一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法与流程

1.本发明涉及微生物培养技术领域，具体为一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法。


背景技术：

2.好氧反硝化菌是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化菌。将培养的低温好氧反硝化菌投加污水处理设施可提高冬季污水脱氮处理的效果，通过低温好氧反硝化菌能够有效快速的去除污染水体内部的硝酸盐。
3.如专利cn201510124201.7株低温好氧反硝化菌及其应用。一株低温好氧反硝化菌，该菌株能够在15℃生长，并在好氧、低碳氮比条件下实现反硝化。在15℃，初始硝酸盐浓度为30mg/l的好氧条件下(do》2mg/l)，该菌72h硝酸盐与总氮的去除率达到100％。
4.这种现有技术方案在使用时还存在以下技术缺陷：
5.提取低温好氧反硝化菌的过程较为繁琐，不能够对低温好氧反硝化菌进行培养，并且现在的低温好氧反硝化菌培养方法简单，只是将好氧反硝化菌在低温下进行培养，没有考虑到好氧反硝化菌在低温下的活性，导致好氧反硝化菌在低温下的活性较低。
6.所以需要针对上述问题进行技术升级，来满足市场需求。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法，以解决上述背景技术中提出提取低温好氧反硝化菌的过程较为繁琐，不能够有效的对低温好氧反硝化菌进行培养，并且现在的低温好氧反硝化菌培养方法简单，只是简单的将好氧反硝化菌在低温下进行培养，没有考虑到好氧反硝化菌在低温下的活性，导致好氧反硝化菌在低温下的活性较低的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法，包括以下步骤：
9.s1：河道水体内部定向采集温度保持在3℃～5℃的污泥，从而得到好氧反硝化细菌；
10.s2：对得到的好氧反硝化细菌进行筛选，得到十株脱氧效率最高的好氧反硝化细菌；
11.s3：将十组培养皿中分别放入培养溶液和筛选的好氧反硝化细菌，并对培养皿进行曝气富集；
12.s4：对十组培养的好氧反硝化细菌进行初步筛分，并检测每组好氧反硝化细菌在不同温度和ph值下的降解cod和硝态氮活性；
13.s5：将最适合的好氧反硝化细菌进行定点培养得到初期好氧反硝化细菌的菌群，再将初期好氧反硝化细菌群在低温下放入固体培养皿进行培养，可得到低温好氧反硝化菌；
14.s6：对培养的固体培养皿内部的低温好氧反硝化菌进行提取，并进行曝气培养得到大量降解cod和硝态氮活性强的低温好氧反硝化菌。
15.优选的，所述步骤s2中筛选的方法为btb平板筛选和反硝化培养基复筛法得到目的菌株，通过btb平板筛选和反硝化培养基复筛法能够有效简单的筛选出好氧反硝化菌。
16.优选的，所述步骤s3中培养溶液以乙醇为碳源，并控制碳氮的比例在20:1.5，初始ph值在7.3，接种量为0.5％的溶液，通过乙醇为碳源构成的培养溶液，能够使得好氧反硝化菌快速的繁殖。
17.优选的，所述步骤s4中好氧反硝化细菌的初步筛分方式为平板划线分离法，平板划线分离法将好氧反硝化细菌相互分散，通过平板划线分离法将好氧反硝化细菌逐步的分散开来。
18.优选的，所述步骤s4中温度和ph值的数值大小的范围在1℃～5℃和ph7.1～ph7.3，通过保持好氧反硝化细菌在1℃～5℃和ph7.1～ph7.3的温度和ph值之间好氧反硝化细菌能够保持最大的活性。
19.优选的，所述步骤s5中固体培养皿的成分为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.06g、磷酸氢二钠0.4g、亚硝酸钠0.02g、硫化镁0.2g、琼脂20g、ph7.3，温度4℃，通过固体培养皿能够有效的培养处低温好氧反硝化菌，并在后期低温好氧反硝化菌的提取时更加的轻松简单。
20.优选的，所述步骤s5定点培养的溶液为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.01g、氯化镁0.02g、氯化钙0.01g、水500ml、ph7.5，温度30℃，通过定点培养溶液能够使得低温好氧反硝化菌快速的繁殖。
21.优选的，所述步骤s6中低温好氧反硝化菌的提取方法为离心提取法，所述离心提取法的转数为130r.min～155r.min，所述离心提取法提取的温度保持在30℃，通过离心提取法能够快速有效的提取低温好氧反硝化菌。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该低温好氧反硝化菌的富集分离方法，曝气培养得到大量降解cod和硝态氮活性强的低温好氧反硝化菌，从而实现低温好氧反硝化菌的富集分离。
23.在河道水体内部定向采集温度保持在3℃～5℃的污泥，可得到好氧反硝化细菌，对得到的好氧反硝化细菌进行筛选，该筛选的方法为btb平板筛选和反硝化培养基复筛法得到目的菌株，得到十株脱氧效率最高的好氧反硝化细菌，将十组培养皿中分别放入培养溶液和筛选的好氧反硝化细菌，该培养溶液以乙醇为碳源，并控制碳氮的比例在20:1.5，初始ph值在7.3，接种量为0.5％的溶液，并对培养皿进行曝气富集，对十组培养的好氧反硝化细菌进行初步筛分，初步筛分方式为平板划线分离法，平板划线分离法将好氧反硝化细菌相互分散，并检测每组好氧反硝化细菌在不同温度和ph值下的降解cod和硝态氮活性，将最适合的好氧反硝化细菌进行定点培养得到初期好氧反硝化细菌的菌群，该定点培养的溶液配比为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.01g、氯化镁0.02g、氯化钙0.01g、水500ml、ph7.5，温度30℃，再将初期好氧反硝化细菌群在低温下放入固体培养皿进行培养，该固体培养皿的成分为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.06g、磷酸氢二钠0.4g、亚硝酸钠0.02g、硫化镁0.2g、琼脂20g、ph7.3，并保持固体培养皿恒温在4℃，可得到低温好氧反硝化菌，对培养的固体培养皿内部的低温好氧反硝化菌进行提取，低温好氧反硝化菌的提取方法为离心提取法，且离心提取法在提取的过程中转数为130r.min～155r.min，温度保持在30℃，并进行曝气培
养得到大量降解cod和硝态氮活性强的低温好氧反硝化菌，从而实现低温好氧反硝化菌的富集分离。
附图说明
24.图1为本发明低温好氧反硝化菌的富集分离原理示意图；
25.图2为本发明低温好氧反硝化菌的富集分离流程示意图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法，包括以下步骤：
28.s1：河道水体内部定向采集温度保持在3℃～5℃的污泥，从而得到好氧反硝化细菌，通过以上河道水体采集的污泥内部的好氧反硝化细菌本身就具有一定的低温活性，使得在后期低温培养的过程中好氧反硝化细菌能够充分的保持在低温环境脱氧的效率；
29.s2：对得到的好氧反硝化细菌进行筛选，筛选的方法为btb平板筛选和反硝化培养基复筛法得到目的菌株，得到十株脱氧效率最高的好氧反硝化细菌，通过选取多株好氧反硝化细菌可避免选取一株好氧反硝化细菌其特殊性的影响造成的检测结果，有效的避免了误差的产生；
30.s3：将十组培养皿中分别放入培养溶液和筛选的好氧反硝化细菌，好氧反硝化细菌的初步筛分方式为平板划线分离法，平板划线分离法将好氧反硝化细菌相互分散，培养溶液以乙醇为碳源，并控制碳氮的比例在20:1.5，初始ph值在7.3，接种量为0.5％的溶液，并对培养皿进行曝气富集；
31.s4：对十组培养的好氧反硝化细菌进行初步筛分，并检测每组好氧反硝化细菌在不同温度和ph值下的降解cod和硝态氮活性，温度和ph值的数值大小的范围在1℃～5℃和ph7.1～ph7.3，通过在不同温度和ph值下的测试可以得到好氧反硝化细菌在对应污水的温度和ph值进行对应定点的培养，对不同温度和ph值下的好氧反硝化细菌活性进行记录，然后将与污水相同温度和ph值活性最好的好氧反硝化细菌投入到污水中，即可得到最佳低温好氧反硝化细菌；
32.s5：将最适合的好氧反硝化细菌进行定点培养得到初期好氧反硝化细菌的菌群，定点培养的溶液为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.01g、氯化镁0.02g、氯化钙0.01g、水500ml、ph7.5，温度30℃，再将初期好氧反硝化细菌群在低温下放入固体培养皿进行培养，可得到低温好氧反硝化菌，固体培养皿的成分为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.06g、磷酸氢二钠0.4g、亚硝酸钠0.02g、硫化镁0.2g、琼脂20g、ph7.3，温度4℃；
33.s6：对培养的固体培养皿内部的低温好氧反硝化菌进行提取，该提取方法为离心提取法，所述离心提取法的转数为130r.min～155r.min，所述离心提取法提取的温度保持在30℃，并进行曝气培养得到大量降解cod和硝态氮活性强的低温好氧反硝化菌，实现低温
好氧反硝化细菌的大量培养，并在分离和提取低温好氧反硝化细菌时更加的简单迅速，使得生产效率增大。
34.综上所述：如图1-2所示，在使用该低温好氧反硝化菌的富集分离方法时，首先在河道水体内部定向采集温度保持在3℃～5℃的污泥，可得到好氧反硝化细菌，对得到的好氧反硝化细菌进行筛选，该筛选的方法为btb平板筛选和反硝化培养基复筛法得到目的菌株，得到十株脱氧效率最高的好氧反硝化细菌，将十组培养皿中分别放入培养溶液和筛选的好氧反硝化细菌，该培养溶液以乙醇为碳源，并控制碳氮的比例在20:1.5，初始ph值在7.3，接种量为0.5％的溶液，并对培养皿进行曝气富集，对十组培养的好氧反硝化细菌进行初步筛分，初步筛分方式为平板划线分离法，平板划线分离法将好氧反硝化细菌相互分散，并检测每组好氧反硝化细菌在不同温度和ph值下的降解cod和硝态氮活性，将最适合的好氧反硝化细菌进行定点培养得到初期好氧反硝化细菌的菌群，该定点培养的溶液配比为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.01g、氯化镁0.02g、氯化钙0.01g、水500ml、ph7.5，温度30℃，再将初期好氧反硝化细菌群在低温下放入固体培养皿进行培养，该固体培养皿的成分为醋酸钠0.4g、硝酸钾0.06g、磷酸氢二钠0.4g、亚硝酸钠0.02g、硫化镁0.2g、琼脂20g、ph7.3，并保持固体培养皿恒温在4℃，可得到低温好氧反硝化菌，对培养的固体培养皿内部的低温好氧反硝化菌进行提取，低温好氧反硝化菌的提取方法为离心提取法，且离心提取法在提取的过程中转数为130r.min～155r.min，温度保持在30℃，并进行曝气培养得到大量降解cod和硝态氮活性强的低温好氧反硝化菌，从而实现低温好氧反硝化菌的富集分离，这就是该低温好氧反硝化菌的富集分离方法的特点。
35.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。