)”或“天然的(native)”是结合在自然界中发现且未通过人为干预修饰的生物材料(如核酸分子、蛋白质、宿主细胞等)来使用。ii.taci免疫调节蛋白和变体taci多肽
[0166]
本文提供taci免疫调节蛋白,其含有taci受体的细胞外结构域(ecd)或其变体的与至少一种taci同源结合配偶体结合的部分。本文还提供变体taci多肽,其展现改变的(例如增加的)对一种或多种taci同源结合配偶体的结合活性或亲和力。在一些实施方案中,所
述taci同源结合配偶体是baff或april中的一种或多种或者是baff/april异三聚体。所提供的taci免疫调节蛋白和多肽包括其可溶融合蛋白,其中细胞外结构域或其部分的taci部分与另一部分(如免疫球蛋白fc或其他多聚化结构域或半衰期延长部分)连接。因此,在一些实施方案中,所述免疫调节蛋白是taci-fc融合蛋白。在一些实施方案中,提供taci-fc融合蛋白,其含有(1)taci多肽,所述taci多肽由taci受体的细胞外结构域或其与至少一种taci同源结合配偶体结合的部分或其变体taci多肽构成,以及(2)fc结构域。所述taci多肽或变体taci多肽可以与fc结构域直接或间接(例如经由肽接头)连接。
[0167]
taci是肿瘤坏死因子受体家族成员,其特征为具有含有富半胱氨酸假重复序列结构域(crd)的细胞外结构域(ecd)。taci是膜结合受体,其具有含有两个富半胱氨酸假重复序列(crd1和crd2)的细胞外结构域、跨膜结构域和与caml(钙调节物和亲环蛋白配体)相互作用的胞质结构域,caml是位于细胞内囊泡处的整合膜蛋白,其在jurkat细胞中过表达时是nf-at激活的共诱导物。taci与b细胞和t细胞的子集相关。taci受体结合肿瘤坏死因子(tnf)配体家族的两个成员。一种配体命名为baff(tnf家族的b细胞激活因子),并且还以不同方式命名为ztnf4、“中性因子-α(neutrokine-α)”、“blys”、“tall-1”和“thank”(yu等人,国际公开号wo98/18921(1998);moore等人,science 285:269(1999);mukhopadhyay等人,j.biol.chem.274:15978(1999);schneider等人,j.exp.med.189:1747(1999);shu等人,j.leukoc.biol.65:680(1999))。另一种配体已经被命名为april,并且还以不同方式命名为“ztnf2”和“tnrf死亡配体-1”(hahne等人,j.exp.med.188:1185(1998);kelly等人,cancer res.60:1021(2000))。两种配体还被b细胞成熟受体(bcma)结合(gross等人,nature 404:995(2000))。taci受体与其配体baff或april的结合刺激b细胞应答,包括非t细胞依赖性b细胞抗体应答、同种型转换和b细胞稳态。
[0168]
全长taci的氨基酸序列示于seq id no:88中。所述蛋白质是iii型膜蛋白并且缺少信号肽;在真核细胞中表达后,n末端甲硫氨酸被去除。在一些实施方案中,成熟taci蛋白不含如seq id no:88中所示的n末端甲硫氨酸。taci的细胞外结构域(seq id no:88的氨基酸残基1-166;seq id no:122中所示的ecd)含有两个富半胱氨酸结构域(crd,下文也称为肿瘤坏死家族受体结构域或td),它们各自展现与baff和april结合的亲和力。第一富半胱氨酸结构域(crd1)含有seq id no:122中所示的序列的氨基酸残基34-66。第二富半胱氨酸结构域(crd2)对应于seq id no:122中所示的序列的氨基酸71-104。taci还在细胞外结构域含有在第二半胱氨酸重复序列后的约60个氨基酸的茎区,对应于seq id no:122中所示的序列的氨基酸残基105-165。
[0169]
在一些实施方案中,本文提供的变体taci多肽含有参考taci多肽(如含有crd(下文也称为td)的野生型或未修饰的taci多肽)的细胞外结构域中的一个或多个氨基酸修饰,如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加。因此,所提供的变体taci多肽是或包含变体td(“vtd”),其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于crd中。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸修饰(如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加)位于crd1区中。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸修饰(如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加)位于crd2区中。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸修饰(如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加)位于crd1区和crd2区二者内的氨基酸中。
[0170]
在一些实施方案中,参考(例如未修饰的)taci序列是野生型taci序列或者是其含有一个或两个crd的部分。在一些实施方案中,参考(例如,未修饰的)taci是或包含taci的细胞外结构域(ecd)或其含有一个或两个crd结构域的部分。在一些实施方案中,参考(例如,未修饰的)taci多肽的细胞外结构域包含crd1和crd2。然而,变体taci多肽无需包含crd1和crd2二者。在一些实施方案中,变体taci多肽包含crd1或其特异性结合片段或基本上由其组成。在一些实施方案中,变体taci多肽包含crd2或其特异性结合片段或基本上由其组成。在一些实施方案中,变体taci是可溶多肽并且缺少跨膜结构域。在一些实施方案中,变体taci多肽还包含跨膜结构域,并且在一些情形中也包含胞质结构域。
[0171]
在一些实施方案中,参考(例如,未修饰的)taci序列是哺乳动物taci序列。在一些实施方案中,参考(例如,未修饰的)taci序列可以是哺乳动物taci,其包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠taci。在一些实施方案中,参考(例如,未修饰的)taci序列是人的。示例性人taci序列的细胞外结构域示于seq id no:122中。
[0172]
在一些实施方案中,参考(例如,未修饰的)taci序列具有(i)seq id no:122中所示的氨基酸序列或其缺少n末端甲硫氨酸的序列,(ii)展现与seq id no:122的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性并且与april、baff或april/baff异三聚体结合的氨基酸序列,或者(iii)是(i)或(ii)的含有crd1和/或crd2的片段或部分,其中所述部分与april、baff或april/baff异三聚体结合。在一些实施方案中,参考(例如,未修饰的)taci序列缺少如seq id no:122中所示的n末端甲硫氨酸。taci细胞外结构域(ecd):seq id no:122msglgrsrrggrsrvdqeerfpqglwtgvamrscpeeqywdpllgtcmsckticnhqsqrtcaafcrslscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrspvnlppelrrqrsgevennsdnsgryqglehrgseaspalpglklsadqvalvyst
[0173]
在一些实施方案中,参考(例如未修饰的)taci序列是taci的细胞外结构域序列,其为ecd的相对于seq id no:122中所示的氨基酸序列含有n末端缺失的部分。在一些实施方案中,所述n末端缺失是n末端氨基酸残基1-28的缺失,所述残基对应于seq id no:122中所示的残基。在一些实施方案中,所述n末端缺失是n末端氨基酸残基1-29的缺失,所述残基对应于seq id no:122中所示的残基。在一些实施方案中,所述n末端缺失是n末端氨基酸残基1-30的缺失,所述残基对应于seq id no:122中所示的残基。在一些实施方案中,所述n末端缺失是n末端氨基酸残基1-31的缺失,所述残基对应于seq id no:122中所示的残基。在一些实施方案中,所述n末端缺失是n末端氨基酸残基1-32的缺失,所述残基对应于seq id no:122中所示的残基。在一些实施方案中,所述n末端缺失是n末端氨基酸残基1-33的缺失,所述残基对应于seq id no:122中所示的残基。
[0174]
在一些任何所提供的实施方案中,参考(例如未修饰的)taci序列是含有taci细胞外结构域的茎部分的一个或多个残基的缺失的ecd部分。在一些实施方案中,参考(例如未修饰的)taci序列是缺少一个或多个连续c末端氨基酸残基的ecd部分,所述连续c末端氨基酸残基在残基105处开始并且直至或包括氨基酸残基166,所述残基对应于seq id no:122中所示的ecd序列的残基。在一些实施方案中,ecd序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62缺失。
[0175]
在一些实施方案中,参考(例如未修饰的)taci序列含有具有连续氨基酸序列的ecd部分,所述连续氨基酸序列包括crd1和/或crd2(例如crd1和crd2或仅crd2)以及茎序列的仅区段或部分。合适的茎区段包括seq id no:122的氨基酸残基105至154的一个或多个氨基酸。例如,茎区段可以关于seq id no:122由以下组成:氨基酸残基105、氨基酸残基105至106、氨基酸残基105至107、氨基酸残基105至108、氨基酸残基105至109、氨基酸残基105至110、氨基酸残基105至111、氨基酸残基105至112、氨基酸残基105至113、氨基酸残基105至114、氨基酸残基105至115、氨基酸残基105至116、氨基酸残基105至117、氨基酸残基105至118、氨基酸残基105至119、氨基酸残基105至120、氨基酸残基105至121、氨基酸残基105至122、氨基酸残基105至123、氨基酸残基105至124、氨基酸残基105至125、氨基酸残基105至126、氨基酸残基105至127、氨基酸残基105至128、氨基酸残基105至129、氨基酸残基105至130、氨基酸残基105至131、氨基酸残基105至132、氨基酸残基105至133、氨基酸残基105至134、氨基酸残基105至135、氨基酸残基105至136、氨基酸残基105至137、氨基酸残基105至138、氨基酸残基105至139、氨基酸残基105至140、氨基酸残基105至141、氨基酸残基105至142、氨基酸残基105至143、氨基酸残基105至144、氨基酸残基105至145、氨基酸残基105至146、氨基酸残基105至147、氨基酸残基105至148、氨基酸残基105至149、氨基酸残基105至150、氨基酸残基105至151、氨基酸残基105至152、氨基酸残基105至153以及氨基酸残基105至154。
[0176]
在一些实施方案中,参考(例如未修饰的)taci序列缺少一个或多个潜在弗林蛋白酶切割位点或在其中发生突变。在一些情形中,参考(例如未修饰的)taci序列是ecd或部分,其中在位置119处的精氨酸残基发生突变,例如r119g。在一些情形中,参考(例如未修饰的)taci序列是ecd或部分,其中在位置121处的谷氨酰胺残基发生突变,例如q121p。在一些情形中,参考(例如未修饰的)taci序列是ecd或部分,其中在位置122处的精氨酸残基发生突变,例如r122q。
[0177]
在一些实施方案中,参考taci序列是如国际pct公开号wo 2000/067034、wo 2002/094852或wo 2008/154814中所示的taci ecd序列。
[0178]
在一些实施方案中,参考taci序列是taci ecd序列,其具有seq id no:131中所示的序列或由其组成。taci ecd(crd1/crd2):seq id no:131srvdqeer fpqglwtgva mrscpeeqyw dpllgtcmsckticnhqsqrtcaafcrsls crkeqgkfyd hllrdcisca sicgqhpkqcayfcenklrspvnlppel
[0179]
在一些实施方案中,参考taci序列是taci ecd序列,其具有seq id no:130中所示的序列或由其组成。taci ecd(crd1/crd2):seq id no:130amrscpeeqywdpllgtcmsckticnhqsqrtcaafcrslscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrs
[0180]
在一些实施方案中,参考taci序列是taci ecd序列,其具有seq id no:1中所示的序列(由seq id no:36中所示的核苷酸序列编码)或由其组成。
taci ecd(crd1/crd2):seq id no:1vamrscpeeqywdpllgtcmsckticnhqsqrtcaafcrslscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrs
[0181]
在一些实施方案中,参考taci序列是taci的细胞外结构域区域,其基本上由仅crd2序列组成并且缺失或缺少整个crd1序列以及基本上全部茎区。尽管先前研究已经显示,茎区中的残基可能含有蛋白水解酶切割位点,但是据信taci的足够的表达和/或对其同源配体的结合活性需要至少crd1和crd2。例如,国际pct公开号wo 2002/094852证实,含有crd1和crd2,但是其中整个氨基末端区域和部分茎区序列缺失的taci分子在表达时展现降低的蛋白质降解。其他研究显示,在crd1之前的n末端区域的至少一部分是taci对其同源配体的足够结合活性所需的,参见例如国际公开号wo 2008/154814,其中确定taci细胞外区域的残基13-118或13-108是生物活性所需的同时将taci在表达期间的降解降至最低。令人惊讶地,本文(例如实施例3)中发现,与含有crd1和crd2二者的更长的taci分子相比,基本上仅由具有小部分茎区的crd2组成的taci细胞外区域展现显著改进的同源结合活性。
[0182]
本文提供一种免疫调节蛋白(例如taci-fc融合蛋白),所述免疫调节蛋白含有taci多肽,所述taci多肽是taci细胞外结构域(ecd)区域的含有crd2的部分,且缺失n末端区域和crd1并且确实taci细胞外结构域的茎部分的一个或多个残基,例如相对于seq id no:122中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,taci细胞外结构域的含有crd2的部分包括氨基酸残基71-104,所述残基对应于seq id no:122中所示的残基。在所提供的实施方案中,免疫调节蛋白的taci多肽含有对应于seq id no:122中所示的残基的n末端氨基酸残基1-66的缺失。在所提供的实施方案中,免疫调节蛋白的taci多肽含有对应于seq id no:122中所示的残基的n末端氨基酸残基1-67的缺失。在所提供的实施方案中,免疫调节蛋白的taci多肽含有对应于seq id no:122中所示的残基的n末端氨基酸残基1-68的缺失。在所提供的实施方案中,免疫调节蛋白的taci多肽含有对应于seq id no:122中所示的残基的n末端氨基酸残基1-69的缺失。在所提供的实施方案中,免疫调节蛋白的taci多肽含有对应于seq id no:122中所示的残基的n末端氨基酸残基1-70的缺失。在一些任何这样的实施方案中,免疫调节蛋白的taci多肽缺少一个或多个连续c末端氨基酸残基,所述连续c末端氨基酸残基在残基105处开始并且直至或包括氨基酸残基166,所述残基对应于seq id no:122中所示的ecd序列的残基。在一些实施方案中,ecd序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62缺失。
[0183]
在一些实施方案中,本文提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc融合蛋白)具有taci多肽,所述taci多肽具有含有ecd部分的序列,所述ecd部分具有taci ecd的包括crd2的连续氨基酸序列(例如关于seq id no:122的残基71-104),但是缺失n末端区域和crd1并且确实taci细胞外结构域的茎部分的一个或多个残基,例如相对于seq id no:122中所示的氨基酸序列。例如,taci ecd部分可以关于seq id no:122中所示的氨基酸残基由以下组成:氨基酸残基67至118、氨基酸残基67至117、氨基酸残基67至116、氨基酸残基67至115、氨基酸残基67至114、氨基酸残基67至113、氨基酸残基67至112、氨基酸残基67至111、氨基酸残基67至110、氨基酸残基67至109、氨基酸残基67至108、氨基酸残基67至107、氨基酸残基67
至106、氨基酸残基67至105或者氨基酸残基67至104。在一些例子中,taci ecd部分可以关于seq id no:122中所示的残基由以下组成:氨基酸残基68至118、氨基酸残基68至117、氨基酸残基68至116、氨基酸残基68至115、氨基酸残基68至114、氨基酸残基68至113、氨基酸残基68至112、氨基酸残基68至111、氨基酸残基68至110、氨基酸残基68至109、氨基酸残基68至108、氨基酸残基68至107、氨基酸残基68至106、氨基酸残基68至105或者氨基酸残基68至104。在一些例子中,taci ecd部分可以关于seq id no:122中所示的残基由以下组成:氨基酸残基69至118、氨基酸残基69至117、氨基酸残基69至116、氨基酸残基69至115、氨基酸残基69至114、氨基酸残基69至113、氨基酸残基69至112、氨基酸残基69至111、氨基酸残基69至110、氨基酸残基69至109、氨基酸残基69至108、氨基酸残基69至107、氨基酸残基69至106、氨基酸残基69至105或者氨基酸残基69至104。在一些例子中,taci ecd部分可以关于seq id no:122中所示的残基由以下组成:氨基酸残基70至118、氨基酸残基70至117、氨基酸残基70至116、氨基酸残基70至115、氨基酸残基70至114、氨基酸残基70至113、氨基酸残基70至112、氨基酸残基70至111、氨基酸残基70至110、氨基酸残基70至109、氨基酸残基70至108、氨基酸残基70至107、氨基酸残基70至106、氨基酸残基70至105或者氨基酸残基70至104。在一些例子中,taci ecd部分可以关于seq id no:122中所示的残基由以下组成:氨基酸残基71至118、氨基酸残基71至117、氨基酸残基71至116、氨基酸残基71至115、氨基酸残基71至114、氨基酸残基71至113、氨基酸残基71至112、氨基酸残基71至111、氨基酸残基71至110、氨基酸残基71至109、氨基酸残基71至108、氨基酸残基71至107、氨基酸残基71至106、氨基酸残基71至105或者氨基酸残基71至104。任何上文taci ecd序列还可以是根据本文提供的免疫调节蛋白的taci参考序列,其中这样的免疫调节蛋白含有与这样的taci参考序列相比,通过如本文所述的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)来修饰的变体taci多肽。
[0184]
特定地,本文提供的taci多肽包括taci ecd序列,所述taci ecd序列具有seq id no:13中所示的序列(由seq id no:48中所示的核苷酸序列编码)或由其组成。在一些实施方案中,参考taci序列具有seq id no:13中所示的序列或由其组成,其中与这样的参考taci序列相比,所提供的变体taci多肽通过如本文所述的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)来修饰。taci ecd序列(crd2):seq id no:13slscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrs
[0185]
所提供的taci多肽包括变体taci多肽。还提供免疫调节蛋白,如taci-fc融合蛋白,其含有所提供的变体taci多肽。在一些任何所提供的实施方案中,变体taci序列具有参考(例如未修饰的)taci序列(如上文所述的任一种)的序列,但是另外含有一个或多个氨基酸修饰,如一个或多个氨基酸取代。特定地,本文提供变体taci多肽,其含有至少一个亲和力修饰的td结构域(例如,crd1和/或crd2)或其特异性结合片段,所述结构域或其特异性结合片段含有参考(例如,未修饰的或野生型)taci多肽的td结构域中的一个或多个氨基酸取代,使得与参考(例如,未修饰的或野生型)taci多肽相比,所述变体taci多肽展现改变的(例如增加的)对april或baff中的一种或两种的结合活性或亲和力。在一些实施方案中,变体taci多肽对april和/或baff的结合亲和力与参考(例如,未修饰的或野生型)taci多肽对照序列不同,如通过例如固相elisa免疫测定、流式细胞术或biacore测定所确定。对每种同源结合配偶体的结合亲和力是独立的;也就是说,在一些实施方案中,相对于参考(例如,未
修饰的或野生型)taci多肽,变体taci多肽具有增加的对april和baff中的一种或两种的结合亲和力,以及降低的或不变的对april或baff中另一种的结合亲和力。
[0186]
在一些实施方案中,相对于参考(未修饰的或野生型)taci多肽,变体taci多肽具有增加的对baff的结合亲和力。在一些实施方案中,相对于参考(未修饰的或野生型)taci多肽,变体taci多肽具有增加的对april的结合亲和力。在一些实施方案中,相对于参考(未修饰的或野生型)taci多肽,变体taci多肽具有增加的对april和baff的结合亲和力。同源配体baff和/或april可以是哺乳动物蛋白,如人蛋白或鼠蛋白。在一些实施方案中,同源配体baff和/或april是人的。在一些实施方案中,相对于参考(例如,未修饰的或野生型)taci多肽对照,具有增加的或更大的对april和/或baff的结合亲和力的变体taci多肽将具有至少约5%(如至少约10%、15%、20%、25%、35%或50%)的结合亲和力的增加。在一些实施方案中,相对于参考(例如,未修饰的野生型)taci多肽,结合亲和力的增加超过约1.2倍、约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍或约50倍。在任何例子中,参考(例如,未修饰的或野生型)taci多肽具有与变体taci多肽相同的序列,但是它不含一个或多个氨基酸修饰(例如,取代)。
[0187]
在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与baff的平衡解离常数(kd)可以是小于1x10-5
m、1x10-6
m、1x10-7
m、1x10-8
m、1x10-9
m、1x10-10
m或1x10-11
m或1x10-12
m。在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与baff的kd小于或小于约1x10-9
m、1x10-10
m或1x10-11
m或1x10-12
m。在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与baff的kd在1x10-9
m与为或约1x10-12
m之间。在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与baff的kd是为或约1x10-9
m、为或约2x10-9
m、为或约4x10-9
m、为或约6x10-9
m、为或约8x10-9
m、为或约1x10-10
m、为或约2x10-10
m、为或约4x10-10
m、为或约6x10-10
m、为或约8x10-10
m、为或约1x10-11
m、为或约2x10-11
m、为或约4x10-11
m、为或约6x10-11
m、为或约8x10-11
m或者为或约1x10-12
m,或前述任一项之间的任何值。在一些实施方案中,所提供的实施方案包括如上所述的变体taci多肽,并且与baff的kd减小(更高结合亲和力)大于或大于约1.5倍,如大于或约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
[0188]
在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与april的平衡解离常数(kd)可以是小于1x10-5
m、1x10-6
m、1x10-7
m、1x10-8
m、1x10-9
m、1x10-10
m或1x10-11
m或1x10-12
m。在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与april的kd小于或小于约1x10-9
m、1x10-10
m或1x10-11
m或1x10-12
m。在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与april的kd在1x10-9
m与为或约1x10-12
m之间。在一些实施方案中,前述实施方案中任一项与april的kd是为或约1x10-9
m、为或约2x10-9
m、为或约4x10-9
m、为或约6x10-9
m、为或约8x10-9
m、为或约1x10-10
m、为或约2x10-10
m、为或约4x10-10
m、为或约6x10-10
m、为或约8x10-10
m、为或约1x10-11
m、为或约2x10-11
m、为或约4x10-11
m、为或约6x10-11
m、为或约8x10-11
m或者为或约1x10-12
m,或前述任一项之间的任何值。在一些实施方案中,所提供的实施方案包括如上所述的变体taci多肽,并且与april的kd减小(更高结合亲和力)大于或大于约1.5倍,如大于或约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
[0189]
参考(例如,未修饰的或野生型)taci序列不一定必须用作起始组合物以生成本文所述的变体taci多肽。因此,术语“修饰”(如“取代”)的使用并不意味着本发明实施方案限于制备变体taci多肽或含有变体taci多肽的免疫调节蛋白的特定方法。变体taci多肽可例
如通过从头肽合成来制备,因此在改变密码子以编码修饰(例如取代)的意义上,不一定需要修饰,例如“取代”。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”,其同样不暗示特定制备方法。设计或产生变体taci多肽的方法不限于任何特定方法。在一些实施方案中,然而,参考(例如,未修饰的或野生型)taci编码核酸是从参考(例如,未修饰的或野生型)taci遗传物质诱变的,并且针对所需特异性结合亲和力或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中,使用可在任何数量的公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体taci多肽,然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供这种信息,并且其网站可通过互联网公开访问,如前所述的uniprotkb数据库也是如此。
[0190]
除非另外陈述,否则如本公开文本通篇所指示,变体taci多肽中的一个或多个氨基酸修饰是按照对应于seq id no:122中所示的参考ecd序列的位置编号的氨基酸位置编号来命名。技术人员可以熟练地鉴定修饰(例如氨基酸取代)在taci多肽(包括其含有td(例如crd1和/或crd2)的部分)中的相应位置,如通过比对参考序列(例如seq id no:1或13)与seq id no:122。鉴定对应残基的比对例示于图9中。在本公开文本通篇的修饰列表中,氨基酸位置在中间指示,相应的参考(例如未修饰的野生型)的氨基酸列示于编号之前,并且所鉴定的变体氨基酸取代列示于编号之后。如果修饰是位置的缺失,那么指示“del”,并且如果修饰是位置的插入,那么指示“ins”。在一些情况下,插入与在中间指示的氨基酸位置一起列示,且相应的参考氨基酸列示于编号之前和之后,并且所鉴别的变体氨基酸插入列示于未修饰的(例如,野生型)氨基酸之后。
[0191]
在一些实施方案中,变体taci多肽具有参考(例如,未修饰的或野生型)taci序列中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代),例如如所述的任一个。一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可以位于参考(例如,未修饰的或野生型)taci序列的胞外域(细胞外结构域)中。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于crd1结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中,一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于crd2结构域或其特异性结合片段中。在变体taci多肽的一些实施方案中,一个或多个氨基酸修饰(例如取代)中的一些位于crd1结构域或其特异性结合片段中,并且一个或多个氨基酸修饰(例如取代)中的一些位于crd2结构域或其特异性结合片段中。
[0192]
在一些实施方案中,变体taci多肽具有参考taci序列中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。所述修饰(例如取代)可以位于crd1结构域或crd2结构域中。在一些实施方案中,变体taci多肽具有参考taci序列的crd1结构域或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中,变体taci多肽具有参考taci序列的crd2结构域或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
[0193]
在一些实施方案中,如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体taci多肽具有与seq id no:122中所示的参考(例如,未修饰的或野生型)taci多肽或其含有crd1和/或crd2结构域的特异性结合片段的至少约85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在一些实施方案中,所述特异性结合片段含有crd1结构域,例如所述特异性结合片段含有示为seq id no:122的氨基酸34-66的序列。在一些情形中,crd1结构域是所述特异性结合片段中的唯一完整crd结
构域。在一些实施方案中,所述特异性结合片段是或含有crd2结构域,例如所述特异性结合片段含有示为seq id no:122的氨基酸71-104的序列。在一些情形中,crd2结构域是所述特异性结合片段中的唯一完整crd结构域。在一些实施方案中,所述特异性结合片段是或含有crd1结构域和crd2结构域,例如所述特异性结合片段含有seq id no:122的氨基酸34-104。在一些实施方案中,所述特异性结合片段含有茎结构域的连续部分,例如所述特异性结合片段含有seq id no:122的氨基酸105-165的连续部分。在一些任何实施方案中,seq id no:122的特异性结合片段小于seq id no:122中所示的全长ecd。在一些实施方案中,所述特异性结合片段示于seq id no:1中。在一些实施方案中,所述特异性结合片段示于seq id no:13中。在一些实施方案中,所述特异性结合片段示于seq id no:130中。在一些实施方案中,所述特异性结合片段示于seq id no:131中。
[0194]
在一些实施方案中,含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体taci多肽具有与参考(例如,未修饰的或野生型)taci多肽或其特异性结合片段(如与seq id no:1、13或122的氨基酸序列)的至少约85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0195]
在一些实施方案中,含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体taci多肽具有与seq id no:122的氨基酸序列的至少约85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0196]
在一些实施方案中,含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体taci多肽具有与seq id no:1的氨基酸序列的至少约85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0197]
在一些实施方案中,含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体taci多肽具有与seq id no:13的氨基酸序列的至少约85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0198]
在一些实施方案中,含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体taci多肽具有与seq id no:130的氨基酸序列的至少约85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0199]
在一些实施方案中,含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体taci多肽具有与seq id no:131的氨基酸序列的至少约85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
[0200]
在一些实施方案中,变体taci多肽具有参考taci多肽或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代),所述氨基酸修饰关于seq id no:122的编号对应于一个或多个位置40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103。在一些实施方案中,变体taci多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代):w40r、q59r、r60g、t61p、e74v、q75e、q75r、g76s、k77e、f78y、y79f、l82h、l82p、l83s、r84g、r84l、r84q、d85e、d85v、c86y、i87l、i87m、s88n、i92v、q95r、p97s、k98t、q99e、a101d、y102d、f103s、f103v、f103y或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中,参考taci多肽包括crd1结构域或crd2结构域,例如参考taci多肽示于seq id no:1或seq id no:122中。
[0201]
在一些实施方案中,氨基酸取代仅位于crd2结构域中。在一些实施方案中,变体taci多肽具有参考taci多肽或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代),
所述氨基酸修饰关于seq id no:122的编号对应于一个或多个位置74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103。在一些实施方案中,变体taci多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代):e74v、q75e、q75r、g76s、k77e、f78y、y79f、l82h、l82p、l83s、r84g、r84l、r84q、d85e、d85v、c86y、i87l、i87m、s88n、i92v、q95r、p97s、k98t、q99e、a101d、y102d、f103s、f103v、f103y或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中,在crd结构域中,参考taci多肽仅包括crd2结构域但缺少crd1结构域,例如参考taci多肽示于seq id no:13中。因此,在一些实施方案中,变体taci多肽包括taci多肽的ecd序列的包括crd2结构域但缺少crd1结构域的部分。
[0202]
保守氨基酸修饰(例如取代)是落入与取代的氨基酸具有相同的氨基酸类别中的除参考(例如,未修饰的)或野生型氨基酸之外的任何氨基酸。氨基酸的类别是脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)、环状(脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
[0203]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括关于seq id no:122的编号在位置75处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,在位置75处的氨基酸取代赋予增加的与baff或april的结合。在一些实施方案中,与参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺,如取代为不同的酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中,在位置75处的取代的氨基酸是谷氨酸(glu,e)。在一些实施方案中,在位置75处的取代的氨基酸是天冬氨酸(asp,d)。在一些实施方案中,在位置75处的取代的氨基酸是天冬酰胺(asn,n)。在一些实施方案中,在位置75处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(gln,q)。
[0204]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括关于seq id no:122的编号在位置77处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,在位置77处的氨基酸取代赋予增加的与baff或april的结合。在一些实施方案中,在位置77处的取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中,在位置77处的取代的氨基酸是谷氨酸(glu,e)。在一些实施方案中,在位置77处的取代的氨基酸是天冬氨酸(asp,d)。在一些实施方案中,在位置77处的取代的氨基酸是天冬酰胺(asn,n)。在一些实施方案中,在位置77处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(gln,q)。
[0205]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括关于seq id no:122的编号在位置78处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,在位置78处的氨基酸取代赋予增加的与baff或april的结合。在一些实施方案中,与参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,在位置78处的取代的氨基酸是芳香族氨基酸,如取代为不同的芳香族氨基酸。在一些实施方案中,在位置78处的取代的氨基酸是苯丙氨酸(phe,f)。在一些实施方案中,在位置78处的取代的氨基酸是酪氨酸(tyr,y)。在一些实施方案中,在位置78处的取代的氨基酸是色氨酸(trp,w)。
[0206]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括关于seq id no:122的编号在位置84处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,在位置84处的氨基酸取代赋予增加的与baff或april的结合。在一些实施方案中,在位置84处的取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中,在位
置84处的取代的氨基酸是谷氨酸(glu,e)。在一些实施方案中,在位置84处的取代的氨基酸是天冬氨酸(asp,d)。在一些实施方案中,在位置84处的取代的氨基酸是天冬酰胺(asn,n)。在一些实施方案中,在位置84处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(gln,q)。
[0207]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括关于seq id no:122的编号在位置101处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,在位置101处的氨基酸取代赋予增加的与baff或april的结合。在一些实施方案中,在位置101处的取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中,在位置101处的取代的氨基酸是谷氨酸(glu,e)。在一些实施方案中,在位置101处的取代的氨基酸是天冬氨酸(asp,d)。在一些实施方案中,在位置101处的取代的氨基酸是天冬酰胺(asn,n)。在一些实施方案中,在位置101处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(gln,q)。
[0208]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括关于seq id no:122的编号在位置102处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)taci多肽相比,在位置102处的氨基酸取代赋予增加的与baff或april的结合。在一些实施方案中,在位置102处的取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中,在位置102处的取代的氨基酸是谷氨酸(glu,e)。在一些实施方案中,在位置102处的取代的氨基酸是天冬氨酸(asp,d)。在一些实施方案中,在位置102处的取代的氨基酸是天冬酰胺(asn,n)。在一些实施方案中,在位置102处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(gln,q)。
[0209]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代e74v。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代q75e。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代k77e。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代f78y。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代y79f。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代l82h。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代l82p。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代r84g。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代r84l。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代r84q。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代d85v。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代c86y。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代a101d。在一些实施方案中,变体taci多肽包括至少一个氨基酸取代y102d。在一些实施方案中,变体taci多肽含有前述任两个或更多个中的两个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中,变体taci多肽包括一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代是前述任一个的保守氨基酸取代。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,所述至少一个氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述至少一个氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述至少一个氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述至少一个氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0210]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代e74v。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代q75e。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代k77e。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代f78y。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代y79f。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代l82h。在一些实施方
案中,变体taci多肽包括氨基酸取代l82p。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代r84g。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代r84l。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代r84q。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代d85v。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代c86y。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代a102d。在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代y102d。在一些实施方案中,变体taci多肽含有前述任两个或更多个中的两个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中,变体taci多肽包括一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代是前述任一个的保守氨基酸取代。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0211]
在一些实施方案中,所述氨基酸取代是d85e/k98t。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是i87l/k98t。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是r60g/q75e/l82p。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是r60g/c86y。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是w40r/l82p/f103y。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是w40r/q59r/t61p/k98t。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是l82p/i87l。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是g76s/p97s。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是k77e/r84l/f103y。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是y79f/q99e。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是l83s/f103s。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是k77e/r84q。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是k77e/a101d。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是k77e/f78y/y102d。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是q75e/r84q。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是q75r/r84g/i92v。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是k77e/a101d/y102d。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是r84q/s88n/a101d。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是r84q/f103v。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是k77e/q95r/a101d。在一些实施方案中,所述氨基酸取代是i87m/a101d。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0212]
在一些任何实施方案中,变体taci多肽包括来自q75e、k77e、f78y、r84g、r84q、a101d或y102d或其任何组合的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中,变体taci多肽包括上文氨基酸取代中的任何1、2、3、4、5或6个。在一些实施方案中,变体taci多肽含有上文氨基酸取代中的一个。在一些实施方案中,变体taci多肽含有上文氨基酸取代中的两个。在一些实施方案中,变体taci多肽含有上文氨基酸取代中的三个。在一些实施方案中,变体taci多肽含有上文氨基酸取代中的四个。在一些实施方案中,变体taci多肽含有上文氨基酸取代中的五个。在一些实施方案中,变体taci多肽含有上文氨基酸取代中的六个。
[0213]
在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/r84q。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/k77e。在一些任何实施方案中,所述一
个或多个氨基酸取代包括q75e/f78y。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括q75e/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f77e/f78y。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括k77e/r84q。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括k77e/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括k77e/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f78y/r84q。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f78y/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括f78y/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括r84q/a101d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括r84q/y102d。在一些任何实施方案中,所述一个或多个氨基酸取代包括a101d/y102d。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列(如seq id no:1、seq id no:13、seq id no:130或seq id no:131中所示的序列)中的氨基酸取代。
[0214]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括一个或多个氨基酸取代r84g、a101d、k77e/r84q、k77e/a101d、k77e/f78y、k77e/f78y/y102d、q75e/r84q、k77e/a101d/y102d、r84q、k77e、a101d、q75e、k77e/f78y/r84q、f78y、f78y/r84q、f78y/a101d、f78y/y102d或k77e/y102d。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列(如seq id no:1、seq id no:13、seq id no:130或seq id no:131中所示的序列)中的氨基酸取代。
[0215]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代k77e和f78y(k77e/f78y)。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0216]
在一些实施方案中,变体taci多肽包括氨基酸取代k77e和y102d(k77e/y102d)。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0217]
在一些实施方案中,变体taci多肽含有氨基酸取代f78y和y102d(f78y/y012d)。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0218]
在一些实施方案中,变体taci多肽含有氨基酸取代k77e、f78y和y102d(k77e/f78y/y102d)。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。
在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0219]
在一些实施方案中,变体taci多肽含有氨基酸取代q75e/r84q。在所提供的实施方案中,变体taci多肽包括如所述的任何参考taci多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:1中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:13中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:130中所示的参考taci序列中。在一些实施方案中,所述氨基酸取代位于seq id no:131中所示的参考taci序列中。
[0220]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含表1中列出的任何突变。表1还提供参照参考(例如,未修饰的)taci多肽以及示例性变体taci多肽的seq id no的示例性序列。如所指出的,对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化,如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样,在一些情形中,给定结构域(例如crd)的相邻n和/或c末端氨基酸也可以包括于变体taci多肽的序列中,例如以确保所述结构域在表达时的适当折叠。因此,应当理解,表1中seq id no的示例不应解释为限制。例如,变体taci多肽的特定结构域(如ecd结构域或其含有crd1/crd2或仅含crd2的部分)可以比相应seq id no中所示的氨基酸序列长或短几个氨基酸,如长或短1-10个(例如,1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸。
[0221]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含表1中列出的任何突变(氨基酸取代)。在一些例子中,所述突变(氨基酸取代)是在含有seq id no:122中所示的氨基酸序列的参考taci中进行。在一些例子中,所述突变(氨基酸取代)是在含有taci的crd1和crd2结构域的参考taci(例如如seq id no:1中所示)中进行。在一些例子中,所述突变(氨基酸取代)是在通过缺失n末端和c末端氨基酸残基以保留crd2来进一步截短的参考taci(例如如seq id no:13中所示)中进行。
[0222]
术语“修饰”(如“取代”或“突变”)的使用并不意味着本发明实施方案限于制备免疫调节蛋白的特定方法。变体taci多肽可以例如通过从头肽合成来制备,并且因此在改变密码子以编码修饰(例如取代)的意义上,不一定需要所述修饰(如“取代”)。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”,其同样不暗示特定制备方法。用以设计或产生vtd的手段并不限于任何特定方法。然而,在一些实施方案中,野生型或未修饰的td编码核酸是从野生型或未修饰的td遗传物质诱变的,并且针对所需特异性结合活性(例如结合亲和力)和/或nf-κb调节或其他功能活性的改变进行筛选。在一些实施方案中,vtd是利用可在任何数量的公共可获得的数据库获得的蛋白质或核酸序列从头合成的,然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息,并且其网站可经由互联网公开访问,uniprotkb数据库也是如此。
[0223]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含含有crd1和crd2的细胞外结构域(ecd)序列,如seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的变体taci多肽。在一些实施方案中,变体taci多肽包含如下多肽序列,其展现与seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项的至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性,如至少约96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性,并且在其中保留参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中,变体taci多肽包含seq id no:2-12、21、
22、101-120中任一项的特异性结合片段,其中所述特异性结合片段结合baff、april或baff/april异三聚体并且在其中含有如下连续序列,所述连续序列在其中含有参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
[0224]
在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的变体taci细胞外结构域(ecd)序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中,变体taci多肽由如下多肽序列组成或基本上由其组成,所述多肽序列展现与seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项的至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性,如至少约96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性,并且在其中保留参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项的特异性结合片段组成或基本上由其组成,其中所述特异性结合片段结合baff、april或april/baff异三聚体并且在其中含有如下连续序列,所述连续序列在其中含有参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
[0225]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含参考taci多肽的含有crd2但缺少crd1的细胞外结构域(ecd)序列,如seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项中所示的变体taci多肽。在一些实施方案中,变体taci多肽包含如下多肽序列,所述多肽序列展现与seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项的至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性,如至少约96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性,并且在其中保留参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中,变体taci多肽包含seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项的特异性结合片段,其中所述特异性结合片段结合baff、april或baff/april异三聚体并且在其中含有如下连续序列,所述连续序列在其中含有参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
[0226]
在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中,变体taci多肽由如下多肽序列组成或基本上由其组成,所述多肽序列展现与seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项的至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性,如至少约96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性,并且在其中保留参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项的特异性结合片段组成或基本上由其组成,其中所述特异性结合片段结合baff、april或baff/april异三聚体并且在其中含有如下连续序列,所述连续序列在其中含有参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
[0227]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含seq id no:20中所示的序列。在一些实施方案中,变体taci多肽基本上由seq id no:20中所示的序列组成。在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:20中所示的序列组成。
[0228]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含seq id no:26中所示的序列。在一些实施方案中,变体taci多肽基本上由seq id no:26中所示的序列组成。在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:26中所示的序列组成。
[0229]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含seq id no:27中所示的序列。在一些实施方案中,变体taci多肽基本上由seq id no:27中所示的序列组成。在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:27中所示的序列组成。
[0230]
在一些实施方案中,变体taci多肽包含seq id no:107中所示的序列。在一些实施方案中,变体taci多肽基本上由seq id no:107中所示的序列组成。在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:107中所示的序列组成。
[0231]
在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:37-47、56或57中任一项中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中,变体taci多肽由如下核苷酸序列编码,所述核苷酸序列展现与seq id no:37-47、56或57中任一项的至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性,如至少约96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性,并且在其中保留参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。本文还提供一种核酸,其含有seq id no:37-47、56或57中任一项中所示的序列或者展现与seq id no:37-47、56或57中任一项的至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性(如至少96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性)的序列。
[0232]
在一些实施方案中,变体taci多肽由seq id no:49-55或58-70中任一项中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中,变体taci多肽由如下核苷酸序列编码,所述核苷酸序列展现与seq id no:49-55或58-70中任一项的至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性,如至少约96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性,并且在其中保留参考(例如,未修饰的或野生型)taci中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。本文还提供一种核酸,其含有seq id no:49-55或58-70中任一项中所示的序列或者展现与seq id no:549-55或58-70中任一项的至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性(如至少96%同一性、97%同一性、98%同一性或99%同一性)的序列。
[0233]
在一些实施方案中,本文还提供taci ecd融合序列,其中上文taci ecd序列中的任一个与多聚化结构域(如本文所述的任一个)连接或融合。
[0234]
免疫调节蛋白的两种或更多种多肽的相互作用可以通过其与任何部分或其他多肽的直接或间接连接来促进,所述部分或其他多肽本身能够相互作用以形成稳定结构。例
如,单独编码的多肽链可以通过多聚化来接合,借此通过多聚化结构域介导多肽的多聚化。通常,多聚化结构域提供第一多肽与第二多肽之间的稳定蛋白质间相互作用的形成。
[0235]
在一些实施方案中,免疫调节蛋白的两种或更多种单独多肽可以通过多聚化来接合,如接合为二聚、三聚、四聚或五聚分子。在一些情形中,所述单独多肽是相同的。例如,三聚分子可以从三个拷贝的相同单独多肽形成。在其他例子中,四聚分子是从四个拷贝的相同单独多肽生成。在其他例子中,五聚分子是从五个拷贝的相同单独多肽生成。所述多聚化结构域可以是促进多肽链的二聚化、三聚化、四聚化或五聚化的结构域。
[0236]
在一些实施方案中,免疫调节蛋白形成多聚体,例如,二聚体。在一些实施方案中,二聚体是同二聚体,其中免疫调节蛋白的两个多肽是相同的。在一些实施方案中,二聚体是异二聚体,其中免疫调节蛋白的两个多肽是不同的。
[0237]
在一些实施方案中,多聚化结构域包括能够形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的任何结构域。多聚化结构域可以通过以下来相互作用:免疫球蛋白序列(例如fc结构域;参见例如,国际专利公开号wo 93/10151和wo 2005/063816 us;美国公开号2006/0024298;美国专利号5,457,035);亮氨酸拉链(例如,来自核转化蛋白fos和jun,或原癌基因c-myc,或来自一般氮控制(general control of nitrogen,gcn4))(参见例如,busch和sassone-corsi(1990)trends genetics,6:36-40;gentz等人,(1989)science,243:1695-1699);疏水区;亲水区;或者在同多聚体或异多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键的游离硫醇。另外,多聚化结构域可以包括与包含孔的氨基酸序列互补的包含突起的氨基酸序列,如例如以下文献中所述:美国专利号5,731,168;国际专利公开号wo 98/50431和wo 2005/063816;ridgway等人(1996)protein engineering,9:617-621。这种多聚化区域可以被工程化使得空间相互作用不仅促进稳定相互作用,而且还促进从嵌合单体的混合物形成异二聚体超过同二聚体。通常,突起是通过用较大侧链(例如,酪氨酸或色氨酸)替代第一多肽的界面中的小氨基酸侧链来构建。任选地通过用较小侧链(例如,丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链在第二多肽的界面上产生突出部的相同或类似大小的补偿腔。示例性多聚化结构域描述于下文中。
[0238]
taci多肽序列(例如变体taci多肽序列)可以在任何位置(但通常经由其n末端或c末端)与多聚化结构域的n末端或c末端接合以形成嵌合多肽。连接可以是直接连接或经由接头的间接连接。同样,嵌合多肽可以是融合蛋白或者可以通过化学连接来形成,如通过共价或非共价相互作用来形成。例如,在制备含有多聚化结构域的嵌合多肽时,可以将编码taci多肽序列的全部或部分(如任何所述的taci ecd,包括变体taci多肽序列)的核酸与编码所述多聚化结构域序列的核酸直接或间接或任选地经由接头结构域可操作地连接。在一些情形中,构建体编码嵌合蛋白,其中taci多肽序列的c末端与多聚化结构域的n末端接合。在一些情况下,构建体可以编码嵌合蛋白,其中taci多肽序列的n末端与多聚化结构域的n末端或c末端接合。
[0239]
多肽多聚体含有两个嵌合蛋白,所述嵌合蛋白是通过将两个相同或不同的taci多肽序列(例如两个相同或不同的变体taci多肽序列)直接或间接连接至多聚化结构域而产生的。在一些例子中,在多聚化结构域是多肽的情况下,将编码taci多肽序列(例如变体taci多肽序列)和多聚化结构域的基因融合物插入适当的表达载体中。所得嵌合或融合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达,并且允许组装为多聚体,其中多聚化结
构域相互作用以形成多价多肽。多聚化结构域与taci多肽(例如变体taci多肽)的化学连接可以使用异双功能接头来实现。
[0240]
所得嵌合多肽(如融合蛋白)和由其形成的多聚体可以通过任何合适的方法来纯化,如例如通过亲和色谱在蛋白a或蛋白g柱上纯化。在将编码不同多肽的两种核酸分子转化至细胞中的情况下,将发生同二聚体和异二聚体的形成。可以调整表达条件,使得相对于同二聚体形成更偏好异二聚体形成。
[0241]
在一些实施方案中,多聚化结构域是免疫球蛋白的fc区。
[0242]
在一些实施方案中,多聚化结构域是免疫球蛋白(例如igg1)fc区,其中融合蛋白是含有以下的taci-fc:(1)含有任何所提供的taci ecd序列或由其组成的taci序列;以及(2)免疫球蛋白fc区。因此,所提供的实施方案包括含有以下的taci-fc融合蛋白:(1)含有上述taci ecd多肽序列中的任一个(如变体taci多肽)或由其组成的taci序列;以及(2)免疫球蛋白fc区。
[0243]
在一些实施方案中,本文提供一种taci-fc融合序列,其含有(1)包含seq id no:13中所示的序列的taci ecd序列,以及(2)免疫球蛋白fc区。在一些实施方案中,本文提供一种taci-fc融合序列,其含有(1)由seq id no:13中所示的序列组成或基本上由其组成的taci ecd序列,以及(2)免疫球蛋白fc区。
[0244]
在一些实施方案中,taci-fc融合物是变体taci-fc融合物,其含有上述变体taci多肽中的任一个和免疫球蛋白fc区或由其组成。
[0245]
在一些实施方案中,本文提供一种变体taci-fc融合序列,其含有(1)含有crd1和crd2的taci ecd序列,例如含有seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的序列的taci序列,以及(2)免疫球蛋白fc区。在一些实施方案中,本文提供一种变体taci-fc融合序列,其含有(1)含有crd1和crd2的taci ecd序列,例如由seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成的taci序列,以及(2)免疫球蛋白fc区。
[0246]
在一些实施方案中,本文提供一种变体taci-fc融合序列,其含有(1)含有crd2但缺少crd1结构域的taci ecd序列,例如含有seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项中所示的序列的taci序列,以及(2)免疫球蛋白fc区。在一些实施方案中,本文提供一种变体taci-fc融合序列,其含有(1)含有crd2结构域但缺少crd1结构域的taci ecd序列,例如由seq id no:14-20、23-35、92-100、177-192中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成的taci序列,以及(2)免疫球蛋白fc区。
[0247]
在taci-fc的所提供实施方案中,免疫球蛋白fc区可以是免疫球蛋白的野生型fc,如igg1 fc。在一些情形中,fc区可以是缺少效应子功能的变体fc(也称为“无效应子fc”)。所提供的taci-fc融合蛋白中的示例性fc区及其变体描述于下文中。
[0248]
在一些实施方案中,所述fc是鼠或人fc。在一些实施方案中,所述fc是哺乳动物或人igg1、lgg2、lgg3或lgg4 fc区。
[0249]
在一些实施方案中,所述fc区是或包含seq id no:71、73、75、81、82、83、134、135、136、137、138、139、140、173、174、175、176、193、218、219、220或221中任一项中所示的序列。在一些实施方案中,所述fc区是或源自igg1,如seq id no:71、73、75、81、82、83、134、135、136、137、139、140、173、174、175、176、193、218、220或221中任一项中所示。在一些实施方案中,所述fc区是或源自igg2,如seq id no:138或219中所示的任一种。在一些实施方案中,
所述fc区是或源自igg4,如seq id no:139、140或220中所示的任一种。在一些实施方案中,本文提供的fc融合蛋白中的fc区还可以包括展现与上文fc区中任一个的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的fc区。
[0250]
在一些实施方案中,所述fc源自igg1,如人igg1。在一些实施方案中,所述fc是seq id no:71中所示的igg1 fc,其具有含有按照eu编号在位置356和358处的残基glu(e)和met(m)的同种异型。在一些实施方案中,所述fc包含seq id no:71中所示的氨基酸序列或者展现与seq id no:71的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中,所述fc是如下igg1 fc,其含有人g1m1同种异型的氨基酸,如含有在位置356和358处的asp(d)和leu(l)的残基,例如如seq id no:81中所示。因此,在一些情形中,本文提供的fc可以含有氨基酸取代e356d和m358l以重构同种异型g1 m1的残基。在一些实施方案中,所述fc包含seq id no:81中所示的氨基酸序列或者展现与seq id no:81的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0251]
在一些实施方案中,所述fc区具有seq id no:81中所示的氨基酸序列。epkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:81)
[0252]
在一些实施方案中,变体fc包含seq id no:173中所示的序列。在一些实施方案中,变体fc包含seq id no:174中所示的序列。在一些实施方案中,在本文提供的构建体中使用的fc区可能进一步缺少c末端赖氨酸残基。
[0253]
在一些实施方案中,所述fc源自igg2,如人igg2。在一些实施方案中,所述fc包含seq id no:138中所示的氨基酸序列或者展现与seq id no:138的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述fc区是具有seq id no:138中所示的序列的igg2 fc区。在一些实施方案中,所述fc区是具有seq id no:219中所示的序列的igg2 fc区。
[0254]
在一些实施方案中,所述fc源自igg4,如人igg4。在一些实施方案中,所述fc包含seq id no:139中所示的氨基酸序列或者展现与seq id no:139的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,igg4 fc是稳定的fc,其中人igg4的ch3结构域被人igg1的ch3结构域取代,并且其展现被抑制的聚集体形成;抗体,其中人igg4的ch3和ch2结构域分别被人igg1的ch3和ch2结构域取代;或者抗体,其中在kabat等人提出的eu索引中指示的人igg4的位置409处的精氨酸被赖氨酸取代,并且其展现被抑制的聚集体形成(参见例如,美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中,所述fc是含有s228p突变的igg4,已显示其通过fab-臂交换防止治疗性抗体与内源igg4之间的重组(参见例如,labrijin等人(2009)nat.biotechnol.,27(8):767-71)。在一些实施方案中,所述fc包含seq id no:140中所示的氨基酸序列或者展现与seq id no:140的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列。在一
些实施方案中,所述fc区是seq id no:140中所示的igg4 fc区。在一些实施方案中,所述fc区是seq id no:220中所示的igg4fc区。
[0255]
在一些实施方案中,所述fc区是变体fc区,其中野生型fc被一个或多个氨基酸取代修饰,以降低效应子活性或使fc对fc效应子功能呈惰性。示例性无效应子或惰性突变包括本文所述的那些。
[0256]
在一些实施方案中,所述fc区含有一个或多个修饰,所述修饰改变(例如降低)其正常功能中的一种或多种。通常,除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力之外,fc区还负责效应子功能,如补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞毒性(adcc)。此外,fc区中存在的fcrn序列通过与体内fcrn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中igg水平的作用。在一些实施方案中,可以在fc中降低或改变此类功能以与提供的fc融合蛋白一起使用。
[0257]
在一些实施方案中,可以将一个或多个氨基酸修饰引入fc区中,从而生成fc区变体。在一些实施方案中,fc区域变体具有降低的效应子功能。有许多可改变效应子功能的fc序列的变化或突变的例子。例如,wo 00/42072、wo 2006019447、wo 2012125850、wo 2015/107026、us 2016/0017041和shields等人j biol.chem.9(2):6591-6604(2001)描述具有改进的或减小的与fcr的结合的示例性fc变体。那些出版物的内容通过引用明确并入本文。
[0258]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白包含展现降低的效应子功能的fc区,这使其成为某些应用的期望候选物,在所述应用中,免疫调节蛋白的体内半衰期是重要的,但是某些效应子功能(如cdc和adcc)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认cdc和/或adcc活性的降低/耗尽。例如,可以进行fc受体(fcr)结合测定以确保,免疫调节蛋白缺少fcγr结合(因此可能缺少adcc活性),但是保留fcrn结合能力。介导adcc的原代细胞nk细胞仅表达fcγriii,而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fc表达总结于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457-492(1991)第464页的表2中。用于评估目的分子的adcc活性的体外测定的非限制性例子描述于以下文献中:美国专利号5,500,362(参见例如,hellstrom,i.等人proc.nat'l acad.sci.usa 83:7059-7063(1986));以及hellstrom,i等人,proc.nat'l acad.sci.usa 82:1499-1502(1985);美国专利号5,821,337(参见bruggemann,m.等人,j.exp.med.166:1351-1361(1987))。可替代地,可以采用非放射性测定方法(参见例如,用于流式细胞术的acti
tm
非放射性细胞毒性测定(celltechnology,inc.山景城,加利福尼亚州);以及cytotox 96
tm
非放射性细胞毒性测定(promega,麦迪逊,威斯康星州))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可替代地,或另外地,可以在体内(例如,在动物模型中)评估目的分子的adcc活性,如在clynes等人proc.nat'l acad.sci.usa 95:652-656(1998)中所披露。还可以进行c1q结合测定以确认,免疫调节蛋白n不能结合c1q,并因此缺少cdc活性。参见例如wo 2006/029879和wo 2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活,可以进行cdc测定(参见例如,gazzano-santoro等人,j.immunol.methods 202:163(1996);cragg,m.s.等人,blood 101:1045-1052(2003);以及cragg,m.s.和m.j.glennie,blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行fcrn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如petkova,s.b.等人,int'l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。
[0259]
具有降低的效应子功能的免疫调节蛋白包括按照eu编号具有以下fc区残基中的
一个或多个的取代的那些:238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)。这样的fc突变体包括按照eu编号在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的fc突变体,包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“dana”fc突变体(美国专利号7,332,581)。
[0260]
在一些实施方案中,免疫调节蛋白的fc区具有如下fc区,其中与天然fc区相比,在位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325和329(通过eu编号指示)处的任何一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代。fc区中这样的改变包括例如诸如current opinion in biotechnology(2009)20(6),685-691中所述的去糖基化链(n297a和n297q)、igg1-n297g、igg1-l234a/l235a、igg1-l234a/l235e/g237a、igg1-a325a/a330s/p331s、igg1-c226s/c229s、igg1-c226s/c229s/e233p/l234v/l235a、igg1-e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、igg1-l234f/l235e/p331s、igg1-s267e/l328f、igg2-v234a/g237a、igg2-h268q/v309l/a330s/a331s、igg4-l235a/g237a/e318a和igg4-l236e的改变;诸如wo 2008/092117中所述的g236r/l328r、l235g/g236r、n325a/l328r和n325ll328r的改变;在位置233、234、235和237(根据eu编号指示)的氨基酸插入;以及在wo 2000/042072中所述位点的改变。
[0261]
描述了具有改进的或减小的与fcr的结合的某些fc变体。(参见例如,美国专利号6,737,056;wo 2004/056312、wo 2006019447和shields等人,j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001)。)
[0262]
在一些实施方案中,提供一种免疫调节蛋白,其包含含有一个或多个氨基酸取代的变体fc区,所述取代延长半衰期和/或改进与新生fc受体(fcrn)的结合。具有延长的半衰期和改进的与fcrn的结合的抗体描述于us2005/0014934a1(hinton等人)或wo 2015107026中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的fc区,所述取代改进fc区与fcrn的结合。这样的fc变体包括按照eu编号在以下fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434,例如,fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
[0263]
在一些实施方案中,免疫调节蛋白的fc区包含按照eu编号的一个或多个氨基酸取代c220s、c226s和/或c229s。在一些实施方案中,免疫调节蛋白的fc区包含一个或多个氨基酸取代r292c和v302c。关于fc区变体的其他例子,还参见以下文献:duncan和winter,nature 322:738-40(1988);美国专利号5,648,260;美国专利号5,624,821;以及wo 94/29351。
[0264]
在一些实施方案中,在fc区中进行改变,所述改变导致减小的c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc),例如,如以下文献中所述:美国专利号6,194,551、wo 99/51642;以及idusogie等人,j.immunol.164:4178-4184(2000)。
[0265]
在一些实施方案中,包含一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体fc区源自野生型igg1,如野生型人igg1。在一些实施方案中,野生型igg1 fc可以是seq id no:71中所示的fc,其具有含有按照eu编号在位置356和358处的残基glu(e)和met(m)的同种异型。在一些实施方案中,变体fc区源自seq id no:71中所示的氨基酸序列。在其他实施方案中,野生型igg1 fc含有人g1m1同种异型的氨基酸,如含有在位置356和358处的asp(d)和leu(l)的残基,例如如seq id no:81中所示。因此,在一些情形中,变体fc源自seq id no:81中所示的氨基酸序列。
[0266]
在一些实施方案中,fc区缺少对应于seq id no:71或81中所示的野生型或未修饰的fc的位置232的c末端赖氨酸(按照eu编号对应于k447del)。
[0267]
在一些实施方案中,按照seq id no:71的编号,变体fc区包含野生型或未修饰的fc区的c5s氨基酸修饰(按照eu编号对应于c220s)。
[0268]
在一些实施方案中,所述fc区是含有至少一个氨基酸取代变体fc,所述氨基酸取代按照seq id no:71的编号为n82g(按照eu编号对应于n297g)。在一些实施方案中,所述fc还含有依据seq id no:71的编号的至少一个氨基酸取代,即r77c或v87c(对应于依据eu编号的r292c或v302c)。在一些实施方案中,变体fc区还包含依据seq id no:71编号的c5s氨基酸修饰(对应于依据eu编号的c220s)。例如,在一些实施方案中,变体fc区包含以下氨基酸修饰:按照eu编号,n297g和以下氨基酸修饰c220s、r292c或v302c中的一个或多个(关于seq id no:71,对应于n82g和以下氨基酸修饰c5s、r77c或v87c中的一个或多个),例如,fc区包含seq id no:82中所示的序列。
[0269]
在一些实施方案中,按照eu编号,变体fc含有氨基酸取代l234a/l235e/g237a。在一些实施方案中,按照eu编号,变体fc含有氨基酸取代a330s/p331s。在一些实施方案中,变体fc含有氨基酸取代l234a/l235e/g237a/a330s/p331s(gross等人(2001)immunity 15:289)。在一些实施方案中,变体fc包含seq id no:175中所示的序列。在一些实施方案中,变体fc包含seq id no:176中所示的序列。在一些实施方案中,在本文提供的构建体中使用的fc区可能进一步缺少c末端赖氨酸残基。
[0270]
在一些实施方案中,fc区是变体fc,按照eu编号,其包括突变l234a、l235e和g237a。在一些实施方案中,通过去除一个或多个半胱氨酸残基,如通过按照eu编号在位置220处将半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(c220s),进一步修饰野生型fc。具有降低的效应子功能的示例性惰性fc区示于seq id no:83和seq id no:75中,它们分别基于seq id no:71或seq id no:81中所示的同种异型。在一些实施方案中,fc区可能进一步缺少c末端赖氨酸残基。在一些实施方案中,变体fc区包含氨基酸修饰c220s、l234a、l235e或g237a中的一个或多个,例如fc区包含seq id no:73、75、83或136中所示的序列。在一些实施方案中,变体fc包含具有seq id no:73中所示的序列。在一些实施方案中,变体fc包含具有seq id no:75中所示的序列。在一些实施方案中,变体fc包含具有seq id no:83中所示的序列。在一些实施方案中,变体fc包含具有seq id no:136中所示的序列。
[0271]
在一些实施方案中,所述fc区是变体fc,其具有seq id no:73中所示的序列。epkssdkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:73)
[0272]
在一些实施方案中,所述fc区是igg1 fc,但是不含铰链序列。在一些实施方案中,所述igg1 fc区不含铰链序列epksc(seq id no:239)。在一些实施方案中,所述igg1 fc区不含铰链序列epkss(seq id no:238)。
[0273]
在一些实施方案中,所述fc区是具有seq id no:221中所示的序列的变体fc。dkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvs
ltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:221)
[0274]
在一些实施方案中,所述fc区是变体fc区,其包含氨基酸修饰c220s、l235p、l234v、l235a、g236del或s267k中的一个或多个,例如fc区包含seq id no:134中所示的序列。在一些实施方案中,所述fc区缺少对应于seq id no:71中所示的野生型或未修饰的fc的位置232的c末端赖氨酸(按照eu编号对应于k447del)。
[0275]
在一些实施方案中,所述fc区是变体fc区,其包含氨基酸修饰c220s、r292c、n297g、v302c中的一个或多个。在一些实施方案中,所述fc区缺少对应于seq id no:71中所示的野生型或未修饰的fc的位置232的c末端赖氨酸(按照eu编号对应于k447del)。示例性变体fc区示于seq id no:135中。
[0276]
在一些实施方案中,变体fc区包含氨基酸修饰c220s/e233p/l234v/l235a/g236del/s267k中的一个或多个。在一些实施方案中,所述fc区缺少对应于seq id no:71中所示的野生型或未修饰的fc的位置232的c末端赖氨酸(按照eu编号对应于k447del)。示例性变体fc区示于seq id no:137中。
[0277]
用于包括于免疫调节多肽中的这样的fc区的例子示于表2中。2中。
[0278]
在一些实施方案中,所述fc区是变体fc区,其含有表2中的fc突变的任何组合。在一些实施方案中,所述fc区是变体fc区,其具有表2中任一项seq id no中所示的序列。
[0279]
例如,变体fc区可以是无效应子fc,其展现与seq id no:71或seq id no:81中所示的野生型igg1相比降低的效应子活性。在一些实施方案中,所述变体fc包含seq id no:75、82、83、134、73、135、136或137中任一项中所示的氨基酸序列或者展现与seq id no:75、82、83、134、73、135、136或137中任一项的至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述变体fc具有seq id no:73中所示的序列。在实施方案中,在从细胞产生和表达时,所提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc融合物)是含有两条相同多肽链的同二聚体。
[0280]
在一些实施方案中,免疫调节蛋白含有第一免疫调节fc融合多肽和第二免疫调节
fc融合多肽,其中所述第一多肽和所述第二多肽是不同的。在一些实施方案中,第一fc多肽融合物含有fc区和一个或多个变体taci多肽序列,并且第二多肽融合物含有fc区和一个或多个taci多肽序列。在这样的实施方案中,所述fc区可以是促进或有利于异二聚体形成的区域。
[0281]
在一些实施方案中,第一和第二免疫调节fc融合多肽中的一种或两种的fc结构域包含修饰(例如取代),使得fc分子的界面被修饰以有利于和/或促进异二聚化。促进fc链异二聚化的方法包括诱变fc区,如通过包含一组“杵臼结构”突变或包含突变以实现fc的静电操纵以有利于不同多肽链之间的吸引相互作用。在一些实施方案中,异二聚分子的fc区另外可以含有一个或多个其他fc突变,如上文所述的任一种。在一些实施方案中,所述异二聚体分子含有具有降低效应子功能的突变的fc区。在一些实施方案中,这样的fc区按照eu编号含有突变c220s、l234a、l235e和/或g237a。在一些实施方案中,fc骨架中的上文突变中的任一个可以在按照eu编号含有位置356和358处的残基glu(e)和met(m)的同种异型中进行。在其他实施方案中,fc骨架中的上文突变中的任一个可以在按照eu编号含有位置356和358处的残基asp(d)和leu(l)的同种异型中进行。
[0282]
在一些实施方案中,修饰包括将突起(杵)引入第一fc多肽中并将腔(臼)引入第二fc多肽中,使得突起可位于腔中以促进第一和第二含fc的多肽的复合。靶向用于替代和/或修饰以在多肽中产生突起或腔的氨基酸通常是与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。
[0283]
在一些实施方案中,被修饰以含有突起(杵)氨基酸的第一多肽包含用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸,所述至少一个侧链从第一多肽的界面突出,因此可位于第二多肽的相邻界面中的补偿腔(臼)中。最常见的是,替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何确定和/或评估氨基酸残基的特性以鉴定产生突起的理想替代氨基酸。在一些实施方案中,用于形成突出部的替代残基是天然存在的氨基酸残基,并且包括例如精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)或色氨酸(w)。在一些例子中,经鉴定用于替代的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基,例如像丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
[0284]
在一些实施方案中,被修饰以含有腔(臼)的第二多肽是包含用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸的多肽,所述至少一个侧链从第二多肽的界面凹进,因此能够从第一多肽的界面容纳相应的突出部。最常见的是,替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定对于形成腔而言理想的替代残基。通常,用于形成腔的替代残基是天然存在的氨基酸,并且包括例如丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和缬氨酸(v)。在一些例子中,经鉴定用于替代的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸,例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
[0285]
例如,人igg1的ch3界面涉及位于四条反向平行β链上的每个结构域上的十六个残基,其掩埋来自每个表面的1090 2(参见例如,deisenhofer等人(1981)biochemistry,20:2361-2370;miller等人,(1990)j mol.biol.,216,965-973;ridgway等人,(1996)prot.engin.,9:617-621;美国专利号5,731,168)。修饰ch3结构域以产生突起或腔描述于例如以下文献中:美国专利号5,731,168;国际专利申请wo 98/50431和wo 2005/063816;以及ridgway等人,(1996)prot.engin.,9:617-621。在一些例子中,修饰ch3结构域以产生突
起或腔通常靶向位于两条中心反向平行β链上的残基。目的是最小化以下风险,即产生的突起可通过突出到周围溶剂中而被容纳而不是由配偶体ch3结构域中的补偿腔容纳。
[0286]
在一些实施方案中,异二聚体分子含有“杵链”的ch3结构域中的t366w突变,以及“臼链”的ch3结构域中的t366s、l368a、y407v突变。在一些情况下,例如通过将y349c突变引入“杵”或“臼”链的ch3结构域中,以及将e356c突变或s354c突变引入另一条链的ch3结构域中,还可以使用ch3结构域之间的另外的链间二硫桥(merchant,a.m.等人,nature biotech.16(1998)677-681)。在一些实施方案中,异二聚体分子含有两个ch3结构域之一中的s354c、t366w突变,以及两个ch3结构域中的另一个中的y349c、t366s、l368a、y407v突变。例如,杵fc可以含有seq id no:89中所示的序列,其含有s354c和t366w,以及seq id no:90中所示的臼fc,其含有突变y349c、t366s、l368a和y407v)。在一些实施方案中,异二聚分子包含两个ch3结构域中的一个中的e356c、t366w突变,以及两个ch3结构域中的另一个中的y349c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中,异二聚分子包含两个ch3结构域中的一个中的y349c、t366w突变,以及两个ch3结构域中的另一个中的e356c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中,异二聚体分子包含两个ch3结构域之一中的y349c、t366w突变,以及两个ch3结构域中的另一个中的s354c、t366s、l368a、y407v突变。其他杵臼结构技术的例子是本领域已知的,例如,如ep 1 870 459 a1所述。
[0287]
在一些实施方案中,含有ch3突起(杵)或腔(臼)修饰的fc变体可以在任何位置与多结构域免疫调节性多肽接合,但是通常经由其n末端或c末端,接合至一个或多个taci多肽序列(例如变体taci多肽序列)的n末端或c末端,如以形成融合多肽。连接可以是直接连接或经由接头的间接连接。通常,通过含有一个或多个ch3突起修饰的fc变体连接的第一免疫调节多肽与含有一个或多个ch3腔修饰的fc变体连接的第二免疫调节多肽的共表达来产生杵和臼分子。
[0288]
杵和臼fc多肽的示例性序列分别示于seq id no:128和129中。在一些实施方案中,杵或臼fc区缺少对应于seq id no:71中所示的野生型或未修饰的fc的位置232的c末端赖氨酸(按照eu编号对应于k447del)。杵和臼fc多肽的示例性序列分别示于seq id no:89和90中。
[0289]
在一些实施方案中,多结构域多肽的单独多肽或单一结构域多肽的单独多肽与形成免疫调节蛋白的多聚化结构域连接,是三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方案中,这样的分子的单独多肽是相同的。在一些实施方案中,这样的多聚化结构域是软骨寡聚基质蛋白(comp)组装结构域、血管舒张剂刺激磷蛋白(vasp)四聚化结构域或zymozipper(zz)12.6结构域。
[0290]
在一些实施方案中,多聚化结构域是软骨寡聚基质蛋白(comp)组装结构域的一部分(voulgaraki等人,immunology(2005)115(3):337-346)。在一些例子中,comp是或含有如seq id no:146中所示的氨基酸序列(例如全长comp的氨基酸29-72,uniprot登录号p49747)或具有与seq id no:146的约85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的序列。
[0291]
在一些实施方案中,多聚化结构域是血管舒张剂刺激磷蛋白(vasp)四聚化结构域(bachmann等人,j biol chem(1999)274(33):23549-23557)。在一些实施方案中,vasp是或含有如seq id no:147中所示的氨基酸序列(例如全长vasp的氨基酸343-375;uniprot登录
号p50552)或具有与seq id no:147的约85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的序列。
[0292]
在一些实施方案中,将taci多肽序列(例如变体taci多肽序列)经由接头(如肽接头)与多聚化结构域(例如fc区)接合。在一些实施方案中,肽接头的长度可以是单一氨基酸残基或更长。在一些实施方案中,肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。
[0293]
在一些实施方案中,接头为(按单字母氨基酸代码):ggggs(“4gs”;seq id no:77)或4gs接头的多聚体,如2、3、4或5个4gs接头的重复序列。在一些实施方案中,肽接头为(ggggs)2(seq id no:78)、(ggggs)3(seq id no:79)、(ggggs)4(seq id no:84)或(ggggs)5(seq id no:91)。在一些实施方案中,接头还可以单独包括一系列丙氨酸残基或者还包括另一个肽接头(如4gs接头或其多聚体)。在一些实施方案中,接头(按单字母氨基酸代码)为gsggggs(seq id no:74)或ggggssa(seq id no:80)。在一些例子中,接头为2xggggs和之后的三个丙氨酸(ggggsggggsaaa;seq id no:133)。在一些例子中,接头示于seq id no:194或195中。
[0294]
在一些实施方案中,taci多肽(如变体taci多肽)与fc序列直接连接。在一些实施方案中,taci多肽(如变体taci多肽)与fc序列间接连接,如经由接头连接。在一些实施方案中,一个或多个“肽接头”连接taci多肽(例如变体taci多肽)与fc区。在一些实施方案中,肽接头的长度可以是单一氨基酸残基或更长。在一些实施方案中,肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。示例性接头包括如本文所述的任何接头。
[0295]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有结构taci多肽(taci)-接头-fc区。在一些实施方案中,免疫调节蛋白是taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。例如,两个相同多肽融合物的fc区之间的相互作用形成共价二硫键以得到含有两个taci多肽(例如两个变体taci多肽)的二聚分子。
[0296]
在一些实施方案中,提供一种taci-fc融合蛋白,其按顺序含有taci多肽(例如如上所述的任一种)、接头和fc区。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是截短的野生型taci多肽,例如如所述的任一种。在一些实施方案中,taci fc融合物的taci多肽示于seq id no:13中。接头可以是如所述的任一种。在一些实施方案中,接头是gsggggs(seq id no:74)。在一些实施方案中,接头是gs(g4s)2(seq id no:194)。fc区可以是如所述的任何fc区。在一些实施方案中,fc区是seq id no:81中所示的野生型igg1 fc。在一些实施方案中,fc区是seq id no:73中所示的变体fc。
[0297]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:171中所示的序列。在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:197中所示的序列。在一些实施方案中,taci-fc融合物由seq id no:208中所示的序列编码。slscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrsgsggggsepkssdkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:171)
[0298]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:172中所示的序列。
slscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrsgsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:172)
[0299]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:196中所示的序列,并且由seq id no:207中所示的序列编码。
[0300]
在一些实施方案中,taci多肽是变体taci多肽。在一些实施方案中,提供一种变体taci-fc融合蛋白,其按顺序含有变体taci多肽(例如如上所述的任一种)、接头和fc区。在一些实施方案中,taci fc融合物的taci多肽是变体taci多肽,例如如所述的任一种。在一些实施方案中,变体taci fc融合物的变体taci示于seq id no:2-12、21、22或101-120中的任一项中。在一些实施方案中,变体taci fc融合物的变体taci示于seq id no:14-20、23-35、92-100或177-192中的任一项中。在一些实施方案中,接头是gsggggs(seq id no:74)。在一些实施方案中,接头是gs(g4s)2(seq id no:194)。在一些实施方案中,fc区是seq id no:81中所示的野生型igg1 fc。在一些实施方案中,fc区是seq id no:73中所示的变体fc。
[0301]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:167-170、200或222-237中任一项中所示的氨基酸序列。
[0302]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:167中所示的序列。slscrkeqgeyydhllrdciscasicgqhpkqcadfcenklrsgsggggsepkssdkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:167)
[0303]
在一些实施方案中,taci-fc融合物由seq id no:211中所示的序列编码。
[0304]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:168中所示的序列。slscrkeqgeyydhllrdciscasicgqhpkqcadfcenklrsgsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:168)
[0305]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:169中所示的序列。slscrkeegkfydhllqdciscasicgqhpkqcayfcenklrsgsggggsepkssdkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:169)
[0306]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:170中所示的序列。slscrkeegkfydhllqdciscasicgqhpkqcayfcenklrsgsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:170)
[0307]
在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白含有多个拷贝的taci多肽序列(例如变体taci-多肽序列),如2、3或4个taci多肽序列。在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白含有两
个taci多肽序列(例如两个变体taci多肽序列)。在一些情形中,taci多肽序列可以直接连接或者可以经由接头(如肽接头,包括如所述的任一种)间接连接。在这样的例子中,taci多肽序列中的一个与fc区接合或连接,如与fc区的n末端或c末端接合或连接。在其他情形中,taci多肽序列可以通过fc区彼此隔开,并且各自与fc区的n末端或c末端单独接合。与fc区的连接可以是直接连接或者可以是经由接头(如肽接头,包括如所述的任一种)的间接连接。
[0308]
在一些实施方案中,taci多肽序列(例如变体taci多肽序列)可以按顺序在融合蛋白中串联排列(下文称为“串联”fc融合构建体)。在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有以下结构:(taci)-接头-(taci)-接头-fc区。在一些实施方案中,免疫调节蛋白是四价分子,所述四价分子是taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。例如,两个相同多肽融合物的fc区之间的相互作用形成共价二硫键以得到含有四个taci多肽(例如四个变体taci多肽)的二聚分子。
[0309]
在一些实施方案中,提供一种taci-fc融合蛋白,其按顺序含有taci多肽(例如如上所述的任一种);接头;另一种taci多肽,例如如所述的任一种;以及fc区。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是截短的野生型taci多肽,例如如所述的任一种。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽示于seq id no:13中。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是变体taci多肽,例如如所述的任一种。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是seq id no:2-12、21、22或101-120中任一项中所示的变体taci。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是seq id no:14-20、23-35、92-100或177-192中任一项中所示的变体taci。接头可以是如所述的任一种。在一些实施方案中,接头是gsggggs(seq id no:74)。fc区可以是如所述的任何fc区。在一些实施方案中,fc区是seq id no:81中所示的野生型igg1 fc。在一些实施方案中,fc区是seq id no:73中所示的变体fc。在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:198中所示的序列,并且由seq id no:209中所示的序列编码。
[0310]
在一些实施方案中,taci多肽序列(例如变体taci多肽序列)可以在融合蛋白中被fc区隔开,其中所述fc区位于两个taci多肽序列之间(下文称为“杠铃(barbell)”fc融合构建体)。在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有以下结构:(taci)-接头-fc区-接头-(taci)。在一些实施方案中,所述接头可以是相同的或不同的。在一些实施方案中,免疫调节蛋白是四价分子,所述四价分子是taci-fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。例如,两个相同多肽融合物的fc区之间的相互作用形成共价二硫键以得到含有四个taci多肽(例如四个变体taci多肽)的二聚分子。
[0311]
在一些实施方案中,提供一种taci-fc融合蛋白,其按顺序含有taci多肽(例如如上所述的任一种);接头;fc区;接头;以及另一种taci多肽,例如如所述的任一种。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是截短的野生型taci多肽,例如如所述的任一种。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽示于seq id no:13中。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是变体taci多肽,例如如所述的任一种。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是seq id no:2-12、21、22或101-120中任一项中所示的变体taci。在一些实施方案中,taci fc融合物中的每个taci多肽是seq id no:14-20、23-35、92-100或177-192中任一项中所示的变体taci。所述接头可以是如所述的
任一种,并且可以是相同的或不同的。在一些实施方案中,第一接头是gsggggs(seq id no:74)并且第二接头是(ggggs)4(seq id no:84)。fc区可以是如所述的任何fc区。在一些实施方案中,fc区是seq id no:81中所示的野生型igg1 fc。在一些实施方案中,fc区是seq id no:73中所示的变体fc。在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:201中所示的序列,并且由seq id no:212中所示的序列编码。在一些实施方案中,taci-fc融合蛋白具有seq id no:202中所示的序列,并且由seq id no:213中所示的序列编码。
[0312]
在一些实施方案中,提供一种taci-fc融合蛋白,其为由两个相同的如所述与fc结构域连接的taci多肽(例如变体taci多肽)形成的二聚体。在一些实施方案中,相同种类(也称为拷贝)的任何所提供的taci-fc融合多肽(例如变体taci-fc融合物)将二聚化以产生同二聚体。在一些实施方案中,二聚体是同二聚体,其中两个taci-fc多肽(例如变体taci-fc多肽)是相同的。对于生成同二聚fc分子,fc区是能够通过单独fc区在细胞中的共表达与匹配的fc区形成同二聚体的fc区。在一些实施方案中,二聚体化是通过在多肽融合物的fc区之间形成的一个或多个共价二硫键介导的。
[0313]
还提供编码免疫调节蛋白的核酸分子。在一些实施方案中,对于免疫调节蛋白的产生,将编码所述免疫调节蛋白的核酸分子插入适当的表达载体中。所得免疫调节蛋白可以在用表达转化的宿主细胞中表达,其中通过在fc部分之间形成的链间二硫键进行fc结构域之间的组装,以产生二聚(如二价)免疫调节蛋白。
[0314]
还提供编码taci-fc融合蛋白(例如变体taci-fc融合蛋白)的核酸分子。在一些实施方案中,对于fc融合蛋白的产生,将编码taci-fc融合蛋白(例如变体taci-fc融合蛋白)的核酸分子插入适当的表达载体中。所得taci-fc融合蛋白(例如变体taci-fc融合蛋白)可以在用表达转化的宿主细胞中表达,其中通过在fc部分之间形成的链间二硫键进行fc结构域之间的组装,以产生二聚(如二价)taci-fc融合蛋白。所得fc融合蛋白可以通过亲和色谱在蛋白a或蛋白g柱上容易地纯化。为了产生异二聚体,可能需要另外的纯化步骤。例如,在将编码不同免疫调节蛋白的两种核酸转化至细胞中的情况下,异二聚体的形成必须以生化方式来实现,因为携带fc结构域的免疫调节蛋白也将被表达为二硫键连接的同二聚体。因此,同二聚体可以在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下还原。在一些情形中,将不同免疫调节蛋白单体以等摩尔量混合并氧化,以形成同二聚体与异二聚体的混合物。通过色谱技术分离该混合物的组分。可替代地,可以通过使用如所述的杵臼结构方法基因工程化和表达包含含有一个或多个taci变体的fc融合分子的免疫调节蛋白来偏向这种类型的异二聚体的形成。
[0315]
在实施方案中,在从细胞产生和表达时,所提供的免疫调节蛋白(如taci-fc(例如变体taci-fc))是含有两条相同多肽链的同二聚体。图8a和图8b描绘本文提供的示例性taci-fc融合蛋白的结构。
[0316]
本文提供两个相同变体taci-fc融合蛋白的taci(26)-fc_73同二聚体,所述变体taci-fc融合蛋白含有seq id no:26中所示的taci富半胱氨酸结构域2(crd2)的变体,所述同二聚体设计为中和april和baff的b细胞刺激活性。所述taci(26)-fc_73同二聚体是由2条相同受体fc-融合蛋白链组成的二聚体,每条链具有通过共价二硫键连接的seq id no:167中所示的变体taci crd2结构域人fc融合物。
[0317]
本文提供两个相同变体taci-fc融合蛋白的taci(26)-fc_81同二聚体,所述变体
taci-fc融合蛋白含有seq id no:26中所示的taci富半胱氨酸结构域2(crd2)的变体,所述同二聚体设计为中和april和baff的b细胞刺激活性。所述taci(26)-fc_81同二聚体是由2条相同受体fc-融合蛋白链组成的二聚体,每条链具有通过共价二硫键连接的seq id no:168中所示的变体taci crd2结构域人fc融合物。
[0318]
本文提供两个相同变体taci-fc融合蛋白的taci(27)-fc_73同二聚体,所述变体taci-fc融合蛋白含有seq id no:27中所示的taci富半胱氨酸结构域2(crd2)的变体,所述同二聚体设计为中和april和baff的b细胞刺激活性。所述taci(27)-fc_73同二聚体是由2条相同受体fc-融合蛋白链组成的二聚体,每条链具有通过共价二硫键连接的seq id no:169中所示的变体taci crd2结构域人fc融合物。
[0319]
本文提供两个相同变体taci-fc融合蛋白的taci(27)-fc_81同二聚体,所述变体taci-fc融合蛋白含有seq id no:27中所示的taci富半胱氨酸结构域2(crd2)的变体,所述同二聚体设计为中和april和baff的b细胞刺激活性。所述taci(27)-fc_81同二聚体是由2条相同受体fc-融合蛋白链组成的二聚体,每条链具有通过共价二硫键连接的seq id no:170中所示的变体taci crd2结构域人fc融合物。
[0320]
在一些实施方案中,所提供的taci-fc(例如变体taci-fc)融合蛋白(如其同二聚体)展现小于400pm的中和baff的ic
50
。在一些实施方案中,中和baff的ic50在1pm与400pm之间,如在10pm与300pm之间、在10pm与200pm之间、在10pm与100pm之间、在10pm与50pm之间、在10pm与20pm之间、在20pm与400pm之间、在20pm与300pm之间、在20pm与200pm之间、在20pm与100pm之间、在20pm与50pm之间、在50pm与400pm之间、在50pm与300pm之间、在50pm与200pm之间、在50pm与100pm之间、在100pm与400pm之间、在100pm与300pm之间、在100pm与200pm之间、在200pm与400pm之间、在200pm与300pm之间或者在300pm与400pm之间。在一些实施方案中,中和baff的ic
50
是为或约10pm、15pm、20pm、25pm、30pm、35pm、40pm、45pm、50pm、55pm、60pm、65pm、70pm、75pm、80pm、85pm、90pm、95pm或100pm,或前述任一项之间的任何值。
[0321]
在一些实施方案中,所提供的taci-fc(例如变体taci-fc)融合蛋白(如其同二聚体)展现小于400pm的中和april的ic
50
。在一些实施方案中,中和april的ic50在0.5pm与100pm之间,如在0.5pm与50pm之间、在0.5pm与25pm之间、在0.5pm与10pm之间、在0.5pm与5pm之间、在0.5pm与1pm之间、在1pm与100pm之间、在1pm与50pm之间、在1pm与25pm之间、在1pm与10pm之间、在1pm与5pm之间、在5pm与100pm之间、在5pm与50pm之间、在5pm与25pm之间、在5pm与10pm之间、在10pm与100pm之间、在10pm与50pm之间、在10pm与25pm之间、或在25pm与100pm之间、在25pm与50pm之间或者在50pm与100pm之间。在一些实施方案中,中和april的ic
50
是为或约0.5pm、0.75pm、1pm、2pm、3pm、4pm、5pm、6pm、7pm、8pm、9pm、10pm、11pm、12pm、13pm、14pm、15pm、20pm或25pm,或前述任一项之间的任何值。iii.用于产生所述多肽或细胞的核酸、载体和方法
[0322]
本文提供分离的或重组的核酸(统称为“核酸”),其编码本文提供的免疫调节蛋白中的任一种。在一些实施方案中,本文提供的核酸(包括下文所述的所有核酸)可用于本文提供的免疫调节蛋白的重组产生(例如,表达)。在一些实施方案中,本文提供的核酸(包括下文所述的所有核酸)可用于本文提供的免疫调节蛋白(如本文提供的taci融合蛋白)的表达。本文提供的核酸可以呈rna形式或呈dna形式,并且包括mrna、crna、重组或合成rna和dna,以及cdna。本文提供的核酸通常是dna分子,并且通常是双链dna分子。然而,还提供包
含本发明的任何核苷酸序列的单链dna、单链rna、双链rna和杂合dna/rna核酸或其组合。
[0323]
在一些情形中,可以将异源(非天然)信号肽添加至编码免疫调节蛋白的核酸。这可能是期望的,例如,在表达不含氨基末端信号序列的taci融合蛋白的情形中。在一些实施方案中,信号肽是来自以下的信号肽:免疫球蛋白(如igg重链或igg-κ轻链)、细胞因子(如白介素-2(il-2)或cd33)、血清白蛋白蛋白质(例如hsa或白蛋白)、人天青杀素前蛋白信号序列、萤光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原),或者能够有效表达且在一些方面从细胞分泌蛋白质的其他信号肽。示例性信号肽包括表3中所述的任一种。示例性信号肽包括表3中所述的任一种。
[0324]
在一些实施方案中,免疫调节蛋白在表达时包含信号肽,并且信号肽(或其部分)在分泌时从免疫调节蛋白裂解。
[0325]
本文还提供可用于产生免疫调节蛋白(如本文所提供的taci融合蛋白)的重组表达载体和重组宿主细胞。
[0326]
在上文提供的任何实施方案中,可以使用重组dna和克隆技术将编码本文提供的免疫调节多肽的核酸引入细胞中。为此,制备编码免疫调节多肽的重组dna分子。制备此类dna分子的方法是本领域中熟知的。例如,可以使用合适的限制性酶从dna切除肽的编码序列。可替代地,可以使用化学合成技术(如亚磷酰胺法)来合成dna分子。同样,可以使用这些技术的组合。在一些情况下,可以通过聚合酶链式反应(pcr)来生成重组或合成核酸。如本领域技术人员已知,可以将编码免疫调节蛋白的dna插入物克隆至适当的转导/转染载体中。还提供含有所述核酸分子的表达载体。
[0327]
在一些实施方案中,所述表达载体能在适当细胞中在适于表达蛋白质的条件下表
达免疫调节蛋白。在一些方面,核酸分子或表达载体包含编码免疫调节蛋白的dna分子,所述免疫调节蛋白与适当的表达控制序列操作性连接。在将dna分子插入载体中之前或之后实现这种操作性连接的方法是熟知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。
[0328]
在一些实施方案中,所述免疫调节蛋白的表达受启动子或增强子控制,以控制或调节表达。所述启动子与核酸分子中编码变体多肽或免疫调节蛋白的部分可操作地连接。
[0329]
使用其上具有dna分子的所得重组表达载体来转化适当宿主。该转化可以使用本领域中熟知的方法来进行。在一些实施方案中,本文提供的核酸还包含编码分泌或信号肽的核苷酸序列,所述核苷酸序列与编码免疫调节多肽的核酸可操作地连接,使得从培养基、宿主细胞或宿主细胞周质回收所得的可溶性免疫调节多肽。在其他实施方案中,选择适当的表达控制信号以允许免疫调节多肽的膜表达。此外,可商购试剂盒以及签约制造公司也可以用于制备本文提供的工程化细胞或重组宿主细胞。
[0330]
在一些实施方案中,使用其上具有dna分子的所得表达载体来转化(如转导)适当细胞。可使用本领域熟知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些,包括经由病毒(例如,逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中,所述表达载体是病毒载体。在一些实施方案中,通过慢病毒或逆转录病毒转导方法将核酸转移至细胞中。
[0331]
大量公共可获得且熟知的哺乳动物宿主细胞(包括哺乳动物t细胞或apc)中的任一种可用于制备多肽或工程化细胞。细胞的选择取决于本领域中公认的多种因素。这些因素包括例如与所选表达载体的相容性、由dna分子编码的肽的毒性、转化率、回收肽的容易性、表达特征、生物安全性和成本。要平衡这些因素,必须深入理解,并非所有细胞都可以同等有效地用于特定dna序列的表达。
[0332]
在一些实施方案中,宿主细胞是哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞的例子包括非洲绿猴肾细胞(vero;atcc crl 1587)、人胚肾细胞(293-hek;atcc crl 1573)、幼仓鼠肾细胞(bhk-21、bhk-570;atcc crl 8544、atcc crl 10314)、犬肾细胞(mdck;atcc ccl 34)、中国仓鼠卵巢细胞(cho-k1;atcc ccl61;cho dg44(chasin等人,som.cell.molec.genet.12:555,1986))、大鼠垂体细胞(gh1;atcc ccl82)、hela s3细胞(atcc ccl2.2)、大鼠肝癌细胞(h-4-ii-e;atcc crl 1548)、sv40转化的猴肾细胞(cos-1;atcc crl 1650)和鼠胚细胞(nih-3t3;atcc crl 1658)。
[0333]
在一些实施方案中,宿主细胞可以是多种真核细胞,如酵母细胞,或哺乳动物细胞,如中国仓鼠卵巢(cho)或hek293细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞是悬浮细胞,并且多肽是在培养悬浮液中,如在培养的悬浮cho细胞(例如,cho-s细胞)中进行工程化或产生。在一些例子中,所述细胞系是缺乏dhfr(dhfr-)cho细胞系,如dg44和duxb11。在一些实施方案中,所述细胞缺乏谷氨酰胺合酶(gs),例如,cho-s细胞、chok1 sv细胞和chozn((r))gs-/-细胞。在一些实施方案中,所述cho细胞(如悬浮cho细胞)可以是cho-s-2h2细胞、cho-s-克隆14细胞或expicho-s细胞。
[0334]
在一些实施方案中,宿主细胞也可以是原核细胞,如大肠杆菌。将转化的重组宿主在多肽表达条件下培养,然后将其纯化以获得可溶蛋白质。可以在常规发酵条件下培养重
组宿主细胞,使得表达所需多肽。此类发酵条件是本领域熟知的。最后,可以通过本领域熟知的多种方法中的任一种从重组细胞培养物回收和纯化本文提供的多肽,所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法和亲和色谱法。在完成成熟蛋白质的构型时,可以视需要使用蛋白质重折叠步骤。最后,可以在最终纯化步骤中采用高效液相色谱法(hplc)。
[0335]
在一些实施方案中,所述重组载体是病毒载体。示例性重组病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、有复制条件的或复制缺陷的、非致病的(缺陷性)、可复制的病毒载体,和/或被修饰以表达异源基因产物,例如,本文提供的变体免疫调节多肽。用于生成病毒的载体还可以被修饰以改变病毒的衰减,其包括增加或减少转录或翻译负荷的任何方法。
[0336]
可以使用的示例性病毒载体包括修饰的痘苗病毒载体(参见例如,guerra等人,j.virol.80:985-98(2006);tartaglia等人,aids research and human retroviruses 8:1445-47(1992);gheradi等人,j.gen.virol.86:2925-36(2005);mayr等人,infection 3:6-14(1975);hu等人,j.virol.75:10300-308(2001);美国专利号5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615和7,368,116);腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体(参见例如,molin等人,j.virol.72:8358-61(1998);narumi等人,am j.respir.cell mol.biol.19:936-41(1998);mercier等人,proc.natl.acad.sci.usa 101:6188-93(2004);美国专利号6,143,290;6,596,535;6,855,317;6,936,257;7,125,717;7,378,087;7,550,296);逆转录病毒载体,包括基于鼠白血病病毒(mulv)、长臂猿白血病病毒(galv)、亲嗜性逆转录病毒、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、人免疫缺陷病毒(hiv)和组合的那些(参见例如,buchscher等人,j.virol.66:2731-39(1992);johann等人,j.virol.66:1635-40(1992);sommerfelt等人,virology 176:58-59(1990);wilson等人,j.virol.63:2374-78(1989);miller等人,j.virol.65:2220-24(1991);miller等人,mol.cell biol.10:4239(1990);kolberg,nih res.4:43 1992;cornetta等人,hum.gene ther.2:215(1991));慢病毒载体,包括基于人免疫缺陷病毒(hiv-1)、hiv-2、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(siv)和梅迪/维斯那病毒的那些(参见例如,pfeifer等人,annu.rev.genomics hum.genet.2:177-211(2001);zufferey等人,j.virol.72:9873,1998;miyoshi等人,j.virol.72:8150,1998;philpott和thrasher,human gene therapy 18:483,2007;engelman等人,j.virol.69:2729,1995;nightingale等人,mol.therapy,13:1121,2006;brown等人,j.virol.73:9011(1999);wo 2009/076524;wo 2012/141984;wo 2016/011083;mcwilliams等人,j.virol.77:11150,2003;powell等人,j.virol.70:5288,1996)或其任何变体,和/或可以用于生成任何上述病毒的载体。在一些实施方案中,重组载体可以包括调节序列,如启动子或增强子序列,所述调节序列可以调节病毒基因组(如在rna病毒的情况下)在包装细胞系中的表达(参见例如,美国专利号5,385,839和5,168,062)。
[0337]
在一些方面,核酸或表达载体包含与适当表达控制序列操作性连接的编码免疫调节蛋白的核酸序列。在编码免疫调节蛋白的核酸序列插入载体中之前或之后实现这种可操作连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。所
述启动子可以与核酸序列中编码免疫调节蛋白的部分可操作地连接。
[0338]
转录调节序列包括足以引导rna合成的起始的启动子区域。合适的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白i基因的启动子(hamer等人,j.molec.appl genet.1:273(1982))、疱疹病毒的tk启动子(mcknight,cell 31:355(1982))、sv40早期启动子(benoist等人,nature 290:304(1981))、劳斯肉瘤病毒启动子(gorman等人,proc.nat'l acad.sci.usa 79:6777(1982))、巨细胞病毒启动子(foecking等人,gene 45:101(1980))和小鼠乳腺瘤病毒启动子(大体上参见etcheverry,"expression of engineered proteins in mammalian cell culture",protein engineering:principles and practice,cleland等人(编辑),第163-181页(john wiley&sons,inc.1996))。启动子与增强子的一种有用的组合由骨髓增生性肉瘤病毒启动子和人巨细胞病毒增强子提供。
[0339]
可替代地,如果原核启动子受真核启动子调节,则所述原核启动子(如噬菌体t3 rna聚合酶启动子)可以用于控制免疫调节蛋白在哺乳动物细胞中的产生(zhou等人,mol cell.biol.10:4529(1990);以及kaufman等人,nucl.acids res.19:4485(1991))。
[0340]
可以使用多种标准技术将表达载体引入宿主细胞中,所述标准技术包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微射弹介导的递送、电穿孔等。可以选择并繁殖转染的细胞以提供包含稳定整合于宿主细胞基因组中的表达载体的重组宿主细胞。用于将载体引入真核细胞中的技术以及用于使用显性可选标记来选择这样的稳定转化体的技术例如由ausubel(1995)以及由murray(编辑),gene transfer and expression protocols(humana press 1991)描述。
[0341]
例如,一种合适的可选标记是提供对抗生素新霉素的抗性的基因。在此情形中,在新霉素型药物(如g-418等)的存在下进行选择。选择系统还可以用于增加目的基因的表达水平,所述过程被称为“扩增”。通过以下方式进行扩增:在低水平的选择剂的存在下培养转染子,然后增加选择剂的量以选择产生高水平的所引入基因的产物的细胞。合适的可扩增可选标记是二氢叶酸还原酶,其赋予对氨甲蝶呤的抗性。还可以使用其他抗药性基因(例如,潮霉素抗性、多药抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。可替代地,可以通过诸如facs分选或磁珠分离技术的手段使用引入改变的表型的标记(如绿色荧光蛋白,或细胞表面蛋白(如cd4、cd8、i类mhc、胎盘碱性磷酸酶))来分选转染的细胞与未转染的细胞。
[0342]
在一些实施方案中,本文提供的多肽还可以通过合成方法来制备。固相合成是制备单独肽的优选技术,因为它是制备小肽的最划算的方法。例如,熟知的固相合成技术包括保护基团、接头和固相支持物的使用,以及特定的保护和去保护反应条件、接头切割条件、清除剂的使用,以及固相肽合成的其他方面。然后可以将肽组装成如本文所提供的多肽。iv.药物组合物
[0343]
本文提供含有任何本文所述的所提供的免疫调节蛋白的组合物。所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。例如,药物组合物可以含有一种或多种赋形剂,用于改变、维持或保持例如组合物的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。这样的组合物可以包含缓冲液,如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等;碳水化合物,如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白质;多肽或氨基酸,如甘氨酸;抗氧化剂;螯合剂,如edta或谷胱甘肽;佐剂(例如,氢氧化铝);和防腐剂。
[0344]
在一些实施方案中,所述药物组合物是固体,如粉末、胶囊或片剂。例如,所述药物
组合物的组分可以是冻干的。在一些实施方案中,在给予之前将固体药物组合物重构或溶解在液体中。
[0345]
在一些实施方案中,所述药物组合物是液体,例如溶解于水溶液(如生理盐水或林格氏溶液)中的免疫调节蛋白。在一些实施方案中,所述药物组合物的ph在约4.0与约8.5之间(如在约4.0与约5.0之间、在约4.5与约5.5之间、在约5.0与约6.0之间、在约5.5与约6.5之间、在约6.0与约7.0之间、在约6.5与约7.5之间、在约7.0与约8.0之间或在约7.5与约8.5之间)。
[0346]
在一些实施方案中,所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂,例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(hpmc)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。
[0347]
在一些实施方案中,所述药物组合物还包含用于产物的受控释放或持续释放的药剂,如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体。
[0348]
在一些实施方案中,所述药物组合物是无菌的。灭菌可以通过经由无菌滤膜过滤或辐射来完成。在冻干组合物的情况下,可以在冻干和重构之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。另外,通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器中,例如,静脉内输液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶。
[0349]
药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或媒介物。例如,所述载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料,或其一些组合。载剂的每一组分必须是“药学上可接受的”,因为其必须与配制品中的其他成分相容。它还必须适于与它可能遇到的身体的任何组织、器官或部分接触,这意味着它不得带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过多超出其治疗益处的任何其他并发症的风险。
[0350]
在一些实施方案中,将药物组合物施用至受试者。通常,根据标准药学实践,根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给药途径。例如,最初可以在细胞培养测定中或在动物模型(如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴)中估计治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定适当浓度范围和施用途径。这样的信息随后可用于确定在人体中的可用剂量和施用途径。确切的剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和给药以提供足够水平的活性化合物或以维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、施用的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对疗法的反应。
[0351]
长效药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周施用一次。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常,施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此,组合物可以以单一剂量的方式施用,或随时间以多个剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式施用,或以连续输注的方式施用。常规地对合适的剂量做出进一步改进。可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当剂量。
[0352]
在一些实施方案中,通过任何途径向受试者施用所述药物组合物,包括口服、透皮、通过吸入、静脉内、动脉内、肌内、直接应用于伤口部位、应用于外科手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内或脊柱内。
[0353]
所提供的药物配制品可以例如呈适于静脉内输注的形式。
[0354]
在一些实施方案中,所述药物组合物的剂量是单一剂量或重复剂量。在一些实施方案中,每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或更多次将所述剂量给予受试者。在一些实施方案中,在一周内给予约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中,在数天、数周、数月或数年的过程中给予多个剂量。在一些实施方案中,治疗过程为约1或更多个剂量(例如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量或约100或更多个剂量)。
[0355]
在一些实施方案中,所施用的药物组合物的剂量为每kg受试者体重约1μg蛋白质或更多(如每kg受试者体重约2μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约5μg蛋白质)或更多、每kg受试者体重约10μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约25μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约50μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约100μg蛋白质或更高、每kg受试者体重约250μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约500μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约1mg蛋白质或更多、每kg受试者体重约2mg蛋白质或更多或每kg受试者体重约5mg蛋白质或更多)。v.用于评估免疫调节蛋白的活性和免疫调节的方法
[0356]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白(如本文提供的taci融合蛋白)展现免疫调节活性。所提供的免疫调节蛋白(如taci融合蛋白)可以调节b细胞活性,如b细胞增殖、分化或存活中的一种或多种。
[0357]
可以使用多种方法检查免疫调节蛋白的功能以评估所述蛋白质与同源结合配偶体结合的能力。例如,可以评估taci融合蛋白与april或baff的结合。已知多种测定用于评估结合亲和力和/或确定结合分子(例如,免疫调节蛋白)是否与特定结合配偶体特异性结合。技术人员可以熟练地确定结合分子(例如,免疫调节蛋白)对结合配偶体(例如,april或baff)的结合亲和力,如通过使用本领域中熟知的多种结合测定中的任一种。各种结合测定是已知的并且包括但不限于例如elisa kd、kinexa、流式细胞术和/或表面等离子体共振装置,包括本文所述的那些。此类方法包括但不限于涉及或流式细胞术的方法。例如,在一些实施方案中,可以使用仪器使用表面等离子体共振(spr)分析来确定两种蛋白质之间的复合物的结合动力学和常数(参见例如,scatchard等人,ann.n.y.acad.sci.51:660,1949;wilson,science 295:2103,2002;wolff等人,cancer res.53:2560,1993;以及美国专利号5,283,173、5,468,614或同等文献)。在分子结合至表面或从表面解离时,spr测量传感器表面处分子浓度的变化。spr信号的变化与靠近表面的
质量浓度变化成正比,从而允许测量两个分子之间的结合动力学。可以通过监测当缓冲液通过芯片时折射率相对于时间的变化来确定复合物的解离常数。用于测量一种蛋白质与另一种蛋白质的结合的其他合适的测定包括例如免疫测定(如酶联免疫吸附测定(elisa)和放射免疫测定(ria))或通过借助荧光、紫外吸收、圆二色性或核磁共振(nmr)监测蛋白质的光谱或光学性质的变化来确定结合。其他示例性测定包括但不限于蛋白质印迹、elisa、分析型超速离心、光谱法、流式细胞术、测序和用于检测所表达的多核苷酸或蛋白质结合的其他方法。
[0358]
还可以在多种评估中的任一种中评估所提供的免疫调节蛋白以评估对b细胞活性的调节。一种这样的测定是细胞增殖测定。在存在或不存在测试化合物(例如免疫调节蛋白)的情况下培养细胞,并且通过例如测量含氚胸苷的掺入或基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(mtt)的代谢分解通过比色测定来检测细胞增殖(mosman,j.immunol.meth.65:55-63,1983)。替代性测定格式使用进一步工程化以表达报告基因的细胞。所述报告基因与对受体连锁途径有反应的启动子元件连接,并且所述测定检测对所述报告基因转录的激活。在细胞提取物中易于测定的多种报告基因是本领域中已知的,例如,大肠杆菌lacz、氯霉素乙酰转移酶(cat)和血清应答元件(sre)(参见例如,shaw等人,cell 56:563-72,1989)。示例性报告基因是萤光素酶基因(de wet等人,mol.cell.biol.7:725,1987)。使用本领域中已知的方法通过发光检测萤光素酶基因的表达(例如,baumgartner等人,j.biol.chem.269:29094-101,1994;schenborn和goiffin,promega notes 41:11,1993)。萤光素酶活性测定试剂盒可从例如promega corp.(威斯康星州麦迪逊市)商购。
[0359]
所提供的免疫调节蛋白的特征可以是抑制可溶april或baff对人b细胞的刺激的能力,如由gross等人在国际公开号wo00/40716中所述。简言之,将人b细胞从外周血单个核细胞分离,如使用cd19磁珠分离(例如miltenyi biotec auburn,加利福尼亚州)。可以将纯化的b细胞在刺激的条件下(例如在可溶april的存在下)孵育,并进一步在递增浓度的免疫调节蛋白的存在下孵育。所述b细胞可以用增殖染料来标记,或者可以用1μci 3
h-胸苷来标记,以测量增殖。可以随时间确定b细胞的数量。
[0360]
可以制备在转录因子(如nf-κb、nfat-1和ap-1)的可操作控制下表达报告基因的报告细胞系,其表达taci或bcma。例如,报告细胞可以包括jurkat和其他b淋巴瘤细胞系。这些细胞与可溶baff或april配体一起孵育经由这些构建体中的报告基因发信号。可以评估所提供的免疫调节蛋白调节该信号传导的作用。
[0361]
可获得完善的动物模型来测试所提供的免疫调节蛋白在某些疾病状态(包括涉及自身免疫性或炎性病症的那些)中的体内功效。例如,自身免疫性疾病的动物模型包括例如mrl-lpr/lpr或nzb
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nzw f1同类系小鼠品系,其用作sle(系统性红斑狼疮)的模型。这样的动物模型是本领域中已知的,参见例如autoimmune disease models a guidebook,cohen和miller编辑academic press。新西兰黑色(nzb)与新西兰白色(nzw)小鼠之间杂交的后代发生自发形式的sle,它与人sle非常相似。称为nzbw的后代小鼠在1月龄时开始产生针对t细胞的igm自身抗体,并且截至5-7月龄,ig抗dna自身抗体为显性免疫球蛋白。多克隆b细胞过度活跃导致自身抗体的过多产生。这些自身抗体、特别是针对单链dna的自身抗体的沉积与肾小球肾炎的发展相关,肾小球肾炎在临床上表现为蛋白尿、氮质血症和因肾衰竭而死
亡。肾衰竭是受自发性sle影响的小鼠的首要死因,并且在nzbw品系中,这个过程是慢性的和闭塞的。所述疾病在雌性中比在雄性中更快且更严重,平均存活时间仅为245天,与之相比,雄性为406天。尽管许多雌性小鼠截至7-9月龄将有症状(蛋白尿),但是一些雌性小鼠在出现症状时可能显著更年轻或更年老。在nzbw小鼠中见到的致命的免疫肾炎与在人sle中见到的肾小球肾炎非常相似,使得这种自发性鼠模型对于测试潜在的sle治疗药非常有吸引力(putterman和naparstek,murine models of spontaneous systemic lupus erythematosus,autoimmune disease models:a guidebook,第14章,第217-34页,1994;mohan等人,j.immunol.154:1470-80,1995;以及daikh等人,j.immunol.159:3104-08,1997)。可以评估将所提供的免疫调节蛋白施用至这些小鼠以评价改善症状的功效和对病程的改变。
[0362]
炎症和狼疮样疾病的另一种小鼠模型是bm12诱导性小鼠sle模型(klarquist和janssen,2015.j.vis.exp.(105),e53319)。来自雌性i-a
bm12
b6(c)-h2-ab1
bm12
/khegj(“bm12”)小鼠的脾细胞悬浮液过继转移至雌性c57bl/6nj受体小鼠中。h2-ab1
bm12
与h2-ab1b相差3个核苷酸,导致mhc ii类i-a分子的β链中3个氨基酸的改变。受体抗原呈递细胞对供体bm12 cd4+t细胞的同种激活导致慢性gvhd,其症状与sle非常相似,包括自身抗体产生、免疫细胞子集的变化以及轻度肾病。具有免疫复合物沉积的肾小球肾炎在所述模型中较晚出现,主要由与igg1、igg2b、igg2c和igg3抗体结合的自身抗原构成。该模型的终点可以包括抗dsdna抗体的浓度、选择igg同种型、血尿素氮(bun)、和血清中的肌酐、脾和子宫颈ln中的免疫细胞子集组成,以及肾组织学。
[0363]
在一些实施方案中,可以使用舍格伦综合征(sjs)的小鼠模型。可以基于由zhou等人,2016sci.rep.6,39105所公开方案的修改形式,使用抗小鼠(m)pd-l1抗体的重复给药,在雌性的易患糖尿病的非肥胖糖尿病(nod)小鼠中诱导sjs疾病以及糖尿病的加速发作。在6周龄开始,在研究第0天、第2天、第4天和第6天,向小鼠腹膜内(ip)注射100μg抗pd-l1抗体,并在不同天数用所提供的免疫调节蛋白治疗所述小鼠。包括初试小鼠作为终点分析的对照。通常在研究第10天处死所有小鼠,并且从每只小鼠收集下颌下腺(smg)和胰腺用于组织病理学评价,以评估涎腺炎和胰岛炎的体征和严重性。可以在不同天数测量血糖水平。
[0364]
在一些实施方案中,可以使用实验性变态反应性脑脊髓炎(eae)的小鼠模型。所述模型类似于人多发性硬化,并且由于对神经蛋白如髓鞘碱性蛋白(mbp)或蛋白脂质蛋白(plp)的t细胞激活而发生脱髓鞘作用。用抗原接种导致诱导cd4+ii类mhc限制性t细胞(th1)。用于eae的方案中的变化可以产生所述模型的急性的、慢性-复发的或被动转移的变体(weinberg等人,j.immunol.162:1818-26,1999;mijaba等人,cell.immunol.186:94-102,1999;以及glabinski,meth.enzym.288:182-90,1997)。可以评估施用所提供的免疫调节蛋白以改善症状和对病程的改变。
[0365]
在一些实施方案中,可以使用胶原诱发关节炎(cia)模型,其中小鼠患上慢性炎性关节炎,它与人类风湿性关节炎(ra)非常相似。由于cia与ra共有类似的免疫和病理学特征,这使其成为用于筛选潜在的人抗炎性化合物的理想模型。使用cia模型的另一个优点在于,发病机制是已知的。已经鉴定出ii型胶原上的t细胞和b细胞表位,并且已经确定与免疫介导的关节炎相关的各种免疫学(延迟型超敏反应和抗胶原抗体)和炎性(细胞因子、趋化因子和基质降解酶)参数,并且它们可以用于评估测试化合物在所述模型中的功效
(wooley,curr.opin.rheum.3:407-20,1999;williams等人,immunol.89:9784-788,1992;myers等人,life sci.61:1861-78,1997;以及wang等人,immunol.92:8955-959,1995)。可以评估施用所提供的免疫调节蛋白以改善症状和对病程的改变。
[0366]
在一些实施方案中,可以在小鼠被注射卵白蛋白并用抗原经鼻再刺激(其在支气管中产生类似于哮喘的哮喘性反应)时,创建支气管感染(如哮喘)的模型。可以评估施用所提供的免疫调节蛋白以改善症状和对病程的改变。
[0367]
在一些实施方案中,重症肌无力(mg)是另一种可针对其获得鼠模型的自身免疫性疾病。mg是一种神经肌肉传递障碍,其涉及针对烟碱型乙酰胆碱受体(achr)的自身抗体的产生。mg是获得性或遗传性的,其临床特征包括在体力活动时异常的乏力和疲劳。已经建立mg小鼠模型。(christadoss等人,establishment of a mouse model of myasthenia gravis which mimics human myasthenia gravis pathogenesis for immune intervention,immunobiology of proteins and peptides viii,atassi和bixler编辑,1995,第195-99页。)实验性自身免疫性重症肌无力(eamg)是一种抗体介导的疾病,其特征为针对achr的抗体的存在。这些抗体破坏所述受体,导致神经肌肉电脉冲缺陷,从而导致肌无力。在eamg模型中,用烟碱型乙酰胆碱受体对小鼠进行免疫。mg的临床体征在第二次免疫后数周变得明显。通过几种方法评价eamg,所述方法包括通过放射免疫测定测量achr抗体的血清水平(christadoss和dauphinee,j.immunol.136:2437-40,1986;以及lindstrom等人,methods enzymol.74:432-60,1981)、测量肌肉achr或肌电测量术(wu等人protocols in immunology.第3卷,coligen,kruisbeak,margulies,shevach和strober编辑.john wiley and sons,纽约,第15.8.1页,1997)。
[0368]
体内模型的另一种用途包括将抗原激发递送至动物,之后施用免疫调节蛋白并测量t细胞和b细胞应答。可以如perez-melgosa等人,j.immunol.163:1123-7,1999中所述来测量t细胞依赖型和非t细胞依赖性免疫应答。可以进行经历常规抗原激发(例如,钥孔血蓝蛋白(klh)、绵羊红细胞(srbc)、卵白蛋白或胶原)之后施用所提供的免疫调节蛋白的动物中的免疫应答以测量对b细胞应答的作用。
[0369]
可以使用药代动力学研究与放射性标记的免疫调节蛋白结合来确定这样的多肽在体内的分布和半衰期。vi.治疗性应用
[0370]
本文所述的药物组合物(包括包含本文所述的免疫调节蛋白(例如taci-fc)的药物组合物)可以用于多种治疗性应用(如疾病的治疗)中。例如,在一些实施方案中,所述药物组合物用于治疗哺乳动物的炎性或自身免疫性障碍、癌症、器官移植、病毒感染和/或细菌感染。所述药物组合物可以调节(例如减少)免疫应答以治疗疾病。
[0371]
这样的方法和用途包括治疗性方法和用途,例如,其设计将分子或含有所述分子的组合物施用至患有疾病、病症或障碍的受试者。在一些情形中,如所述,所述疾病、病症或障碍是自身免疫性或炎性疾病或障碍。在一些实施方案中,以实现所述疾病或障碍的治疗的有效量施用所述分子或工程化细胞。用途包括含有免疫调节蛋白的分子的用途,以及在制备药物以进行这样的治疗性方法中的用途。在一些实施方案中,通过将所提供的免疫调节蛋白或包含其的组合物施用至患有或怀疑患有疾病或病症的受试者来进行所述方法。在一些实施方案中,所述方法由此治疗受试者的疾病、障碍或病症或障碍。
[0372]
说明性受试者包括哺乳动物受试者,如耕畜、家畜和人类患者。在特定实施方案中,所述受试者是人类受试者。
[0373]
本文所述药物组合物可用于多种治疗性应用中,例如疾病的治疗。例如,在一些实施方案中,药物组合物用于治疗哺乳动物的炎性或自身免疫性障碍、器官移植、病毒感染和/或细菌感染。药物组合物可调节免疫应答以治疗疾病。在一些实施方案中,药物组合物抑制免疫应答,其可用于炎性或自身免疫性障碍或器官移植的治疗中。
[0374]
据信所提供的方法可用于多种应用中,包括但不限于例如用于治疗哺乳动物的多种免疫系统疾病或病症的预防性或治疗性方法中,在所述疾病或病症中免疫系统和免疫系统反应的调节或调控是有益的。例如,阻抑免疫应答在预防性和/或治疗性方法中可以是有益的,用于抑制受体对来自供体的组织、细胞或器官移植物的排斥。在治疗性情况中,哺乳动物受试者通常是患有免疫系统疾病或病症的受试者,并且实施给予以防止疾病或病症的进一步进展。
[0375]
所提供的免疫调节蛋白(包括taci融合蛋白)可以用于以下疾病的治疗:自身免疫性疾病、b细胞癌、免疫调节、ebd和任何抗体介导的病状(例如,itcp、重症肌无力等)、肾病、间接t细胞免疫应答、移植物排斥以及移植物抗宿主病。免疫调节蛋白(例如taci-fc)的施用可以在免疫应答期间特异性调节b细胞应答。另外,所提供的免疫调节蛋白的施用可以用于调节b细胞发育、其他细胞的发育、抗体产生和细胞因子产生。所提供的免疫调节蛋白的施用或使用还可以调节b细胞通信,如通过中和baff或april的增殖效应。
[0376]
在一些实施方案中,药物组合物抑制免疫应答,其可用于炎性或自身免疫性障碍或器官移植的治疗中。在一些实施方案中,药物组合物含有展现对b细胞刺激性受体的拮抗剂活性的免疫调节蛋白,从而降低或减少免疫应答。
[0377]
在一些实施方案中,组合物可用于治疗自身免疫疾病。在一些实施方案中,将含有本文提供的免疫调节蛋白的治疗组合物施用至患有免疫系统疾病(例如,自身免疫性疾病)的受试者可以导致对这样的免疫系统攻击或与其相关的生物反应的阻抑或抑制。通过阻抑对健康身体组织的这种免疫系统攻击,可减少或缓解因针对健康组织的所述攻击所致或与所述攻击相关的所得物理症状(例如,疼痛、关节炎症、关节肿胀或压痛),并且可减少、减缓或停止因免疫系统攻击所致或与所述攻击相关的生物和物理损伤。在预防性情况下,受试者可以是患有、易患或被认为呈现免疫系统疾病、障碍或病症的受试者,并且通常实施给予以防止疾病、障碍或病症进展,抑制或缓解与其相关的症状、体征或生物反应,防止可能由其造成的身体损伤,和/或维持或改善受试者的身体机能。
[0378]
在一些实施方案中,可以通过本文所述的药物组合物治疗的疾病或病症是通过以下介导的任何疾病:免疫复合物沉积(例如狼疮性肾炎、血管炎);对途经的直接干扰(例如灾难性抗磷脂抗体综合征、重症肌无力危象;抗jo-1病);对细胞的调理作用或直接损伤(例如特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血);抗体介导的对同种异体移植物的排斥(例如高度敏化的肾移植患者);或者针对生物替代因子、载体的抗药抗体(例如抗因子8)。
[0379]
在一些实施方案中,可以通过本文所述的药物组合物治疗的炎性和自身免疫性障碍、病症或疾病是系统性红斑狼疮(sle),包括不使用糖皮质激素的爆发预防;舍格伦综合征;原发性胆汁性肝硬化(pbc);系统性硬皮病;多发性肌炎;糖尿病预防;iga肾病;iga血管
炎;b细胞癌,例如骨髓瘤;多发性硬化或视神经炎。
[0380]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白可以用于治疗前b细胞白血病或b细胞白血病(如浆细胞白血病、慢性或急性淋巴细胞白血病)、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、内皮骨髓瘤和巨大细胞骨髓瘤)以及淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)。在一些任何实施方案中,骨髓瘤的类型包括多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、多发性孤立性浆细胞瘤和/或髓外骨髓瘤。在一些任何实施方案中,骨髓瘤的类型包括轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤和/或igd或ige骨髓瘤。
[0381]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白可以用作免疫抑制剂以选择性阻断b淋巴细胞的作用,用于治疗疾病。例如,某些自身免疫性疾病的特征为产生自身抗体,所述自身抗体促进组织破坏和疾病加重。自身抗体还可能导致免疫复合物沉积并发症的发生并导致系统性红斑狼疮的许多症状(包括肾衰竭、神经痛症状和死亡)。调节与细胞应答无关的抗体产生在许多疾病状态中也会是有益的。还已经显示b细胞在类风湿性关节炎中在致关节炎免疫球蛋白的分泌中起作用。所提供的免疫调节蛋白用于抑制、阻断或中和b细胞的作用,从而阻抑抗体产生的方法和用途在以下疾病的治疗中会是有益的:自身免疫性疾病,如重症肌无力、类风湿性关节炎、多关节型幼年型类风湿性关节炎和银屑病关节炎。
[0382]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白可以用于阻断或中和与末期肾病相关的b细胞作用,所述b细胞作用可能与自身免疫性疾病相关或可能无关。这样的方法还将可用于治疗免疫性肾病。这样的方法还将可用于治疗与诸如以下的疾病相关的肾小球肾炎:膜性肾病、iga肾病或berger病、igm肾病、iga血管炎、古德帕斯彻病、感染后肾小球肾炎、系膜增生性疾病、慢性淋巴性白血病、微小病变型肾病综合征。这样的方法还将用作用于治疗与诸如以下的疾病相关的继发性肾小球肾炎或血管炎的治疗性应用:狼疮、多发性大动脉炎、过敏性紫癜、硬皮病、htv相关疾病、淀粉样变性或溶血尿毒症综合征。所提供的方法还将可用作用于治疗与以下疾病相关的间质性肾炎或肾盂肾炎的治疗性应用的部分:慢性肾盂肾炎、镇痛药滥用、肾钙沉着症、由其他因素引起的肾病、肾结石或者慢性或急性间质性肾炎。本文提供的方法还包括在高血压或大血管疾病的治疗中使用所提供的免疫调节蛋白,所述疾病包括肾动脉狭窄或阻塞以及胆固醇栓塞或肾栓塞。所提供的方法和用途还可以用于治疗肾或泌尿系肿瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变性。
[0383]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白还可以用于治疗哮喘和其他慢性气道疾病,如支气管炎和肺气肿。所提供的免疫调节蛋白还可以用于治疗舍格伦综合征。
[0384]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白的方法和用途包括免疫抑制,特别是用于诸如用于移植物抗宿主病和移植物排斥的治疗性用途。在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白的方法和用途包括诸如胰岛素依赖性糖尿病(iddm)和克罗恩病的自身免疫性疾病的治疗。本文提供的方法将具有另外的治疗价值,用于治疗慢性炎性疾病,特别是用于减轻关节疼痛、肿胀、贫血和其他相关症状以及治疗感染性休克。
[0385]
在一些实施方案中,可以通过含有本文所述的免疫调节蛋白的药物组合物治疗的炎性和自身免疫性障碍包括但不限于失弛缓症;艾迪生病;成人斯蒂尔病;无丙种球蛋白血症;斑秃;淀粉样变性;强直性脊柱炎;抗gbm/抗tbm肾炎;抗磷脂综合征;自身免疫性肾上腺炎(艾迪生病);自身免疫性血管性水肿;自身免疫性自主神经机能异常;自身免疫性脑脊髓炎;自身免疫性肝炎;自身免疫性内耳疾病(aied);自身免疫性心肌炎;自身免疫性卵巢炎;
自身免疫性睾丸炎;自身免疫性胰腺炎;自身免疫性多腺性综合征ii型(aps ii);自身免疫性视网膜病变;自身免疫性甲状腺疾病(aitd),即桥本甲状腺炎;自身免疫性荨麻疹;轴突和神经元神经病(aman);巴洛病;眼-口-生殖器综合征;良性黏膜类天疱疮;大疱性类天疱疮;卡斯尔曼病(cd);乳糜泻;美洲锥虫病;慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cidp);慢性复发性多病灶性骨髓炎(crmo);churg-strauss综合征(css)或嗜酸性肉芽肿(egpa);瘢痕性类天疱疮;寇甘综合征;冷凝集素病;先天性心脏传导阻滞;柯萨奇病毒性心肌炎;crest综合征;克罗恩病;疱疹样皮炎;皮肌炎;德维克病(视神经脊髓炎);盘状狼疮;心肌梗死后综合征;子宫内膜异位症;嗜酸细胞性食管炎(eoe);嗜酸细胞性筋膜炎;结节性红斑;重症混合型冷球蛋白血症;伊文思综合征;纤维肌痛;纤维化肺泡炎;巨细胞动脉炎(颞动脉炎);巨细胞心肌炎;肾小球肾炎;古德帕斯丘综合征;肉芽肿合并多血管炎;格雷夫斯病;格林-巴利综合征;桥本甲状腺炎;溶血性贫血;过敏性紫癜(hsp);妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(pg);化脓性汗腺炎(hs)(反常性痤疮);低丙球蛋白血症;iga肾病;iga血管炎;igg4相关硬化性疾病;免疫性血小板减少性紫癜(itp);包涵体肌炎(ibm);间质性膀胱炎(ic);幼年型关节炎;幼年型糖尿病(1型糖尿病);幼年型肌炎(jm);川崎病;兰伯特-伊顿综合征;白细胞破碎性血管炎;紫癜风;硬化性苔癣;木样结膜炎;线性iga病(lad);狼疮;慢性莱姆病;美尼尔氏病;显微镜下多血管炎(mpa);混合性结缔组织病(mctd);蚕蚀性角膜溃疡;穆-哈二氏病;多灶性运动神经病(mmn)或mmncb;多发性硬化;重症肌无力;肌炎;发作性睡病;新生儿狼疮;视神经脊髓炎;中性粒细胞减少症;眼瘢痕性类天疱疮;视神经炎;复发性风湿病(pr);pandas;副肿瘤性小脑变性(pcd);阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh);parry romberg综合征;睫状体扁平部炎(中间葡萄膜炎);parsonage-turner综合征;天疱疮、寻常型天疱疮;周围神经病;静脉周脑脊髓炎;恶性贫血(pa);poems综合征;结节性多动脉炎;多腺性综合征i型、ii型、iii型;风湿性多肌痛;多发性肌炎;心肌梗死后综合征;心包切开术后综合征;原发性胆汁性肝硬化;原发性硬化性胆管炎;孕酮性皮炎;银屑病;银屑病关节炎;纯红细胞再生障碍(prca);坏疽性脓皮病;雷诺现象;反应性关节炎;反射交感性营养不良;复发性多软骨炎;不宁腿综合征(rls);腹膜后纤维化;风湿热;类风湿性关节炎;结节病;施密特综合征;巩膜炎;硬皮病;舍格伦综合征;精子和睾丸自身免疫;僵人综合征(sps);亚急性细菌性心内膜炎(sbe);susac综合征;交感性眼炎(so);takayasu动脉炎;颞动脉炎/巨细胞动脉炎;血小板减少性紫癜(ttp);托洛萨-亨特综合征(ths);横贯性脊髓炎;1型糖尿病;溃疡性结肠炎(uc);未分化结缔组织病(uctd);葡萄膜炎;血管炎;白癜风或伏格特-小柳-原田病。
[0386]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc)可以用于治疗硬皮病、重症肌无力、gvhd(包括急性gvhd或慢性gvhd)、与移植相关的免疫应答;抗磷脂抗体综合征;多发性硬化;舍格伦综合征;igg4相关疾病;i型糖尿病;类风湿性关节炎(包括糖皮质激素疗法(gc)ra)或急性狼疮性肾炎。
[0387]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc)可以用于治疗肌萎缩侧索硬化、视神经脊髓炎、横贯性脊髓炎、cns自身免疫、格林-巴利综合征、神经囊尾蚴病、结节病(t/seroneg)、churg-strauss综合征、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、免疫性血小板减少症(itp)、艾迪生病、多发性肌炎或皮肌炎。
[0388]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc)可以用于治疗iga肾病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、抗合成酶病如jo-1综合征或anca血管炎。
[0389]
在一些实施方案中,所提供的免疫调节蛋白(例如taci-fc)可以用于治疗b细胞癌。在一些实施方案中,所述b细胞癌是如下癌症,其中在向b细胞提供自分泌生存环时涉及或牵涉到baff和april。在一些实施方案中,所述癌症是b细胞慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中,所述癌症是骨髓瘤。
[0390]
在一些实施方案中,给予治疗量的药物组合物。通常,要施用的本发明组合物的精确量可以由医师在考虑患者(受试者)的年龄、体重、感染程度和身体状况的个体差异后决定。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域技术人员通过监测患者的疾病征候并相应调整治疗而容易地确定。
[0391]
主题组合物的基于可以任何便捷方式来实施,包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输液、植入或移植来实施。本文所述组合物可皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内给予。在一个实施方案中,治疗组合物是通过真皮内或皮下注射给予患者。在另一实施方案中,治疗组合物是通过静脉内注射来给予。
[0392]
在一些实施方案中,药物组合物是作为单一疗法(即,作为单一药剂)或作为组合疗法(即,与一种或多种另外的免疫抑制剂组合)来施用。在一些实施方案中,所述另外的药剂是糖皮质激素(例如,泼尼松、地塞米松和氢化可的松)、细胞抑制剂(如影响t细胞和/或b细胞的增殖的细胞抑制剂(例如,嘌呤类似物、烷化剂或抗代谢物))、抗体(例如,抗cd20、抗cd25或抗cd3单克隆抗体)、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、依维莫司、干扰素、阿片类、tnf结合蛋白、霉酚酸酯、小型生物制剂(如芬戈莫德或多球壳菌素)、细胞因子(如干扰素β-1a)、整联蛋白激动剂或整联蛋白拮抗剂。vii.制品和试剂盒
[0393]
本文还提供了处于合适包装中的包含本文所述药物组合物的制品。用于本文所述组合物的合适包装是本领域已知的,并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如,密封的聚酯薄膜(mylar)或塑料袋)等。可进一步将这些制品灭菌和/或密封。
[0394]
还提供试剂盒,其包含本文所述的药物组合物(或制品),所述试剂盒还可以包含关于使用所述组合物的方法(如本文所述的用途)的一个或多个说明书。本文所述的试剂盒还可以包括商业和用户角度所需的其他材料,包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。viii.示例性实施方案
[0395]
所提供的实施方案包括:1.一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白包含至少一种taci多肽,所述taci多肽是截短的野生型taci细胞外结构域或者是其变体,其中所述截短的野生型taci细胞外结构域含有富半胱氨酸结构域2(crd2)但缺少完整的富半胱氨酸结构域1(crd1),其中所述变体taci多肽包含所述截短的野生型taci细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。2.一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白包含至少一种taci多肽,所述taci多肽是截短的野生型taci细胞外结构域或者是其变体,其中关于seq id no:122中所示的位置,所述截短的野生型taci细胞外结构域由氨基酸残基67-118内所含的由氨基酸残基71-104组成的连续序列组成,其中所述变体taci多肽包含所述截短的野生型taci细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的免疫调节蛋白,其中所述截短的野生型taci细胞外结构域的长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50或51个氨基酸。4.根据实施方案1-3中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述截短的野生型taci细胞外结构域由seq id no:122中所示的氨基酸残基68-110组成。5.根据实施方案1-4中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述taci多肽由seq id no:13中所示的氨基酸序列组成,或者是其含有seq id no:13中所示的序列中的一个或多个氨基酸取代的变体。6.一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白包含至少一种taci多肽,所述taci多肽是由seq id no:13中所示的氨基酸序列组成的截短的taci多肽,或其含有seq id no:13中所示的序列中的一个或多个氨基酸取代的变体。7.根据实施方案1-5中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述截短的taci多肽或其变体与april、baff或baff/april异三聚体结合。8.根据实施方案1-7中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述taci多肽是由seq id no:1中所示的序列组成的截短的野生型taci细胞外结构域。9.根据实施方案1-7中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述taci多肽是由seq id no:13中所示的序列组成的截短的野生型taci细胞外结构域。10.一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白包含由seq id no:13中所示的序列组成的截短的taci多肽。11.根据实施方案1-7中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述taci多肽是变体taci多肽,其中与所述截短的taci多肽相比,所述变体taci多肽具有增加的与april和baff中的一种或两种的结合亲和力。12.根据实施方案1-7和11中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽包含在对应于seq id no:122中所示编号的选自74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处的一个或多个氨基酸取代。13.根据实施方案12所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代选自e74v、q75e、q75r、g76s、k77e、f78y、y79f、l82h、l82p、l83s、r84g、r84l、r84q、d85e、d85v、c86y、i87l、i87m、s88n、i92v、q95r、p97s、k98t、q99e、a101d、y102d、f103s、f103v、f103y或其保守氨基酸取代。14.根据实施方案12或实施方案13所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括e74v、k77e、y79f、l82h、l82p、r84g、r84l、r84q、d85v或c86y中的至少一个。15.根据实施方案12-13中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是d85e/k98t、i87l/k98t、l82p/i87l、g76s/p97s、k77e/r84l/f103y、y79f/q99e、l83s/f103s、k77e/r84q、k77e/a101d、k77e/f78y/y102d、q75e/r84q、q75r/r84g/i92v、k77e/a101d/y102d、r84q/s88n/a101d、r84q/f103v、k77e/q95r/a101d或i87m/a101d。16.根据实施方案12-15中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是k77e/f78y/y102d。17.根据实施方案12-15中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是q75e/r84q。
18.根据实施方案12-16中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽示于seq id no:26中。19.根据实施方案12-15和17中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽示于seq id no:27中。20.根据实施方案1所述的免疫调节蛋白,其中所述taci多肽是变体taci多肽,所述变体taci多肽包含参考taci多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代位于对应于seq id no:122中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。21.一种免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白包含至少一种变体taci多肽,其中所述至少一种变体taci多肽包含参考taci多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代位于对应于seq id no:122中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。22.根据实施方案20或实施方案21所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽是截短的多肽,所述截短的多肽由taci的细胞外结构域或其与april、baff或baff/april异三聚体结合的特异性结合部分组成。23.根据实施方案20-22中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽包含(i)seq id no:122中所示的氨基酸序列,(ii)具有与seq id no:122的至少95%序列同一性的氨基酸序列;或者(iii)(i)或(ii)的包含crd1结构域和crd2结构域中的一个或两个的部分,所述部分与april、baff或baff/april异三聚体结合。24.根据实施方案20-23中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽缺少n末端甲硫氨酸。25.根据实施方案20-24中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽包含所述crd1结构域和所述crd2结构域。26.根据实施方案20-25中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽包含seq id no:1中所示的序列。27.根据实施方案20-25中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽由seq id no:1中所示的序列组成。28.根据实施方案20-24中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽基本上由所述crd2结构域组成。29.根据实施方案20-24和28中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽包含seq id no:13中所示的序列。30.根据实施方案20-24和28中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述参考taci多肽由seq id no:13中所示的序列组成。31.根据实施方案20-30中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代选自w40r、q59r、r60g、t61p、e74v、q75e、q75r、g76s、k77e、f78y、y79f、l82h、l82p、l83s、r84g、r84l、r84q、d85e、d85v、c86y、i87l、i87m、s88n、i92v、q95r、p97s、k98t、q99e、a101d、y102d、f103s、f103v、f103y或其保守氨基酸取代。
32.根据实施方案20-31中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括e74v、k77e、y79f、l82h、l82p、r84g、r84l、r84q、d85v或c86y中的至少一个。33.根据实施方案20-32中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代k77e。34.根据实施方案20-32中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代r84g。35.根据实施方案20-32中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代r84q。36.根据实施方案20-35中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是d85e/k98t、i87l/k98t、r60g/q75e/l82p、r60g/c86y、w40r/l82p/f103y、w40r/q59r/t61p/k98t、l82p/i87l、g76s/p97s、k77e/r84l/f103y、y79f/q99e、l83s/f103s、k77e/r84q、k77e/a101d、k77e/f78y/y102d、q75e/r84q、q75r/r84g/i92v、k77e/a101d/y102d、r84q/s88n/a101d、r84q/f103v、k77e/q95r/a101d或i87m/a101d。37.根据实施方案20-32、33和36中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是k77e/f78y/y102d。38.根据实施方案20-32、35和36中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是q75e/r84q。39.根据实施方案20-38中任一项所述的免疫调节蛋白,其中与所述参考taci多肽相比,所述变体taci多肽具有增加的与april和baff中的一种或两种的结合亲和力。40.根据实施方案11或实施方案39所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽具有增加的与april的结合亲和力。41.根据实施方案11或实施方案39所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽具有增加的与baff的结合亲和力。42.根据实施方案11或实施方案39所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽具有增加的与april和baff的结合亲和力。43.根据实施方案11和39-42中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述增加的对baff或april的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。44.根据实施方案1-7和11-43中任一项所述的免疫调节蛋白,其中:所述变体taci多肽包含seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的序列;或者所述变体taci多肽包含seq id no:14-20、23-35、92-100中任一项中所示的序列。45.根据实施方案1-7和11-43中任一项所述的免疫调节蛋白,其中:所述变体taci多肽由seq id no:2-12、21、22、101-120中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成;或者所述变体taci多肽由seq id no:14-20、23-35、92-100中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。46.根据实施方案1-7、11-43和45中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽由seq id no:26中所示的序列组成或基本上由其组成。
47.根据实施方案1-7、11-43和45中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽由seq id no:27中所示的序列组成或基本上由其组成。48.根据实施方案1-7、11-43和45中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽由seq id no:107中所示的序列组成或基本上由其组成。49.根据实施方案1-7、11-43和45中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述变体taci多肽由seq id no:20中所示的序列组成或基本上由其组成。50.根据实施方案1-7和11-49中任一项所述的免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白包含与所述至少一种taci多肽连接的异源部分。51.根据实施方案50所述的免疫调节蛋白,其中所述异源部分是半衰期延长部分、多聚化结构域、与细胞表面上的分子结合的靶向部分或可检测标记。52.根据实施方案51所述的免疫调节蛋白,其中所述半衰期延长部分包括多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺素的β亚基的c末端肽(ctp)、聚乙二醇(peg)、长非结构化亲水氨基酸序列(xten)、羟乙基淀粉(hes)、白蛋白结合小分子或其组合。53.根据实施方案1-7和11-52中任一项所述的免疫调节蛋白,所述免疫调节蛋白是taci-fc融合蛋白,其中所述至少一种taci多肽与免疫球蛋白的fc区连接。54.根据实施方案3-5、7-9、11-20和22-53中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫调节蛋白是二聚体。55.根据实施方案53所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫球蛋白fc区是同二聚fc区。56.根据实施方案53所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫球蛋白fc区是异二聚fc区。57.根据实施方案3-5、7-9、11-20、22-53和54-55所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫调节蛋白是同二聚体,其中所述二聚体的每个多肽是相同的。58.根据实施方案53、54-55和57中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫球蛋白fc是igg1 fc结构域,或者是展现降低的与fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的变体fc,任选地如与野生型igg1 fc结构域相比。59.根据实施方案53、54-55和57-58中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫球蛋白fc是igg1 fc结构域,并且所述fc包含seq id no:81中所示的氨基酸序列。60.根据实施方案53、54-55和57-58中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫球蛋白fc是变体igg1 fc结构域,所述变体igg1 fc结构域包含按照eu编号选自l234a、l234v、l235a、l235e、g237a、s267k、r292c、n297g和v302c的一个或多个氨基酸取代。61.根据实施方案60所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫球蛋白fc区含有按照eu编号的氨基酸取代l234a、l235e和g237a或者按照eu编号的氨基酸取代r292c、n297g和v302c。62.根据实施方案53、54-55、57-58和60-61中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述fc是包含seq id no:73中所示的氨基酸序列的变体fc。63.根据实施方案1-62中任一项所述的免疫调节蛋白,其中:所述免疫调节蛋白阻断april、baff或april/baff异三聚体与bcma或taci的结合;
和/或所述免疫调节蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环april、baff或april/baff的水平。64.根据实施方案1-62中任一项所述的免疫调节蛋白,其中所述免疫调节蛋白降低或抑制b细胞成熟、分化和/或增殖。65.一种或多种核酸分子,所述核酸分子编码根据实施方案1-64中任一项所述的免疫调节蛋白。66.根据实施方案65所述的核酸分子,所述核酸分子是合成核酸。67.根据实施方案65或实施方案66所述的核酸分子,所述核酸分子是cdna。68.一种载体,所述载体包含根据实施方案65-67中任一项所述的核酸分子。69.根据实施方案68所述的载体,所述载体是表达载体。70.根据实施方案68或实施方案69所述的载体,其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。71.一种细胞,所述细胞包含根据实施方案65-67中任一项所述的核酸或根据实施方案68-70中任一项所述的载体。72.根据实施方案71所述的细胞,所述细胞是哺乳动物细胞。73.根据实施方案71或实施方案72所述的细胞,所述细胞是人细胞。74.一种产生免疫调节蛋白的方法,所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将根据实施方案65-67中任一项所述的核酸分子或根据实施方案68-70中任一项所述的载体引入所述细胞中。75.根据实施方案74所述的方法,所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述免疫调节蛋白。76.一种通过根据实施方案74或实施方案75所述的方法产生的免疫调节蛋白。77.一种药物组合物,所述药物组合物包含根据实施方案1-64和76中任一项所述的免疫调节蛋白。78.一种变体taci-fc融合蛋白,所述变体taci-fc融合蛋白包含变体taci多肽、fc区以及所述taci多肽与所述fc区之间的接头,其中所述变体taci多肽包含参考taci多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代,所述氨基酸取代位于对应于seq id no:122中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。79.根据实施方案78所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽是截短的多肽,所述截短的多肽由taci的细胞外结构域或其与april、baff或baff/april异三聚体结合的特异性结合部分组成。80.根据实施方案78或实施方案79所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽包含(i)seq id no:122中所示的氨基酸序列,(ii)具有与seq id no:122的至少95%序列同一性的氨基酸序列;或者(iii)(i)或(ii)的包含crd1结构域和crd2结构域中的一个或两个的部分,所述部分与april、baff或baff/april异三聚体结合。81.根据实施方案78-80中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽缺少n末端甲硫氨酸。
82.根据实施方案78-81中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽包含所述crd1结构域和所述crd2结构域。83.根据实施方案78-82中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽包含seq id no:1中所示的序列。84.根据实施方案78-82中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽由seq id no:1中所示的序列组成。85.根据实施方案78-81中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽基本上由所述crd2结构域组成。86.根据实施方案78-81和85中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽包含seq id no:13中所示的序列。87.根据实施方案78-81和85中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述参考taci多肽由seq id no:13中所示的序列组成。88.根据实施方案78-87中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代选自w40r、q59r、r60g、t61p、e74v、q75e、q75r、g76s、k77e、f78y、y79f、l82h、l82p、l83s、r84g、r84l、r84q、d85e、d85v、c86y、i87l、i87m、s88n、i92v、q95r、p97s、k98t、q99e、a101d、y102d、f103s、f103v、f103y或其保守氨基酸取代。89.根据实施方案78-88中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括e74v、k77e、y79f、l82h、l82p、r84g、r84l、r84q、d85v或c86y中的至少一个。90.根据实施方案78-89中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代k77e。91.根据实施方案78-89中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代r84g。92.根据实施方案78-92中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代r84q。93.根据实施方案78-92中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是d85e/k98t、i87l/k98t、r60g/q75e/l82p、r60g/c86y、w40r/l82p/f103y、w40r/q59r/t61p/k98t、l82p/i87l、g76s/p97s、k77e/r84l/f103y、y79f/q99e、l83s/f103s、k77e/r84q、k77e/a101d、k77e/f78y/y102d、q75e/r84q、q75r/r84g/i92v、k77e/a101d/y102d、r84q/s88n/a101d、r84q/f103v、k77e/q95r/a101d或i87m/a101d。94.根据实施方案78-90和93中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是k77e/f78y/y102d。95.根据实施方案78-90、92和93中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述一个或多个氨基酸取代是q75e/r84q。96.根据实施方案78-95中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中与所述参考taci多肽相比,所述变体taci多肽具有增加的与april和baff中的一种或两种的结合亲和力。97.根据实施方案78-96中任一项所述的变体taci-fc融合蛋白,其中所述变体taci多肽具有增加的与april的结合亲和力。
fc融合蛋白示于seq id no:168中。113.根据实施方案78-106和107-111中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:170中。114.根据实施方案78-110中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述免疫球蛋白fc是变体igg1 fc结构域,所述变体igg1 fc结构域包含按照eu编号选自l234a、l234v、l235a、l235e、g237a、s267k、r292c、n297g和v302c的一个或多个氨基酸取代。115.根据实施方案114所述的fc融合蛋白,其中所述免疫球蛋白fc区含有按照eu编号的氨基酸取代l234a、l235e和g237a或者按照eu编号的氨基酸取代r292c、n297g和v302c。116.根据实施方案78-115中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述免疫球蛋白fc示于seq id no:71中。117.根据实施方案78-113和114-116中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述fc是包含seq id no:73中所示的氨基酸序列的变体fc。118.根据实施方案78-106、107-110、114、115和117中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:167中。119.根据实施方案78-106、107-110、114、115和117中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述taci-fc融合蛋白示于seq id no:169中。120.根据实施方案78-119中任一项所述的fc融合蛋白,所述fc融合蛋白是二聚体。121.根据实施方案78-120中任一项所述的fc融合蛋白,所述fc融合蛋白是同二聚体。122.根据实施方案78-121中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述fc融合蛋白中和april和baff。123.根据实施方案122所述的fc融合蛋白,其中:中和april的ic50是小于100pm、小于50pm、小于40pm、小于30pm、小于20pm、小于10pm、小于5pm或小于1pm,或者是前述任一项之间的任何值;和/或中和baff的ic50是小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于75pm、小于50pm、小于25pm或小于10pm,或者是前述任一项之间的任何值。124.根据实施方案78-122中任一项所述的fc融合蛋白,其中:所述fc融合蛋白阻断april、baff或april/baff异三聚体与bcma或taci的结合;和/或所述fc融合蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环april、baff或april/baff的水平。125.根据实施方案78-124中任一项所述的fc融合蛋白,其中所述免疫调节蛋白降低或抑制b细胞成熟、分化和/或增殖。126.一种或多种核酸分子,所述核酸分子编码根据实施方案78-125中任一项所述的fc融合蛋白。127.根据实施方案126所述的核酸分子,所述核酸分子是合成核酸。128.根据实施方案126或实施方案127所述的核酸分子,所述核酸分子是cdna。
129.一种载体,所述载体包含根据实施方案126-128中任一项所述的核酸分子。130.根据实施方案129所述的载体,所述载体是表达载体。131.根据实施方案129或实施方案130所述的载体,其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。132.一种细胞,所述细胞包含根据实施方案126-128中任一项所述的核酸或根据实施方案129-131中任一项所述的载体。133.根据实施方案132所述的细胞,所述细胞是哺乳动物细胞。134.根据实施方案132或实施方案133所述的细胞,所述细胞是人细胞。135.一种产生fc融合蛋白的方法,所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将根据实施方案126-128中任一项所述的核酸分子或根据实施方案129-131中任一项所述的载体引入所述细胞中。136.根据实施方案135所述的方法,所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述fc融合蛋白。137.一种通过根据实施方案135或实施方案136所述的方法产生的fc融合蛋白。138.一种药物组合物,所述药物组合物包含根据实施方案78-125和137中任一项所述的fc融合蛋白。139.根据实施方案77或实施方案138所述的药物组合物,所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。140.根据实施方案77、138和139中任一项所述的药物组合物,其中所述药物组合物是无菌的。141.一种制品,所述制品包含在小瓶或容器中的根据实施方案77和138-140中任一项所述的药物组合物。142.根据实施方案141所述的制品,其中所述小瓶或容器是密封的。143.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据实施方案77和138-140中任一项所述的药物组合物和使用说明书。144.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据实施方案141或实施方案142所述的制品和使用说明书。145.一种降低受试者的免疫应答的方法,所述方法包括将根据实施方案1-64或76中任一项所述的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。146.一种降低受试者的免疫应答的方法,所述方法包括将根据实施方案78-126和137中任一项所述的fc融合蛋白施用至有需要的受试者。147.一种降低受试者的免疫应答的方法,所述方法包括将根据实施方案77和137-140中任一项所述的药物组合物施用至有需要的受试者。148.根据实施方案145-147中任一项所述的方法,其中b细胞免疫应答在所述受试者中降低,借此使b细胞成熟、分化和/或增殖降低或抑制。149.根据实施方案145-148中任一项所述的方法,其中april、baff或april/baff异三聚体的循环水平在所述受试者中降低。150.一种降低受试者的april、baff或april/baff异三聚体的循环水平的方法,所述方法包括将根据实施方案77和137-140中任一项所述的药物组合物施用至所述受试者。
151.根据实施方案57或实施方案147所述的方法,其中t细胞免疫应答在所述受试者中降低,借此使t细胞共刺激降低或抑制。152.根据实施方案145-151中任一项所述的方法,其中降低所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。153.一种治疗受试者的疾病或病症的方法,所述方法包括将根据实施方案1-64或76中任一项所述的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。154.一种治疗受试者的疾病或病症的方法,所述方法包括将根据权利要求78-115和121中任一项所述的fc融合蛋白施用至有需要的受试者。155.一种治疗受试者的疾病或病症的方法,所述方法包括将根据实施方案77和137-140中任一项所述的药物组合物施用至有需要的受试者。156.根据实施方案150-153中任一项所述的方法,其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病、b细胞癌、抗体介导的病状、肾病、移植物排斥、移植物抗宿主病或病毒感染。157.根据实施方案156所述的方法,其中所述疾病或病症是选自以下的自身免疫性疾病:系统性红斑狼疮(sle);舍格伦综合征、硬皮病、多发性硬化、糖尿病、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、iga肾病、视神经炎、淀粉样变性、抗磷脂抗体综合征(aps)、自身免疫性多内分泌腺综合征ii型(aps ii)、自身免疫性甲状腺疾病(aitd)、格雷夫斯病、自身免疫性肾上腺炎和寻常型天疱疮。158.根据实施方案156所述的方法,其中所述疾病或病症是b细胞癌并且所述癌症是骨髓瘤。ix.实施例
[0396]
以下实施例仅出于说明性目的而被包括,并且不意图限制本发明的范围。实施例1.亲和力修饰的taci的鉴定
[0397]
此实施例描述生成人taci tnfr结构域(td)的突变体dna构建体,用于在作为酵母展示文库的酵母的表面上翻译和表达、将dna文库引入酵母中以及选择表达含有至少一个td的taci的细胞外结构域(ecd)的亲和力修饰的变体(taci vtd)的酵母细胞。然后将选择的taci vtd格式化为fc融合蛋白。a.taci tnfr结构域的突变体dna构建体的生成
[0398]
构建含有随机氨基酸取代的文库以鉴定taci的细胞外结构域(ecd)的变体。基于含有taci的ecd部分的野生型人taci序列来生成构建体,所述ecd部分包括(1)如seq id no:1中所示的两个富半胱氨酸蛋白质结构域(crd,crd1/crd2)(对应于如uniprot登录号o14836中所示的残基29-110),或者(2)仅如seq id no:13中所示的单一crd(crd2)(对应于如uniprot登录号o14836中所示的残基68-110)。taci ecd(29-110)(seq id no:1):vamrscpeeqywdpllgtcmsckticnhqsqrtcaafcrslscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrstaci ecd(68-110)(seq id no:13):slscrkeqgkfydhllrdciscasicgqhpkqcayfcenklrs
[0399]
将编码野生型taci ecd结构域的dna克隆于修饰的酵母表达载体pbyds03(life technologies,美国)的bamhi与kpni位点之间,其将taci ecd置于酵母表面锚定结构域
sag1(酵母α-凝集素的c末端结构域)的n末端,其具有位于所述taci ecd序列的n末端的框内ha融合标签以及位于所述taci ecd序列的c末端的c-myc融合标签。通过诱导性gal1启动子来控制该载体中的表达。在验证正确的dna序列后,使用野生型taci ecd dna构建体作为模板进行易错pcr,以横跨taci ecd序列以每个基因拷贝2-5个突变的频率引入随机突变。与0.0至0.6mm的递增量的mncl2组合使用genemorph ii试剂盒(agilent,美国)来实现所需错误率。在易错pcr后,使用凝胶和pcr提纯试剂盒(macherey-nagel,德国)对诱变的dna进行凝胶纯化。然后使用含有与pbyds03同源的48bp重叠区的引物以onetaq 2x pcr主混合物(new england biolabs,美国)对该分离的dna片段进行pcr扩增,用于准备大规模酵母电穿孔。将taci ecd dna插入物凝胶纯化并以500ng/μl的标称浓度重悬于无菌去离子水中。
[0400]
为了制备用于转化的载体,将pbyds03用bamhi-hf和kpni-hf限制性酶(new england biolabs,美国)消化,并且将大的载体片段(预期大小:7671bp)凝胶纯化并以500ng/μl的标称浓度溶解于无菌去离子水中。为了准备酵母转化,对于每一电穿孔,将12μg的文库dna插入物与4μg的线性化载体混合。
[0401]
为了将随机dna文库引入酵母中,紧接在电穿孔之前准备酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株bj5464(atcc.org;atcc编号208288),如benatuil,l.等人,protein eng des sel.2010年4月;23(4):155-159中所详述。简言之,将bj5464的过夜固定相培养物在100ml ypd培养基(10g/l酵母氮源、20g/l蛋白胨和20g/l d-(+)-葡萄糖)中传代至od
600 0.3,并且将其置于30℃和300rpm的平台振荡器中直至接种的培养物达到od
600 1.6。在约5小时后,通过离心收获细胞并在方案的剩余时间中保持在冰上,除非另外陈述。在收获后,将细胞用50ml冰冷水洗涤两次,并用电穿孔缓冲液(1m山梨醇、1mm cacl2)洗涤一次。通过以下方式将收集的细胞条件化:重悬于20ml 0.1m liac/10mm dtt中并以225rpm在培养瓶中在30℃下振荡30分钟。立即将条件化的细胞离心,用电穿孔缓冲液洗涤两次,并且用约100-200μl的电穿孔缓冲液重悬以使体积达到1ml。此条件化的细胞悬浮液足以在400μl比色皿中进行两次电穿孔反应。
[0402]
对于每次电穿孔,将12μg的文库dna插入物和4μg的线性化pbyds03载体(上文所述)与400μl的电感受态bj5464混合,并转移至具有2mm电极间隙的预冷的biorad genepulser比色皿中。将混合物在冰上保持5分钟,之后使用btx ecm399指数衰减波电穿孔系统在2500v下进行电穿孔。紧接在电穿孔之后,将细胞添加至8ml的1m山梨醇:1xypd的1:1混合物,并在室温下无振荡静置10min,然后将其置于平台振荡器上在225rpm和30℃下持续1h。通过离心收集细胞并重悬于250ml scd-leu培养基中以适应由修饰的质粒pbyds03携带的leu2选择性标记。生成一升scd-leu培养基,其具有14.7gm柠檬酸钠、4.29gm柠檬酸一水合物、20gm右旋糖、6.7gm酵母氮源和1.6gm不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂。在使用前使用0.22μm真空过滤器装置将培养基过滤灭菌。通过以下方式来估计文库大小:在scd-leu琼脂板上在10-5
至10-10
的稀释范围内对刚回收的细胞进行点样连续稀释,并且在三天后通过计数菌落进行外推。使电穿孔培养物的其余部分生长至饱和,并且将来自此培养的细胞再一次1/100继代培养至相同培养基中并生长至饱和,以使未转化细胞的级分降至最低并允许从可能含有两个或更多个文库变体的细胞分离质粒。为了维持文库多样性,使用所含细胞比计算的文库大小多至少10倍的接种物进行此继代培养步骤。将来自第二饱和
assembly主混合物(new england biolabs)进行体外重组。按照制造商的说明,将gibson assembly反应物添加至大肠杆菌菌株neb5α(new england biolabs,美国)中用于热激转化。
[0408]
将转化反应物的稀释液铺板在含有100μg/ml羧苄西林(teknova,美国)的lb琼脂上以分离单一菌落用于选择。通常,然后使来自每次转化的多达96个菌落在96孔板中在37℃下在含有100μg/ml羧苄西林的lb肉汤(teknova目录号l8112)中过夜生长至饱和,并且将来自每个孔的小等分试样提交用于dna测序,以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。
[0409]
在对目标克隆进行序列分析和鉴定后,使用midiplus试剂盒(qiagen)制备质粒dna。
[0410]
重组变体fc融合蛋白是使用expi293表达系统(invitrogen,美国)从悬浮适应的人胚肾(hek)293细胞产生。收获上清液并将fc蛋白捕获于mab selectsure(ge healthcare目录号17543801)上。使用50mm乙酸盐(ph 3.6)从柱中洗脱蛋白质。合并mabselect sure洗脱液,并将ph调整至高于ph 5.0。然后在制备型sec柱上精制此材料,以产生高度纯化的单体材料。将此材料缓冲液交换至10mm乙酸盐、9%蔗糖(ph 5.0)中。通过分析型sec评估蛋白质纯度。将材料装入小瓶并储存在-80下。
[0411]
通过所述选择鉴定并生成的选择的taci vtd中的氨基酸取代示于表1中。如实施例2中所述来测试格式化为fc融合蛋白的选择的vtd的结合和功能活性。实施例2.fc融合蛋白的活性的评估.
[0412]
此实施例描述使用基于细胞系的体外生物测定对格式化为fc融合物的含有taci结构域的分子(如可溶野生型(wt)或变体taci vtd)的活性的表征。
[0413]
具有激活的b细胞的核因子κ轻链增强子(nf-κb)基于萤光素酶的报告物的jurkat细胞是购得的(bps bioscience)。用慢病毒转导jurkat/nk-κb细胞以产生小鼠taci的稳定细胞表面表达(jurkat/nf-κb/taci)。表达小鼠taci的细胞对人和小鼠april或baff二者都有反应。在重组人或小鼠april或baff与taci结合后,jurkat细胞中的内源nk-κb转录因子与控制萤火虫萤光素酶基因转录的dna应答元件结合。通过添加含有萤光素的底物对萤光素酶产生进行定量,所述底物在氧化时发出可以使用酶标仪测量的光。jurkat/nf-κb/taci测定的示意图显示于图1中。
[0414]
重组人和小鼠april和baff配体是购得的:人april(tonbo biosciences);人baff(biolegend);小鼠april(prosci incorporated);以及小鼠baff(r&d systems)。
[0415]
为了确定含有taci wt或vtd结构域的分子的生物活性,将30μl不同浓度(范围为1-10nm)的重组人或小鼠april或baff与30μl固定的或递增的(范围为40nm-66pm)含有taci结构域的分子一起孵育。将配体和可溶受体在振荡和室温(rt)下孵育20分钟。将50μl转移至含有1.5x105个jurkat/nf-κb/taci细胞/孔的96孔白色平底板中的50μl培养基(rpmi1640+5%胎牛血清[fbs])中。将孔混合并将板在37摄氏度(c)下在加湿的5%co2孵育室中孵育5小时。将板从孵育器取出并将100μl细胞溶解和萤光素酶底物溶液(bio-glo
tm
萤光素酶测定系统,promega)添加至每孔,并将所述板在定轨振荡器上孵育10分钟。通过使用cytation 3(biotek instruments)成像读取仪以1秒/孔积分时间测量发光来确定每个测试样品的相对发光值(rlu)。在taci wt或vtd存在下相对于对照蛋白减小的rlu表示在jurkat/nf-κb/taci细胞中对经由转导的taci受体的配体信号传导的阻断和抑制。
[0416]
如图2中所示,示例性taci-fc vtd分别以等于或高于含有wt taci结构域的fc融合蛋白的水平抑制配体信号传导。实施例3.含有taci的分子对taci介导的刺激的taci阻断的生物活性评估.
[0417]
使用实施例2中所述的基于细胞系的生物测定来评估含有taci的wt或vtd蛋白用于阻断jurkat/nf-κb/taci细胞中april或baff介导的经由taci受体的配体信号传导的功能表征。通过监测细胞中的萤光素酶产生,对april或baff介导的配体信号传导进行定量。评估含有seq id no:26中所示的vtd的taci-fc融合物的结合(26 taci crd2-fc)。对于比较,还评估仅含taci的crd2结构域的wt taci-fc(13 taci crd2-fc)。
[0418]
如图3中所示,示例性taci vtd显示增加的对人april和baff二者的抑制。如图4中所示,示例性taci vtd-fc分子抑制小鼠april和baff配体信号传导。总之,结果显示taci vtd分子阻断april和baff taci介导的配体信号传导的能力。
[0419]
在另一项类似研究中,评估如实施例1中所述的示例性生成的分子阻断jurkat/nf-κb/taci细胞中april或baff介导的配体信号传导的能力。对于比较,生成含有与seq id no:73中所示的fc序列融合的野生型taci ecd的对照分子。在一种对照中,融合蛋白含有wt taci(taci 30-110,seq id no:130;对应于阿塞西普中的taci ecd部分,seq id no:132)。在另一种对照中,融合蛋白含有wt taci(taci 13-118,seq id no:131,对应于泰它西普中的taci ecd部分)。将活性与对照分子相比较。还将活性与抗baff单克隆抗体贝利木单抗相比较。
[0420]
将示例性taci分子(wt或变体taci vtd)逐步增加(在100,000pm-32pm之间),将其添加至2nm重组人april或baff并如上文针对jurkat/nf-κb测定所述进行测定。如图5中所示,含有taci vtd的示例性分子展现大于taci 30-100-fc、taci 13-118-fc和贝利木单抗的增强的april和baff阻断。仅含taci的crd2结构域的wt taci-fc(13taci crd2-fc)也展现大于taci 30-100-fc和taci 13-118-fc的增强的april阻断。
[0421]
这些结果与如下发现一致:与还含有如存在于阿塞西普和泰它西普中的crd1结构域的部分的taci ecd分子相比,最小crd2结构域(含有氨基酸残基68-110)展现改进的april阻断。表e1提供图5中所述的示例性分子抑制april和baff介导的taci信号传导的半最大抑制浓度(ic50)的值。括号中还显示每种测试分子与阿塞西普相比的相对阻断(δ阿塞西普)。实施例4.在体内小鼠狼疮模型中对taci vtd-fc的活性的评估.
[0422]
此实施例描述在体内鼠(nzb/nzw)f1自发狼疮模型中对示例性taci vtd-fc分子影响免疫应答的评估。(nzbxnzw)f1小鼠自发患上与人sle非常相似的自身免疫性疾病,并且被视为该疾病的最佳小鼠模型之一。(nzb/nzw)f1小鼠在约20周龄开始具有高循环浓度
的抗dsdna抗体,且在约23周龄可检测到疾病的最初临床体征。所述小鼠患上通过肾小球基膜中的免疫复合物沉积介导的溶血性贫血、蛋白尿和进行性肾小球肾炎。
[0423]
每周两次经由腹膜内(ip)注射用14mg/kg fc对照或摩尔匹配量的taci vtd-fc(26taci crd2-fc)(17mg/kg)对(nzb/nzw)f1小鼠进行给药。治疗在组分配(第22周龄)时开始,并且继续至研究结束。研究在小鼠达到第43周龄时结束,但是在一些动物垂死时在研究中较早将其安乐死。
[0424]
在20与40周龄之间的不同时间点,收集尿液和血清样品。当小鼠为20周龄时开始,每周用尿液分析测试条(roche chemstrip 2gp,目录号11895397160)确定研究中所有小鼠的尿液中的蛋白质浓度。每个治疗组中随时间变化的平均蛋白尿得分呈现于图6a中,并且每组中体重的平均变化百分比(体重减轻与进行性疾病相关)绘图于图6b中。每个治疗组中小鼠的存活率百分比绘图于图6c中。抗双链(ds)dna igg血清滴度由hooke laboratories,inc.(劳伦斯,马萨诸塞州)使用其内部试剂盒测量,并且结果呈现于图6d中。在患有进行性疾病的这些小鼠中,血尿素氮(bun)水平增加。在终止研究时(或在提前死亡的小鼠死亡时),每个治疗组的bun水平显示于图6e中。使用student's t检验进行统计学分析;****表示p《0.0001并且***表示p=0.0008。
[0425]
在终止时从每只小鼠收集肾并在重复过碘酸希夫(pas)染色切片中使用alperovich g等人,2007.lupus 16:18-24中所述的标准进行组织学分析。由不了解治疗和临床得分的病理学家对所有肾切片进行盲分析。使用0至3的评分系统对肾小球病变(系膜扩张、毛细管内增生、肾小球沉积和毛细管外增生)和肾小管/间质病变(间质浸润、肾小管萎缩和间质纤维化)进行半定量的分析和分级,其中0=无变化,1=轻度变化,2=中度变化,且3=重度变化。将每只小鼠的总组织学得分计算为单独得分之和(最大总分为21)。总肾小球病变、总肾小管和间质病变以及总肾病变的肾得分显示于图6f中;如与fc对照治疗的小鼠相比,在用taci vtd-fc治疗的动物中观察到显著改进的肾组织病理学(相比于fc组,p《0.0001)。
[0426]
对于图6g-图6i,在研究终止时从每只小鼠收集右肾,称重,横向解剖,并在单一最适切割温度化合物(oct)块中冷冻,之后切片并进行小鼠igg和小鼠补体c3的免疫组织化学(ihc)染色,以分别评估肾小球igg和c3沉积。将肾切片用丙酮进行渗透化处理并用以下进行染色:以1:25稀释于初级抗体稀释剂(leica biosystems)中的fitc缀合的大鼠单克隆抗小鼠补体成分c3(cedarlane),或者以1:200稀释于初级抗体稀释剂中的af594缀合的山羊抗小鼠igg(thermo fisher scientific)。由病理学家基于kelkka等人(2014)antioxid redox signal.21:2231-45中所述的方法使用0至4的半定量评分系统来分析igg和c3的肾小球沉积,其中0=无沉积,1=轻度系膜沉积,2=明显系膜沉积,3=系膜和轻微毛细管沉积,且4=重度系膜和系膜毛细管沉积。如与fc对照治疗的小鼠相比,在用26taci crd2-fc治疗的动物中观察到显著减少的肾小球igg和c3(对于igg,相比于fc对照组,p《0.0001;并且对于c3,p=0.0005);使用student's t检验分析数据中的统计学上显著的差异。
[0427]
结果证实,在(nzb/nzw)f1小鼠sle模型中,taci vtd-fc能够显著抑制蛋白尿,保持体重,增强总体存活,减少抗dsdna自身抗体和bun,减少igg和c3肾沉积,并预防或改进肾病。示例性分子也能够有效减少这些小鼠的脾和淋巴结中的b细胞和t细胞子集,包括浆细胞、滤泡t辅助细胞、生发中心细胞和记忆t细胞(数据未显示)。
实施例5:在添加鉴定的突变的情况下对taci 13-118-fc的活性的评估
[0428]
评估实施例1中鉴定的taci突变(参见表1)的影响以确定它们调节含有更长taci ecd序列(含有crd1和crd2结构域二者)的fc融合蛋白的活性的能力。在此实施例中,将示例性突变k77e、f78y和y102d引入参考taci ecd 13-118中,其与seq id no:73中所示的示例性fc序列融合。将活性与仅含具有相同突变的crd2结构域(seq id no:26中所示)的taci vtd-fc融合蛋白或者与wt taci(30-110,seq id no:130;对应于阿塞西普中的taci ecd部分,seq id no:132)相比较,它们各自也与seq id no:73中所示的fc序列融合。使用实施例2中描述的基于细胞系的生物测定来评估对jurkat/nf-κb/taci细胞中april或baff介导的经由taci受体的配体信号传导的阻断。通过监测细胞中的萤光素酶产生对april或baff介导的经由taci受体的配体信号传导进行定量。
[0429]
如图7中所示,相对于相应wt taci 13-118ecd(菱形)或替代性ecd对照wt taci 30-110(上三角),将k77e、f78y和y102d突变引入taci 13-118ecd中以生成变体(k77e/f78y/t102d)taci 13-118改进april和baff阻断(分别地)。然而,即使将所述突变掺入taci 13-118ecd中,具有相同突变但仅含taci的crd2结构域(seq id no:26中所示的vtd)的更短的变体taci在此测定中展现最大的april和baff阻断(下三角)。这些结果确认,最小的含有crd2的结构域赋予阻断april和baff介导的taci信号传导的改进的活性,然而,突变k77e/f78y/y102d也进一步增强掺入所述突变的变体taci ecd的april和baff阻断。
[0430]
表e2提供图7中所述的示例性分子抑制april和baff介导的taci信号传导的半最大抑制浓度(ic50)的值。还显示每种分子与wt taci-fc对照(δ阿塞西普)的比较。实施例6:在体内klh免疫模型中对taci vtd-fc的比较性评价
[0431]
此实施例描述对示例性测试的单一结构域fc融合蛋白(实施例1中所述)影响小鼠体内对钥孔血蓝蛋白(klh)的免疫应答的评估。可以使用小鼠klh免疫模型来评价在klh的一次或两次注射后,免疫调节分子对针对t细胞依赖性抗原klh的抗原特异性应答的作用。klh的两次注射(每次相隔至少7天)提供如下模型,所述模型可以评价第1次klh注射后的初级免疫应答和第2次注射后的时间段中的次级免疫应答二者。此实施例描述一项研究,所述研究评价多种含有taci单一结构域的分子(如格式化为fc融合物的可溶野生型(wt)或变体taci vtd)在没有佐剂的情况下响应klh的两次注射(在研究第0天和第12天)的活性。将这些测试品与施用摩尔匹配水平的fc同种型对照蛋白相比较。在小鼠klh模型中观察到的测试品的活性通常可以预测所述测试品在人体中的免疫调节作用。
[0432]
为了开始klh研究,将10周龄雌性c57/bl6nj小鼠(the jackson laboratories,萨克拉门托,加利福尼亚州)随机化为12个组,每组5只小鼠。在第0天和第12天经由腹膜内(ip)注射向小鼠施用0.25mg klh(emd millipore,目录号374825-25mg);在注射前将klh的原始商业原液用杜氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)稀释至适当浓度。如表e3中所概述经由ip注射
用测试品对小鼠给药(在第4天和第11天给药)。六只小鼠保持不治疗/不注射作为初试对照(第13组)。在第5天(第1剂量后24h)、第12天(第2剂量后/klh加强前24h)和第20天手机血清以评价药物暴露、ada和/或抗klh抗体水平。第10组中的一只动物接受不完整剂量的测试品,并因此将其从研究去除。n/a=不适用
[0433]
在第20天,将所有小鼠用异氟醚麻醉并将血液收集至血清分离器管中。处死小鼠,并取出它们的脾,称重并置入冰上的dpbs中。对全血进行离心,取出血清并储存于-80℃下直至通过酶联免疫吸附测定(elisa)针对抗klh水平进行分析。将脾处理为单细胞悬浮液,根据制造商的说明书使用rbc溶解缓冲液(biolegend,目录号420301)溶解红细胞(rbc),并且使用双重荧光活性,使用吖啶橙/碘化丙啶(ao/pi)染色(nexcelom,目录号cs2-0106-5ml)计数每个样品中的细胞。
[0434]
然后使用以下方法将每个脾样品染色用于免疫细胞子集的流式细胞术分析:将1x106个活细胞置入两个96孔板的孔中(corning,目录号3797;一个板用于b细胞特异性组并且一个板用于t细胞特异性组),以1500x g离心10秒,去除上清液,并将细胞沉淀用dpbs洗涤两次。将沉淀重悬于100μl live-dead染色剂(live/dead可固定浅绿色死细胞染色试剂盒,life technologies corp.,1:1000稀释于dpbs中)中并在暗中在室温下孵育10min。在用流式细胞术缓冲液洗涤两次(每次175μl)后,将肿瘤沉淀重悬于mouse bd fc block(用流动缓冲液以1:50稀释)中,并在暗中在rt下再孵育5min。在不再进行任何洗涤的情况下,将50μl的以下流式细胞术抗体的混合剂(稀释于流式细胞术缓冲液中)添加至b细胞组或t细胞组的每个细胞孔中。对于b细胞组,将以下抗体组合用于混合剂:抗小鼠cd19 buv395(克隆1d3,becton-dickinson;1:100)、抗小鼠cd138 bv421(克隆281-2,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd3εbv510(克隆17a2,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠igd bv605(克隆11-26c.2a,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠b220 bv785(克隆ra3-6b2,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd95 fitc(克隆sa367h8,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd23 percp cy5.5(克隆b3b4,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠gl7 pe(克隆gl7,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠gr1 pe cy7(克隆rb6-8c5,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd21 apc(克隆7e9,biolegend inc.;1:100,终浓度)以及抗小鼠igm apc cy7(克隆rmm-1,biolegend inc.;1:100,终浓度)。对于t细胞组,将以下抗体组合用于混合剂:抗小鼠pd-1bv421(克隆29f.1a12,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd11b bv510(克隆m1/70,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠
cd3εbv605(克隆145-2c11,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd8 bv785(克隆53-6.7,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd44 fitc(克隆im7,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd4 percp cy5.5(克隆gk1.5,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd62l pe(克隆mel-14,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cxcr5 pe dazzle(克隆l138d7,biolegend inc.;1:100,终浓度)、抗小鼠cd25 pe cy7(克隆pc61.5,biolegend inc.;1:100,终浓度)以及抗小鼠cd45 af700(克隆30-f11,biolegend inc.;1:100,终浓度)。将所述细胞与抗体混合剂中的一种在暗中在冰上在温和混合下一起孵育45min,之后用流式细胞术缓冲液洗涤两次(每次洗涤175μl)。将细胞沉淀重悬于200μl流式细胞术缓冲液中并收集于lsrii流式细胞仪上。使用flowjo软件10.2版(flowjo llc,美国)分析数据,并使用graphpad prism软件(8.1.2版)图形化。关键细胞子集分析包括:总b细胞(b220
+
细胞)、边缘区(mz)b细胞(b220
+
、cd19
+
、cd23-、cd21

、igm

细胞)、生发中心(gc)b细胞(b220
+
、cd19
+
、gl7
+
、cd95
+
细胞)、t滤泡辅助(tfh)细胞(cd45
+
、cd3
+
、cd4
+
、pd-1
+
、cd185
+
细胞)、cd4
+
t效应记忆(t
em
)细胞(cd45
+
、cd3
+
、cd4
+
、cd44
+
、cd62l-细胞)以及cd8
+
t
em
细胞(cd45
+
、cd3
+
、cd8
+
、cd44
+
、cd62l-细胞)。
[0435]
通过单因素方差分析(anova)和未校正的fisher最小显著差异(lsd)多重比较检验使用graphpad prism软件(8.1.2版)来确定组间的统计学上显著的差异(p《0.05)。
[0436]
为了确定与fc同种型对照(seq id no:73)相比,测试品抑制klh介导的抗体免疫应答的程度,在两个elisa测定中评价血清样品中抗klh抗体的浓度。elisa测定测量血清中的igm特异性或igg1特异性抗klh水平。将多种稀释度的小鼠血清样品在涂布有klh的板中孵育,之后洗涤并用1:2000山羊抗小鼠igg1:hrp或1:5000山羊抗小鼠igm:hrp进行检测。使用tmb底物试剂盒(seracare)实现显色,并且在酶标仪(id3酶标仪,molecular devices llc)上分析elisa板。所述测定不存在标准曲线,因此使用光学密度(od)来比较抗klh抗体的水平;od越高,血清样品中抗klh抗体的水平越高。对于抗klh igm od水平,数据呈现于图10a(初次应答)、图10b(再次应答)中,并且通过单因素anova和未校正的fisher's lsd多重比较检验进行的统计学分析分别呈现于表e4和表e5中。抗klh igg1 od水平呈现于图10c(初次应答)、图10d(再次应答)中,并且通过单因素anova和未校正的fisher's lsd多重比较检验进行的统计学分析呈现于表e6和表e7中。结果证实,在初次免疫应答期间,与fc对照治疗相比,每种测试品能够显著降低血清中的抗klh igm水平,其中在所有测试品中,29taci-crd2-fc(seq id no:29)显示最大降低,并且taci 30-110-fc和taci 13-118-fc治疗具有最小作用(图10a)。对于第20天的再次应答,在第2剂和最后一剂测试品后9天测量,除了taci 13-118-fc外的所有测试品都诱导抗klh igm水平的显著降低,其中除了taci 30-110-fc、taci 13-118-fc外的所有测试品都显示降低(图10b)。在初次免疫应答期间,与fc对照相比,每种测试品还能够显著降低抗klh igg1水平,其中除了taci 30-110-fc、taci 13-118-fc的所有测试品仍显示最大降低(图10c)。对于针对klh的再次应答,除了taci 30-110-fc、taci 13-118-fc外的所有测试品显著降低抗klh igg1的水平(图10d)。这些结果表明,在此小鼠免疫模型中,在降低对klh的t细胞依赖性抗体免疫应答方面,大多数含有taci vtd的分子是有效的,其中26taci crd2-fc、27taci crd2-fc和29taci crd2-fc展现最显著的作用。
[0437]
如图11a和图11b中所示,在研究结束时(第20天),与fc对照治疗的小鼠相比,用除了taci 30-110-fc或taci 13-118-fc外的所有测试品治疗的小鼠具有显著更小的脾,如分别依据重量和细胞数量所评估(表e8)。用每种测试品治疗的小鼠还具有与fc对照组相比显著更少的脾细胞。更小的脾指示淋巴细胞的减少,这可能对与加强的免疫应答相关的自身免疫性和炎性疾病(特别是由b细胞和/或t细胞驱动的那些)的发病机制具有免疫调节作用。脾重量和总细胞数量的统计学分析分别显示于表e8和表e9中。
[0438]
对自身免疫性和炎性疾病的发病机制特别重要的是促进b细胞存活和分化、抗体产生和t细胞效应记忆的细胞类型。这些细胞类型包括但不限于以下:总b细胞、边缘区(mz)b细胞、生发中心(gc)b细胞、t滤泡辅助(tfh)细胞以及cd4
+
和cd8
+
t效应记忆(t
em
)细胞。可预期作用机制包括减少这些细胞类型的治疗药在多种自身抗体介导的疾病的治疗中有效。与其余治疗组相比,用任何taci vtd-fc测试品治疗显著减少多个脾b细胞子集的数量,包括对以下的影响:过渡-2(b220
+
cd19
+
cd23
+
cd21

igm

)、滤泡(b220
+
cd19
+
cd23
+
cd21
+
igm
+
)、边缘区(b220
+
cd19
+
cd23
neg cd21

igm

)、生发中心(b220
+
cd19
+
gl7
+
cd95
+
)以及浆细胞(b220

cd19
+
cd138

)(图12和图13)。在减少在b细胞存活和分化和抗体产生中重要的这些群体的百分比(未显示)或数量的能力方面,这些taci vtd-分子与两种wt taci-fc分子(taci 13-188-fc和taci 30-110-fc)同样有效或比所述两种wt taci-fc分子更有效。来自第20天脾细胞的流式细胞术数据的统计学分析显示于表e10-表e28中。
[0439]
与fc对照组相比,脾cd3+、cd4+或cd8+t细胞群体在很大程度上不受6种含有taci vtd的测试品的影响(图14a-图14c),并且与fc对照组相比,tcm和tem记忆t细胞不受影响(图15)。如与fc对照相比,所有测试品都减少滤泡辅助t细胞(cd45
+
、cd3
+
、cd4
+
、pd-1
+
、cd185
+
)的数量,所述滤泡辅助t细胞与生发中心中的b细胞相互作用并且是t细胞依赖性抗体应答的重要贡献者(图14d)。
[0440]
总之,这些结果表明,抑制b细胞和/或t细胞活性的含有taci vtd的单一结构域fc融合分子可以减小由t细胞依赖性抗原klh在体内介导的免疫应答和细胞子集变化(即血清中的抗klh水平和免疫细胞子集的变化)。这些结果与单一taci结构域b细胞抑制分子作为临床治疗药在过度活跃的淋巴细胞起作用的自身免疫性和炎性疾病的治疗中的评价一致。实施例7.含有taci的分子对taci介导的刺激的taci阻断的生物活性评估
[0441]
生成另外的taci vtd,其含有seq id no:26(k77e、f78y、y102d)、seq id no:27(q75e、r84q)或seq id no:29(k77e、a101d、y102d)中所示的示例性taci vtd中存在的一个或多个突变。生成来自q75e、k77e、f78y、r84q、a101d和y102d的突变的含有单一突变、双突变和三突变的组合。将所得taci vtd进一步格式化为具有fc结构域的taci vtd-fc融合蛋白。基本上如实施例1中所述生成示例性生成的fc融合蛋白。简言之,为了生成作为fc融合蛋白的重组免疫调节蛋白,生成编码dna以编码如下蛋白质:变体taci结构域,之后是7个氨基酸的接头(gsggggs;seq id no:74),之后是按照用于免疫球蛋白蛋白质(seq id no:73)的eu索引编号系统含有突变l234a、l235e和g237a的人igg1无效应子fc序列。对于比较,还测试以下分子:(1)wt taci(68-110)-fc(taci 68-110,seq id no:13,taci-fc seq id no:171);以及(2)具有引入参考taci ecd 13-118中的示例性突变k77e、f78y和y102d的taci-fc,其与seq id no:73中所示的示例性fc序列融合;参见实施例5。另外的对照包括:(3)wt taci(13-118)-fc(taci 13-118,seq id no:131;对应于泰它西普中的taci ecd部分);(4)wt taci(30-110)-fc(taci 30-110,seq id no:130;对应于阿塞西普中的taci ecd部分,seq id no:132);(5)baff-r ecd以及(6)贝利木单抗。
[0442]
基本上如实施例2中所述来评估所生成的分子对jurkat/nf-κb/taci细胞中april或baff介导的经由taci受体的配体信号传导的阻断。示例性taci vtd-fc分子从100,000-6pm递增,并且与30nm人april或10nm人baff混合,30分钟后添加jurkat/nf-kb/taci细胞。通过监测细胞中的萤光素酶产生,对april或baff介导的配体信号传导进行定量。
[0443]
结果作为示例性测试的分子的半最大抑制浓度(ic50)总结于表e29中。ic50与参考对照wt taci(68-110)-fc(taci 68-110,seq id no:13,taci-fc seq id no:171)相比的变化百分比示于括号中(δwt)。与上文描绘的结果类似,与其他测试的对照分子(包括具
有与泰它西普和阿塞西普类似的序列的那些)相比,野生型最小crd2 wt taci(68-110)-fc展现更优的april和baff阻断。如所指示,某些突变和突变组合与阻断april或baff介导的配体信号传导的能力的进一步显著增加相关。总之,结果显示taci vtd分子阻断april和baff taci介导的配体信号传导的能力。实施例8.在非肥胖糖尿病小鼠的舍格伦综合征模型中的评价
[0444]
此实施例描述在nod小鼠的体内短期舍格伦综合征模型中对示例性单一结构域26-taci-vtd fc融合蛋白(taci vtd seq id no:26;fc融合物seq id no:167)的评估,包括对涎腺炎、测试分子的血清水平和胰岛炎的评估。
[0445]
舍格伦综合征模型是在雌性易患糖尿病的nod/shiltj小鼠(约6周龄)中通过抗mpd-l1抗体的重复给药来诱导的。具体而言,在第0天、第2天、第4天和第6天通过腹膜内注射施用0.1mg抗mpd-l1抗体。在第0天、第2天和第4天根据下表e30给予测试分子融合蛋白。缩写:ip=腹膜内(地);mg=毫克;n/a=不适用
[0446]
在第7天、第8天、第9天和第10天从小鼠尾静脉获得血液(2-5μl),将其置于relion prime血糖测试条上,并使用relion prime血糖测试系统测量血糖(mg/dl)。在实验第10天,处死小鼠并且收集和分析血清、下颌下腺(smg)和胰腺。
[0447]
取出左smg和胰腺,从相邻淋巴结解剖分离,并将其置入中性缓冲福尔马林(nbf)中持续约72小时,之后将其转移至70%乙醇中。将固定的组织包埋于石蜡中,切片,并在载玻片上用苏木精和伊红(h&e)染色。
[0448]
用于评价涎腺炎程度的评分系统是根据nandula等人2011(其中的表6;再现为表e31)来评分,并且对于胰岛炎是根据gutierrez等人2014(其中的表7;再现为表e32)来评分。分。
[0449]
使用student's t检验来确定组织学得分在组间的统计学显著的差异。使用graphpad软件(8.1.2版)进行统计学分析,并且对于所有统计学检验,将p值《0.05视为统计学显著的。
[0450]
使用示例性26-taci-crd2 fc融合蛋白的治疗降低涎腺炎的发病率(图16a)并得到比fc对照的平均得分显著更低的组织学得分(p《0.01)(图16b)。这些结果与如下发现一致:在此舍格伦综合征模型中,用测试分子对注射抗pd-l1的nod小鼠的治疗降低涎腺炎的发病率和严重性二者。
no:202):wt taci结构域seq id no:13,之后是接头gsggggs seq id no:74;之后是按照用于免疫球蛋白蛋白质(seq id no:73)的eu索引编号系统含有突变l234a、l235e和g237a的人igg1无效应子fc序列,之后是接头(g4s)4seq id no:84,之后是wt taci结构域seq id no:13。
[0458]
在一种格式中,生成编码dna以编码如下三种不同的蛋白质形式:taci vtd杠铃(seq id no:201):seq id no:26中所示的taci vtd,之后是接头gsggggs seq id no:74;之后是按照用于免疫球蛋白蛋白质(seq id no:73)的eu索引编号系统含有突变l234a、l235e和g237a的人igg1无效应子fc序列,之后是接头(g4s)4seq id no:84,之后是seq id no:26中所示的taci vtd。vtd。a.示例性多结构域分子的生物活性
[0459]
在一项实验中,基本上如实施例1中所述,使用jurkat/nf-κb/taci报告细胞来评估表e33a-表e33c中所示的示例性分子对april或baff介导的信号传导的阻断。针对对可溶baff(3聚体)的抑制或针对对二十个baff 3聚体的寡聚物(baff 60聚体)的抑制来评估活性。表e34提供抑制april和baff介导的taci信号传导的半最大抑制浓度(ic50)的值。在一些情况下,不将所测试的蛋白质与其亲代wt对照作比较,并且在下表中表示为(-)。表e34中的结果证实,所有生成的格式都阻断baff和april结合。
[0460]
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围,所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授,对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化,并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
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