一种兼具木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶Bi76及其应用

本发明属于生物。更具体地，涉及一种兼具木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶bi76及其应用。

背景技术：

1、阿魏酸(ferulic acid)是一种植物酚酸，具有抑制血栓形成、解除血管平滑肌痉挛、抗炎、镇痛、抗氧化等作用，是一种安全性较高的药物，在医药、食品和化妆品等领域有着广泛的应用，具有很高的附加值。通常来说，只有极少数阿魏酸以游离形式存在于细胞质内，小部分与脂溶性物质(甾醇等)结合形成谷维素，而绝大部分阿魏酸则通过酯键、醚键与植物细胞壁中的糖类、木质素、蛋白质等结合，相互交联形成致密网络，从而被束缚在细胞壁中。

2、我国作为农业生产大国，每年都有大量的农业加工副产物以及农业废弃物产生。例如，主要农业废弃物—农作物秸秆的年产量就有近8亿吨，为阿魏酸的提取制备提供了丰富廉价的植物细胞壁原料。而对农业废弃物的细胞壁中的阿魏酸进行提取，不仅可以增加阿魏酸的来源和产量，还可以实现对农业废弃物的充分利用，绿色，环保。

3、目前，工业上主要采用碱解法来提取细胞壁中的阿魏酸，但该方法的粗提液杂质较多，且制备过程会产生大量的废水废渣，易对环境造成污染。酶解法制备阿魏酸是一种具有潜力的清洁替代方法，利用酶解法制备得到的阿魏酸不仅容易分离纯化，且过程中也不会产生大量废料，是一种极具潜力的清洁替代方法。已有不少研究证明：当采用阿魏酸酯酶与木聚糖酶或葡聚糖酶共同处理木质纤维素原料时，所释放的阿魏酸的产量往往要显著高于单独使用阿魏酸酯酶的产量。目前现有技术主要是通过分别添加不同的功能酶来实现。由于不同酶之间会相互影响，因此，虽然将酶复合使用可以提高阿魏酸的产量，但会存在步骤繁杂且酶解效率不高等问题，而利用多功能酶有望解决这个问题。然而目前尚未有兼具木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶的相关报道。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种兼具木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种兼具木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶bi76。

3、本发明的第二个目的是提供一种编码所述三功能酶bi76的基因。

4、本发明的第三个目的是提供一种含有编码所述三功能酶bi76的基因的重组载体。

5、本发明的第四个目的是提供一种含有编码所述三功能酶bi76的基因的重组菌株。

6、本发明的第五个目的是提供所述三功能酶bi76或所述重组菌株在降解农业废弃物或在制备用于降解农业废弃物的制剂中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供所述三功能酶bi76或所述重组菌株在降解含阿拉伯木聚糖、阿魏酸酯和/或葡聚糖的物质中的应用。

8、本发明的第七个目的是提供所述三功能酶bi76或所述重组菌株在生产阿魏酸或制备用于生成阿魏酸的制剂中的应用。

9、本发明的第八个目的是提供一种利用三功能酶bi76降解农业废弃物生产阿魏酸的方法。

10、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

11、本发明从拟杆菌(bacteroides intestinalis)dsm 17393菌株中分离得到了一种兼具木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶bi76，其不仅能够有效水解木聚糖底物(例如可溶性小麦阿拉伯木聚糖和榉木木聚糖)，也能水解葡聚糖类底物(例如大麦β-葡聚[barleyβ-glucan，bbg]和纤维六糖[cellohexaose，c6])，还能水解阿魏酸甲酯(methyl ferulate，mfa)和芥子酸甲酯(methyl sinapinate，msa)。

12、所述三功能酶bi76的氨基酸序列如seq id no.1所示，编码该三功能酶bi76的基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，基因全长2178bp，共编码725个氨基酸；成熟的三功能酶bi76(即不含信号肽)的氨基酸序列如seq id no.2所示，对应的核苷酸序列如seq idno.5所示；三功能酶bi76信号肽部分的氨基酸序列(n端的32个氨基酸)如seq id no.3所示，对应的核苷酸序列如seq id no.6所示。

13、本发明所述三功能酶bi76是一种双催化域三功能酶，双催化域是指酶蛋白的一条多肽链上含有两个催化结构域。具体地，本发明所述三功能酶bi76具有β-内切木聚糖酶、β-内切葡聚糖酶和阿魏酸酯酶的活性，能同时催化水解木聚糖的β-1,4-木糖苷键、葡聚糖的β-1,4-葡萄糖苷键和阿魏酸酯键，催化中心分别位于同一多肽链上的不同催化域里。

14、本发明还提供了一种制备重组三功能酶bi76的方法，包括以下步骤：

15、s1.将编码成熟三功能酶bi76的核苷酸序列(seq id no.5所示)插入表达载体中构建重组表达载体；

16、s2.将步骤s1构建所得重组表达载体转化至宿主菌株中得到重组菌株；

17、s3.诱导培养步骤s2所得重组菌株，对其中的重组三功能酶bi76进行纯化。

18、具体地，步骤s1中所述重组表达载体为pet-32a。

19、具体地，步骤s2中所述宿主菌株为大肠杆菌rosetta(de3)。

20、基于上述方法，含有编码本发明所述三功能酶bi76的基因的重组载体或重组菌株也应在本发明保护范围之内；具体地，所述基因的核苷酸序列如seq id no.4或seq idno.5所示。

21、本发明实验发现所述三功能酶bi76发挥木聚糖酶活性的最适ph为6.0，同时具有良好的ph稳定性，在ph 4.0～9.0范围内，于25℃放置12h后仍能保留80％以上的酶活性；三功能酶bi76的最适反应温度为45℃。

22、本发明以可溶性小麦阿拉伯木聚糖(swax)为底物探究不同金属离子和化学试剂对三功能酶bi76活性的影响发现，在浓度较低时(1mm)，cu2+、ni+和非离子表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)能将bi76的酶活力分别提高至111％、113.1％和113.3％；在浓度较高时(10mm)，fe2+、na+和triton x-100将bi76的酶活力提高至101.7％、108.4％和140.4％。

23、本发明还利用制备所得的重组三功能酶bi76，从农业废弃物中成功提取到了阿魏酸。本发明利用重组三功能酶bi76分别从玉米麸皮(corn bran)、玉米芯(corncob)、麦麸(wheat bran)、玉米秸秆(corn stover)、稻壳(rice husk)和米糠(rice bran)中制备得到了阿魏酸，阿魏酸的产率分别为520、438、212、135、46和19mg/g/mm/h。此外，利用重组三功能酶bi76水解不溶性小麦阿拉伯木聚糖制备阿魏酸的产率为329mg/g/mm/h。

24、单位mg/g/mm/h也体现了酶的效率，其意义为每mm三功能酶bi76每小时能够将1g已处理的农业废弃物转换为多少mg阿魏酸。

25、因此，本发明申请保护所述三功能酶bi76或能表达重组三功能酶bi76的重组菌株在生产阿魏酸或制备用于生成阿魏酸的制剂中的应用。

26、本发明还申请保护所述三功能酶bi76或能表达重组三功能酶bi76的重组菌株在降解农业废弃物或在制备用于降解农业废弃物的制剂中的应用。

27、本发明还申请保护所述三功能酶bi76或能表达重组三功能酶bi76的重组菌株在降解农业废弃物生产阿魏酸或在制备用于降解农业废弃物生产阿魏酸的制剂中的应用。

28、本发明所述三功能酶bi76在制备阿魏酸之余，三功能木聚糖酶/葡聚糖酶/阿魏酸酯酶的其他两个功能木聚糖酶和葡聚糖酶活性产生的木糖和葡萄糖可以转化为生物乙醇等增值生物化学品，实现废弃物资源最大化。

29、具体地，所述农业废弃物为玉米芯、玉米秸秆、玉米麸皮、麦麸、稻壳、米糠中的一种或多种。

30、本发明还申请保护所述三功能酶bi76或能表达重组三功能酶bi76的重组菌株在降解含阿拉伯木聚糖、阿魏酸酯和/或葡聚糖的物质中的应用。

31、本发明还申请保护所述三功能酶bi76编码基因在制备具有木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶的制剂中的应用。

32、本发明还提供了一种利用所述三功能酶bi76降解农业废弃物生产阿魏酸的方法，其包含以下步骤：

33、s1.农业废弃物的预处理；将农业废弃物粉碎后，以质量体积比为1∶5～10的比例加入1％h2so4，混合，130～150℃条件下处理1～4h，结束后用naoh溶液调ph为5～6，冷冻干燥；

34、s2.酶解制备阿魏酸；在步骤s1所得预处理后的农业废弃物中加入重组三功能酶bi76和ph为5～6的缓冲液，使农业废弃物的终浓度为15～25mg/ml，重组三功能酶bi76的终浓度为5～15μm；混匀后于37～45℃条件下振荡反应1～10h，100℃灭活10min，离心取上清，所得上清溶液中即含有阿魏酸。

35、具体地，所述农业废弃物为玉米芯、玉米秸秆、玉米麸皮、麦麸、稻壳或米糠。

36、具体地，农业废弃物与1％h2so4的质量体积比为1∶10。

37、优选地，步骤s1中的处理温度为140℃，处理时间为1h，见实施例3。

38、具体地，步骤s2中农业废弃物的终浓度为20mg/ml；重组三功能酶bi76的终浓度为10μm。

39、具体地，步骤s2中所用缓冲液为50mm柠檬酸钠-150mm氯化钠缓冲液，ph为5.5。

40、具体地，步骤s2中振荡反应条件为700rpm。

41、优选地，步骤s2中振荡反应的温度为45℃，反应时间为1h，见实施例3。

42、本发明具有以下有益效果：

43、本发明所述兼具木聚糖酶、葡聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的三功能酶bi76具有良好的ph稳定性和非离子表面活性剂耐受性，其可高效降解含阿拉伯木聚糖、阿魏酸酯以及葡聚糖的物质，可用于降解农业废弃物。在利用三功能酶bi76水解农业废弃物的过程中还能产生阿魏酸，且阿魏酸产率高，其水解玉米麸皮、玉米芯、麦麸和玉米秸秆等农林废弃物制备阿魏酸时的产率分别为520、438、212和135mg/g/mm/h。此外，在制备阿魏酸之余，由所述三功能酶bi76中的木聚糖酶和葡聚糖酶活性产生的木糖和葡萄糖还可以转化为生物乙醇等增值生物化学品，实现废弃物资源利用的最大化。