用于多肽处理和分析的方法、系统和试剂盒

背景技术：

1、由于遗传变异经常不会表现在可检测的或直接的表型变化中，因此蛋白质组学对于理解生物体和系统水平的生物学和生物化学可能是必不可少的。蛋白质组学已应用于多种临床和生化兴趣领域，包括宽范围的疾病的发病机制、发展、预防和治疗。蛋白鉴定和更广规模的蛋白质组学分析对于药物开发、蛋白发现、生物询问和分类学分类至关重要。但是，许多传统形式的蛋白质组学分析都存在灵敏度低或通量低的问题。例如，组织学经常为鉴定特定蛋白提供准确且灵敏的方法，但其在多重分析或促进高通量分析的能力会受到限制。相反，质谱蛋白分析通常以检测的有限灵敏度和狭窄动态范围为代价而实现高通量蛋白质组学分析。

技术实现思路

1、如本文所认识到的，越来越多地施用蛋白质组学策略来理解生命系统生物学产生了对更加有效、高效和准确的蛋白鉴定方法的持续需求。在核酸测序方面已经取得了重大进展，许多下一代技术实现了单分子灵敏度和高通量基因组水平的测量，包括快速和并行的基因组和转录组测序。相比之下，蛋白质组学分析已经滞后，成为许多生物学表征形式的瓶颈。例如，质谱法经常需要事先了解样品组成，可能无法检测来自复杂样品的细胞间的差异，并且经常无法察觉低丰度和低拷贝数蛋白。此外，质谱法检测通常为检测提供有限的动态范围，通常鉴定超过至多四个数量级的蛋白，并因此会错过甚至最简单的蛋白质组(其通常在浓度方面跨越超过十个数量级)的大部分复杂性。

2、具有覆盖蛋白质组中全部蛋白浓度范围的动态范围的无偏倚蛋白测序方法可以改进基因产物和亚细胞复合物的鉴定和表征。提供用于将标记、报告分子或其组合组装到肽的氨基酸上的技术的光学测序系统、方法和试剂盒可以提高肽的快速单分子测序的效率。

3、本技术的方法、系统和试剂盒可以使用光学技术推进当前的肽或蛋白测序方法。本技术的方法和系统可以通过提高测序效率和准确度来克服或减轻其它肽测序方法的至少一些缺点。这可以用于例如癌症诊断、神经学诊断和内分泌学诊断。

4、本技术的一个方面提供了一种包含肽的系统，其中所述肽固定至至少一种支持物；且其中所述肽包含与标记物偶联的氨基酸，其中所述标记物包含：(i)设置为与第二反应性基团偶联的第一反应性基团，所述第二反应性基团与设置为发射信号的报告部分偶联，或(ii)保护基团，所述保护基团设置为防止所述标记物和所述第二反应性基团之间的偶联。

5、本技术的其它方面提供了一种用于处理或分析肽的系统，其包含：包含与第一反应性基团偶联的氨基酸的肽；和与第二反应性基团的支持物，其中所述第一反应性基团设置为与所述第二反应性基团偶联以固定邻近所述支持物的肽。

6、在某些实施方案中，所述至少一种支持物是珠子、聚合物基质或阵列。在某些实施方案中，所述阵列是显微镜载玻片。在某些实施方案中，所述肽的n-端与所述至少一种支持物偶联。在某些实施方案中，所述至少一种支持物是珠子。

7、在某些实施方案中，所述肽的n-端与可切割单元偶联，其中所述可切割单元与所述至少一种支持物偶联。在某些实施方案中，所述可切割单元包含以下中的至少一种：(i)可切割部分，(ii)醛，(iii)至少一种支持物，或(iv)间隔子。在某些实施方案中，其中所述可切割单元包含(i)至(iv)。

8、在某些实施方案中，所述肽的c-端与所述至少一种支持物偶联。在某些实施方案中，所述至少一种支持物是显微镜载玻片。在某些实施方案中，所述c-端修饰有包含炔烃或叠氮化物的化合物。在某些实施方案中，所述炔烃或所述叠氮化物设置为与所述至少一种支持物偶联。

9、在某些实施方案中，所述c-端是酸性氨基酸，其中所述c-端包含第一酸性残基和第二酸性残基。在某些实施方案中，所述第一酸性残基是c-端羧酸。在某些实施方案中，所述第二酸性残基是天冬氨酸侧链或谷氨酸侧链。在某些实施方案中，所述第一酸性残基和所述第二酸性残基修饰有包含炔烃或叠氮化物的化合物。在某些实施方案中，所述炔烃或所述叠氮化物设置为与所述至少一种支持物偶联。

10、在某些实施方案中，所述肽的n-端与所述至少一种支持物的第一支持物偶联，其中所述第一支持物是珠子，且其中所述肽的c-端与所述至少一种支持物中的第二支持物偶联，其中所述第二支持物是显微镜载玻片。

11、在某些实施方案中，所述报告部分设置为在激发时发射信号。在某些实施方案中，所述信号是可检测信号。在某些实施方案中，所述可检测信号是光学信号。在某些实施方案中，所述报告部分包含荧光染料。在某些实施方案中，所述报告部分包含间隔子。在某些实施方案中，所述保护基团不发射光学可检测信号。

12、在某些实施方案中，所述氨基酸选自由赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸组成的组。在某些实施方案中，所述氨基酸包含翻译后修饰。在某些实施方案中，所述翻译后修饰选自由糖基化、乙酰化、烷基化、生物素化、谷氨酰化、糖基化、异戊二烯化、磷酸化、脂化(lipolation)、磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)、硫酸化、硒化、酰胺化、泛素化、羟基化、硝化、亚硝酰化、瓜氨酸化、n-端谷氨酰胺环化、n-端谷氨酸环化和sumo化(sumoylation)组成的组。

13、在某些实施方案中，所述肽包含与多个标记物偶联的多个氨基酸。在某些实施方案中，所述多个氨基酸包含与第一标记物偶联的第一氨基酸和与第二标记物偶联的第二氨基酸。在某些实施方案中，所述多个氨基酸包含(i)与多个第一标记物偶联的多个第一氨基酸和(ii)与多个第二标记物偶联的多个第二氨基酸。在某些实施方案中，所述第一标记物仅与所述第一氨基酸偶联，且所述第二标记物仅与所述第二氨基酸偶联。在某些实施方案中，所述多个标记物中的至少一个标记物与所述多个氨基酸的特定氨基酸类型偶联。在某些实施方案中，所述多个标记物中的至少一个标记物设置为与偶联至特定报告部分的特定第二反应性基团反应。

14、在某些实施方案中，所述肽包含多个氨基酸。在某些实施方案中，所述多个氨基酸中的至少一个氨基酸选自由赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸组成的组。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸与所述标记物偶联。

15、在某些实施方案中，所述第一反应性基团选自由叠氮化物、炔烃、烯烃、醛、酮、四嗪、硫醇、二硫醇、环辛烯和降冰片烯组成的组。在某些实施方案中，所述炔烃是具有应变炔烃(strained alkyne)。在某些实施方案中，所述第一反应性基团选自由叠氮化物、烯烃、醛、酮和四嗪组成的组。在某些实施方案中，所述第二反应性基团选自由炔烃、叠氮化物、硫醇、二硫醇、环辛烯、烯烃、醛、酮、四嗪和降冰片烯组成的组。在某些实施方案中，所述第一反应性基团选自由炔烃、硫醇、二硫醇和环辛烯组成的组。在某些实施方案中，所述炔烃是应变炔烃。

16、本技术的另一个方面提供了一种用于处理或分析肽的方法，所述方法包括：(a)提供所述肽，所述肽包含与标记物偶联的氨基酸，其中所述标记物包含(i)设置为与第二反应性基团偶联的第一反应性基团，所述第二反应性基团偶联至设置为发射信号的报告部分，或(ii)保护基团，所述保护基团设置为防止所述标记物和所述第二反应性基团之间的偶联；(b)使所述肽与包含所述第二反应性基团的混合物接触；(c)在所述肽固定至至少一种支持物的情况下，检测来自所述肽的信号；和(d)使用所述信号或信号变化来鉴定所述肽的所述氨基酸或另外氨基酸。

17、本技术的另一个方面提供了一种用于标记肽的氨基酸的方法，所述方法包括：提供所述肽，其中所述肽包含与叠氮化物偶联的内部氨基酸和与炔烃偶联的c-端；以及，在使第一报告子与所述内部氨基酸反应的条件下，使所述肽与所述第一报告子接触，其中所述第一报告子包含应变炔烃。在某些实施方案中，在不存在铜(cu)的情况下，进行所述方法。在某些实施方案中，所述方法进一步包括使不同于所述第一报告子的第二报告子与所述c-端反应，其中所述第二报告子包含非应变炔烃(non-strained alkyne)。在某些实施方案中，在存在铜(cu)的情况下，进行所述方法。在某些实施方案中，偶联至内部氨基酸的叠氮化物不与偶联至c-端的炔烃反应。

18、在某些实施方案中，所述方法包括：在(c)之前固定所述肽。在某些实施方案中，在(a)或(b)中，将所述肽固定至所述至少一种支持物。在某些实施方案中，所述方法包括：在(b)之后，固定所述肽。在某些实施方案中，在(a)中，所述标记物包含所述第一反应性基团，且在(b)中，所述第二反应性基团与所述第一反应性基团反应。

19、在某些实施方案中，以多个肽的形式提供所述肽。在某些实施方案中，所述肽包含所述多个肽中的至少一个肽。在某些实施方案中，所述多个肽被固定至多个支持物。在某些实施方案中，所述多个肽包含第一肽和第二肽。

20、在某些实施方案中，所述第一肽包含与第一标记物偶联的第一氨基酸且所述第二肽包含与第二标记物偶联的第二氨基酸。在某些实施方案中，所述第一标记物设置为所述第二反应性基团反应且所述第二标记物设置为与和所述第二反应性基团不同的第二反应性基团反应。在某些实施方案中，所述不同的第二反应性基团与第二报告部分偶联，所述第二报告部分设置为发射与所述报告部分不同的信号。

21、在某些实施方案中，所述肽包含与多个标记物偶联的多个氨基酸。在某些实施方案中，所述多个氨基酸包含与第一标记物偶联的第一氨基酸和与第二标记物偶联的第二氨基酸。在某些实施方案中，所述多个氨基酸包含与多个第一标记物偶联的多个第一氨基酸和与多个第二标记物偶联的多个第二氨基酸。在某些实施方案中，所述第一标记物仅与所述第一氨基酸偶联且所述第二标记物与所述第二氨基酸偶联。在某些实施方案中，所述多个标记物中的至少一个标记物与所述多个氨基酸的特定氨基酸类型偶联。在某些实施方案中，所述多个标记物中的至少一个标记物设置为与偶联至特定报告部分的特定第二反应性基团反应。

22、在某些实施方案中，所述肽包含多个氨基酸。在某些实施方案中，所述多个氨基酸中的至少一个氨基酸选自由赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸组成的组。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸与所述标记物偶联。在某些实施方案中，所述多个氨基酸包含至少两种氨基酸类型。在某些实施方案中，并非所有氨基酸类型的多个氨基酸都被标记。

23、在某些实施方案中，所述至少两种氨基酸类型包含第一氨基酸类型和第二氨基酸类型。在某些实施方案中，所述第一氨基酸类型与第一标记物偶联且其中所述第二氨基酸类型与第二标记物偶联。在某些实施方案中，所述第一标记物和所述第二标记物各自与不同的报告部分偶联。在某些实施方案中，所述至少两种氨基酸类型中的每种氨基酸类型与不同的标记物偶联。在某些实施方案中，所述肽包含至少四种氨基酸类型，其中所述至少四种氨基酸类型中的每种氨基酸类型与不同的标记物偶联。在某些实施方案中，所述多个氨基酸并非全部被标记。

24、在某些实施方案中，所述方法包括(e)，使所述肽经受足以从固定至所述至少一种支持物的所述肽中除去至少一个氨基酸的条件。在某些实施方案中，足以除去至少一个氨基酸的条件包括埃德曼降解试剂或含有有机磷酸酯的试剂。在某些实施方案中，在(e)之后，与所述标记物偶联的氨基酸变成末端氨基酸。在某些实施方案中，从所述肽的n-端除去至少一个氨基酸。

25、在某些实施方案中，使用所述信号或信号变化来鉴定所述肽的序列的至少一部分。在某些实施方案中，所述方法包括(f)，重复(d)和(e)以检测来自固定至所述至少一种支持物的所述肽的至少一个另外信号或信号变化，以及(ii)使用所述信号或信号变化和所述另外信号或信号变化来鉴定固定至所述至少一种支持物的所述肽的序列的至少一部分。

26、在某些实施方案中，用具有单分子灵敏度的光学检测器检测所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化包含不同频率或频率范围的多个信号。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化包含不同强度的多个信号。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化是光学信号。

27、在某些实施方案中，所述报告部分产生所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述报告部分包含染料，所述染料产生所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述保护基团包含一个或多个基团，每个基团独立地选自由叠氮化物、烷基、亚烷基、芳基、杂芳基、杂芳基-烷基和芳基-烷基组成的组。

28、本技术的另一个方面提供了用于处理或分析肽的方法，所述方法包含：(a)提供所述肽，其包含与第一反应性基团偶联的氨基酸，所述第一反应性基团设置为与偶联至支持物的第二反应性基团偶联；(b)使所述肽与所述第二反应性基团接触以允许所述第一反应性基团偶联至所述第二反应性基团，由此将所述肽固定至所述支持物；(c)在所述肽固定至所述支持物的情况下，检测来自与所述肽的氨基酸偶联的标记物的信号；和(d)使用所述信号或其变化来鉴定所述氨基酸。

29、在某些实施方案中，所述第一反应性基团经由官能团偶联至所述氨基酸。在某些实施方案中，所述官能团偶联至所述氨基酸的反应性侧链。在某些实施方案中，(a)进一步包括使所述氨基酸偶联至与所述第一反应性基团偶联的官能团。在某些实施方案中，所述官能团仅偶联至与第一反应性基团偶联的氨基酸，所述第一反应性基团被设置为偶联至与支持物偶联的第二反应性基团。

30、在某些实施方案中，所述氨基酸选自由赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和色氨酸组成的组。在某些实施方案中，所述第一反应性基团选自由叠氮化物、炔烃、烯烃、醛、酮、四嗪、硫醇、二硫醇、酯、环辛烯和降冰片烯或活化的酯组成的组。在某些实施方案中，所述酯是活化的酯。在某些实施方案中，所述活化的酯是edc-碳化二亚胺。

31、在某些实施方案中，所述第一反应性基团是叠氮化物或炔烃。在某些实施方案中，所述第二反应性基团选自由炔烃、叠氮化物、硫醇、二硫醇、环辛烯、烯烃、醛、酮、四嗪和降冰片烯组成的组。在某些实施方案中，所述第二反应性基团是炔烃或叠氮化物。在某些实施方案中，所述第一反应性基团和所述第二反应性基团经由点击反应而偶联。在某些实施方案中，所述第二反应性基团通过接头偶联至所述支持物。在某些实施方案中，所述接头是键或任选取代的亚烷基或任选取代的杂亚烷基。在某些实施方案中，所述支持物是阵列。在某些实施方案中，所述支持物是珠子。在某些实施方案中，所述与第一反应性基团偶联的氨基酸是末端氨基酸。

32、在某些实施方案中，所述与第一反应性基团偶联的氨基酸是内部氨基酸。在某些实施方案中，(a)中的氨基酸与(c)中的偶联至标记物的氨基酸相同。在某些实施方案中，(a)中的氨基酸不同于(c)中的偶联至标记物的氨基酸。在某些实施方案中，(c)进一步包括：在(b)之前，使所述标记物偶联至所述肽的氨基酸。在某些实施方案中，(c)进一步包括：在(b)之后，使所述标记物偶联至所述肽的氨基酸。

33、在某些实施方案中，所述标记物偶联至报告部分。在某些实施方案中，所述报告部分偶联至第三反应性基团或抗体。在某些实施方案中，所述第三反应性基团或所述抗体设置为与(c)中所述肽的氨基酸偶联。在某些实施方案中，(c)中所述肽的氨基酸是末端氨基酸。在某些实施方案中，(c)中所述肽的氨基酸是内部氨基酸。在某些实施方案中，所述报告部分偶联至接头，其中所述抗体偶联至(c)中所述肽的氨基酸。

34、本技术的另一方面提供了一种用于测定样品中的肽的序列的试剂盒，所述试剂盒包含：报告子；标记物，其包含第一反应性基团和(i)第二反应性基团或(ii)保护基团，其中所述第一反应性基团设置为与氨基酸类型的氨基酸偶联，其中所述第二反应性基团设置为与所述报告子偶联，所述报告子包含被设置为发射信号的报告部分，且其中所述保护基团设置为防止所述标记物和所述报告部分之间的偶联；和关于使用所述标记物来处理所述肽以提供包含与所述标记物偶联的氨基酸的肽的说明。

35、在某些实施方案中，其中所述报告子与第三反应性基团偶联，所述第三反应性基团设置为与所述第二反应性基团反应。在某些实施方案中，所述报告子设置为在激发时发射信号。在某些实施方案中，所述报告子包含荧光染料。在某些实施方案中，所述报告子包含间隔子。在某些实施方案中，所述保护基团不发射光学可检测信号。

36、在某些实施方案中，所述试剂盒包含蛋白捕获试剂。在某些实施方案中，所述蛋白捕获试剂包含偶联至可切割接头的固体支持物，其中所述可切割接头与醛偶联。在某些实施方案中，所述蛋白捕获试剂设置为与所述肽的n-端偶联。在某些实施方案中，所述固体支持物是珠子。在某些实施方案中，所述醛是吡啶甲醛(pca)或其衍生物。

37、在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含表面附着试剂。在某些实施方案中，所述表面附着试剂包含炔烃或叠氮化物。在某些实施方案中，所述表面附着试剂设置为与所述肽的c-端偶联。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含所述表面附着试剂所附着的支持物。在某些实施方案中，所述支持物是显微镜载玻片。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一种蛋白酶、至少一种消化试剂和固体支持珠子。

38、在某些实施方案中，所述方法进一步包括：在(c)之后，使所述肽经受足以从所述肽的末端端部除去氨基酸的条件。在某些实施方案中，所述条件是埃德曼降解条件。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：重复(c)和(d)一次或多次以鉴定所述肽的多个氨基酸的信号模式，所述多个氨基酸的信号模式包括(d)中的所述信号或其变化。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：使用所述多个氨基酸的信号模式来得到所述肽的序列。

39、本技术的另一个方面提供了包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文别处的任何方法。

40、本技术的另一个方面提供了一种系统，其包括一个或多个计算机处理器和与其相连的计算机存储器。所述计算机存储器包含机器可执行代码，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文别处的任何方法。

41、根据以下详细描述，本领域技术人员将容易地明白本技术的其它方面和优点，其中以下详细描述仅显示和描述了本技术的示例性实施方案。如将意识到的，本技术能够具有其它和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显方面进行修改，所有这些均不背离本技术。因此，附图和描述在性质上应被认为是示例性的，而不是限制性的。

42、通过引用并入

43、本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中所包含的公开内容相冲突的情况下，本说明书意在替代和/或优先于任何这样的相冲突的材料。