用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送的制作方法

背景技术：

1、失调的血浆激肽释放酶活性可能导致促炎和血管活性肽缓激肽的过量产生。此种疾病的实例是遗传性血管性水肿(hae)，这是一种罕见但可能危及生命的病症，其特征是表现为皮下和粘膜下血管性水肿的不可预测且反复的血管扩张发作。在一些情况下，hae与c1抑制剂的低血浆水平相关(i型)，而在其他情况下，该蛋白质以正常或升高的量循环，但它是功能障碍(ii型)。c1抑制剂是血浆激肽释放酶活性的主要调节剂。hae发作的症状包括自发发生或由轻度外伤引发的面部、口腔和/或气道肿胀。影响气道的水肿发作可能是致命的。除了急性炎症发作外，过度的血浆激肽释放酶活性还与慢性疾患(诸如包括红斑狼疮在内的自身免疫性疾病)相关联。

2、已经考虑和开发了各种用于治疗c1-inh缺乏或功能障碍的策略，包括例如抑制接触系统的成员。例如，拉那利尤单抗(lanadelumab)是血浆激肽释放酶的全人源化单克隆抗体抑制剂，该抑制剂已被批准用于治疗hae。

3、使用在体内产生包括抗体在内的蛋白质的载体对于疾病的治疗是理想的，但受到包括递送给受试者后抗体产生不足在内的各种因素的限制。

技术实现思路

1、本发明提供了编码抗血浆激肽释放酶抗体的有效且稳健的重组腺相关病毒(raav)载体。本发明部分基于这样的令人惊讶的发现，即包含编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的经密码子优化的核苷酸序列的特异性重组aav载体导致在体内产生高水平的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中，对载体构建体进行密码子优化以减少cpg含量和重复序列。在一些实施方案中，对载体构建体进行工程改造以将gc含量百分比标准化为在天然的、未修饰的aav8中发现的gc含量百分比。在一些实施方案中，评估该载体构建体中的每个载体构建体的cpg含量、密码子适应指数(cai)、密码子上下文(cc)、gc含量和重复基序。因此，在一些实施方案中，评估载体构建体的cpg含量。在一些实施方案中，评估载体构建体的密码子适应指数(cai)。在一些实施方案中，评估载体构建体的gc含量。在一些实施方案中，评估载体构建体的重复基序的量。具体而言，raav导致在体内稳健且持续地产生抗血浆激肽释放酶mab，并且载体介导的表达的抗血浆激肽释放酶抗体保留了与由传统重组表达方法(例如，cho细胞)产生的抗体蛋白相当的靶向活性。在本发明之前，通过施用携带所需有效载荷的raav载体递送抗血浆激肽释放酶抗体导致未知量的活性抗体产生。因此，在本发明之前，使用编码抗血浆激肽释放酶的raav载体治疗c1-inh缺乏或病症(包括例如遗传性血管性水肿)是不可预测或不可行的。

2、在一些方面，提供了一种包含经密码子优化的核苷酸序列的重组腺相关病毒(raav)载体，该raav载体编码包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的全长抗体，并且其中经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或大于95％的同一性。因此，在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者具有至少约75％的同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者具有至少约80％的同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者具有至少约85％的同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者具有至少约90％的同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者具有至少约95％的同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者具有大于95％的同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列与seq id no:23-36中的任一者是同一的。seq id no:23-36包括seq id no:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36中的任一者。seq idno:23-36中的每一者均列于表3中。

3、在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列选自seq id no:23-36中的任一者。因此，在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:23。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:24。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq idno:25。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:26。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:27。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:28。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:29。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:30。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:31。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:32。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:33。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:34。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:35。在一些实施方案中，经密码子优化的序列是seq id no:36。

4、在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约50个cpg位点、少于约40个cpg位点、少于约35个cpg位点、少于约30个cpg位点、少于约25个cpg位点、少于约20个cpg位点、少于约15个cpg位点或少于约10个cpg位点的cpg含量。因此，在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约50个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约45个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约40个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约35个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约30个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约25个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约20个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约15个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约10个cpg位点的cpg含量。在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有少于约5个cpg位点的cpg含量。

5、在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列具有约5个cpg位点。

6、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是通过接头连接的。在一些实施方案中，所述接头包括可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头包括不可切割的接头。

7、在一些实施方案中，经密码子优化的核苷酸序列包含接头。在一些实施方案中，所述接头包括可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头包括不可切割的接头。

8、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由单一的启动子控制。

9、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由分开的启动子控制。

10、在一些实施方案中，该单一的启动子或该分开的启动子选自遍在启动子、组织特异性启动子或可调节型启动子。因此，在一些实施方案中，该单一的启动子或该分开的启动子是遍在启动子。在一些实施方案中，该单一的启动子或该分开的启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，该单一启动子或该分开的启动子是可调节型启动子。

11、在一些实施方案中，组织特异性启动子是肝脏特异性启动子。

12、在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括选自以下的启动子：人转甲状腺素蛋白启动子(ttr)、经修饰的httr(httr mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝脏启动子1(lp1)、trm启动子、人凝血因子ix pro/肝转录因子反应性低聚物、lsp、cmv/cba启动子(1.1kb)、cag启动子(1.7kb)、mttr、经修饰的mttr、mttr pro、mttr增强子或碱性白蛋白启动子。因此，在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括人转甲状腺素蛋白启动子(ttr)。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括经修饰的httr(httr mod.)。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括α-抗胰蛋白酶启动子。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括肝脏启动子1(lp1)。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括trm启动子。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括人凝血因子ix pro/肝转录因子反应性低聚物。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括lsp。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括cmv/cba启动子(1.1kb)。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括cag启动子(1.7kb)。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括mttr。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括mttr pro。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括mttr增强子。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括碱性白蛋白启动子。

13、在一些实施方案中，肝脏特异性启动子是人转甲状腺素蛋白启动子(ttr)。

14、在一些实施方案中，可调节型启动子是诱导型或可阻遏型启动子。因此，在一些实施方案中，可调节型启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，可调节型启动子是可阻遏型启动子。

15、在一些实施方案中，载体还包含以下的一种或多种：5'和3'反向末端重复体、序列上游的内含子和顺式作用调节性模块(crm)。因此，在一些实施方案中，载体还包含5'反向末端重复体和3'反向末端重复体。在一些实施方案中，载体还包含序列上游的内含子。在一些实施方案中，载体还包含顺式作用调节性模块(crm)。

16、在一些实施方案中，载体还包含wpre序列。

17、在一些实施方案中，wpre序列是经修饰的。

18、在一些实施方案中，wpre含有mut6delatg修饰。

19、在一些实施方案中，crm是肝脏特异性crm。

20、在一些实施方案中，crm是crm8。

21、在一些实施方案中，载体包含至少三个crm。在一些实施方案中，载体包含三个crm。在一些实施方案中，载体包含四个crm。在一些实施方案中，载体包含至少五个crm。在一些实施方案中，载体包含多于五个crm。

22、在一些实施方案中，载体包含三个crm8。

23、在一些实施方案中，raav载体包含ires序列。

24、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体轻链和/或重链包含提高抗体的半衰期和/或降低抗体的效应子功能的一种或多种突变。

25、在一些实施方案中，所述一种或多种突变包括lala突变(l234a和l235a)和/或nhance突变(h433k和n434f)。

26、在一些实施方案中，所述一种或多种突变包括lala突变(l234a和l235a)。在一些实施方案中，所述一种或多种突变包括nhance突变(h433k和n434f)。

27、如前述权利要求中任一项的raav载体，其中所述aav载体选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11或aavrh.10。因此，在一些实施方案中，aav载体是aav1。在一些实施方案中，aav载体是aav2。在一些实施方案中，aav载体是aav3。在一些实施方案中，aav载体是aav4。在一些实施方案中，aav载体是aav5。在一些实施方案中，aav载体是aav6。在一些实施方案中，aav载体是aav7。在一些实施方案中，aav载体是aav8。在一些实施方案中，aav载体是aav9。在一些实施方案中，aav载体是aav10。在一些实施方案中，aav载体是aav11。在一些实施方案中，aav载体是aavrh.10。

28、在一些实施方案中，raav载体具有这样的gc含量，其被工程改造成具有与天然存在的aav约相同的gc含量。在一些实施方案中，raav载体具有这样的gc含量，其被工程改造成具有与天然存在的aav8约相同的gc含量。

29、在一些实施方案中，raav载体衣壳是经工程改造的。

30、在一些实施方案中，经工程改造的raav载体包含具有经修饰的氨基酸序列的aav衣壳序列。

31、在一些实施方案中，经修饰的氨基酸序列包含氨基酸序列的插入、缺失或取代。因此，在一些实施方案中，经修饰的氨基酸序列包含一处或多处插入。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸序列包含一处或多处缺失。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸序列包含一处或多处氨基酸取代。

32、在一些实施方案中，raav衣壳是天然衍生的。

33、在一些实施方案中，aav载体衣壳是aav8。

34、在一些实施方案中，可切割的序列是弗林蛋白酶可切割的序列。

35、在一些实施方案中，弗林蛋白酶可切割的序列之后是接头和2a序列。

36、在一些实施方案中，该接头是gsg接头。

37、在一些实施方案中，2a序列是t2a、p2a、e2a或f2a序列。因此，在一些实施方案中，2a序列是t2a序列。在一些实施方案中，2a序列是p2a序列。在一些实施方案中，2a序列是e2a序列。在一些实施方案中，2a序列是f2a序列。

38、在一些实施方案中，载体还编码分泌信号。

39、在一些实施方案中，分泌信号是天然存在的信号肽。

40、在一些实施方案中，分泌信号是人工信号肽。

41、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链产生能够与血浆激肽释放酶结合的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。

42、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体抑制血浆激肽释放酶的蛋白水解活性。

43、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体与血浆激肽释放酶活性位点结合。

44、在一些实施方案中，该结合阻断血浆激肽释放酶的活性位点。

45、在一些实施方案中，该结合抑制血浆激肽释放酶的活性。

46、在一些实施方案中，该抗体不结合前激肽释放酶

47、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是由同一种载体表达。

48、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是由不同的raav载体表达。

49、在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是由分开的raav载体表达。

50、在一些实施方案中，载体还包含5'和3'反向末端重复体(itr)、一种或多种增强子元件和/或多聚腺苷酸(poly(a))尾巴。因此，在一些实施方案中，载体还包含5'和3'反向末端重复体(itr)。在一些实施方案中，载体还包含一种或多种增强子元件。在一些实施方案中，载体还包含多聚腺苷酸尾巴。

51、在一些实施方案中，所述一种或多种增强子元件选自转录因子结合位点簇(cluster)和/或wpre序列。因此，在一些实施方案中，所述一种或多种增强子元件是转录因子结合位点簇。在一些实施方案中，所述一种或多种增强子元件是wpre序列。

52、在一些方面，提供了一种重组腺相关病毒(raav)，其包含aav8衣壳和包含与seqid no:23-36中的任一者具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或大于95％同一性的经密码子优化的核苷酸序列的raav载体，所述载体包含：a.5'反向末端重复体(itr)；b.顺式作用调节性模块(crm)；c.肝脏特异性启动子；e.经密码子优化的抗血浆激肽释放酶抗体重链序列和抗血浆激肽释放酶抗体轻链序列；f.土拨鼠肝炎病毒转录后调节性元件(wpre)；以及g.3'itr。

53、在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括选自以下的启动子：人转甲状腺素蛋白启动子(ttr)、经修饰的httr(httr mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝脏启动子1(lp1)、trm启动子、人因子ix pro/肝转录因子反应性低聚物、lsp、cmv/cba启动子(1.1kb)、cag启动子(1.7kb)、mttr、经修饰的mttr、mttr pro、mttr增强子或碱性白蛋白启动子。

54、在一些实施方案中，肝脏特异性启动子包括人转甲状腺素蛋白启动子(httr)。

55、在一些实施方案中，crm是肝脏特异性crm。

56、在一些实施方案中，载体包含至少三个crm。

57、在一些实施方案中，载体包含三个crm8。

58、在一些实施方案中，wpre序列是经修饰的。

59、在一些实施方案中，wpre序列是wpre mut6delatg。

60、在一些方面，提供了治疗有需要的受试者的与激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调相关的疾病或病症的方法，所述方法包括施用如本文所述的重组腺相关病毒载体(raav)。

61、在一些实施方案中，激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调是与c1酯酶抑制剂的缺乏相关的疾病或病症。

62、在一些实施方案中，raav载体是通过静脉内、皮下或经皮施用来施用。因此，在一些实施方案中，raav载体是通过静脉内施用来施用。在一些实施方案中，raav载体是通过皮下施用来施用。在一些实施方案中，raav载体是通过经皮施用来施用。

63、在一些实施方案中，经皮施用是通过基因枪进行的。

64、在一些实施方案中，与激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调或c1酯酶抑制剂缺乏相关的病症是遗传性血管性水肿(hae)、获得性血管性水肿(aae)、具有正常c1抑制剂的血管性水肿、糖尿病性黄斑水肿、偏头痛、肿瘤学、神经退行性疾病、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔粘膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、动脉或静脉血栓形成、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、血管炎、水肿、脑水肿、肺栓塞、中风、心室辅助装置或支架引起的凝血、头部外伤或肿瘤周围脑水肿、脓毒症、急性大脑中动脉(mca)缺血事件、再狭窄、系统性红斑狼疮肾炎/血管炎或烧伤。

65、在一些实施方案中，与c1酯酶抑制剂缺乏相关的病症是hae。

66、在一些实施方案中，hae是i型、ii型或iii型。因此，在一些实施方案中，hae是i型hae。在一些实施方案中，hae是ii型hae。在一些实施方案中，hae是iii型hae。

67、在一些实施方案中，raav载体在施用后是游离型的。

68、在一些实施方案中，在施用后，抗血浆激肽释放酶抗体重链和轻链组装为功能性抗体。

69、在一些实施方案中，抗体是igg。

70、在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约2至6周时可在受试者的血浆中检测到。例如，在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约2周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约3周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约4周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约5周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约6周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后多于6周时可在受试者的血浆中检测到。

71、在一些方面，提供了dna表达盒，其包括经密码子优化的核苷酸序列，该核苷酸序列编码包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的全长抗体，并且其中该dna表达盒包含与seq id no:23-36中的任一者具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或大于95％同一性的序列。

72、在一些实施方案中，dna表达盒被包含在递送媒介物内。

73、在一些实施方案中，递送媒介物选自病毒载体、脂质纳米颗粒或细胞外囊泡。因此，在一些实施方案中，递送媒介物是病毒载体。在一些实施方案中，递送媒介物选自脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，递送媒介物选自细胞外囊泡。