一种用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒及其构建方法和应用

1.本发明涉及炎症基因治疗生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒及其 在炎症性疾病治疗中的应用。


背景技术：

2.炎症是机体对感染和身体损伤的保护性反应。适度的炎症反应有助于维持体 内的稳态。然而，异常的炎症反应会导致炎症性疾病。例如，一些传染性病原体 可导致全身炎症，可能导致败血症、细胞因子释放综合征、急性呼吸窘迫综合征， 甚至多器官功能衰竭。一些持续性感染会导致慢性炎症以及癌症高风险诱发，例 如乙型肝炎病毒引起的肝炎和肝癌。许多慢性炎症是由适应性免疫异常变化引起 的，从而导致了各种自身免疫性疾病，如关节炎、炎性肠病、狼疮、银屑病、皮 炎、哮喘、多发性硬化、脂肪性肝炎，甚至动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性 疾病和炎性衰老。此外，先天免疫的许多异常变化还会诱发各种自身炎症性疾病。 因此，异常炎症对人类健康构成了广泛而严重的威胁。
3.为了治疗炎症性疾病，这些疾病相关的分子机制被广泛研究。目前已经明确 了它们的基础信号通路(例如nf-κb和jak-stat)以及主要的参与分子，其 中许多潜在的靶点被尝试用于抗炎药物的开发。迄今为止，许多药物已被应用来 治疗各种炎症性疾病，例如广泛使用的皮质类固醇(如糖皮质激素)。同时许多 抗炎生物制剂也陆续被研发，例如细胞因子单克隆抗体(如促炎细胞因子tnf-α、 il-1α、il-1β、il-5、il-6、il-12、il-17a、il-17f、il-23和抗炎细胞因子il-4、 il-10、il-11、il-13、tgfβ)、细胞因子受体的抗体或拮抗剂(例如il-6r、il-5rα、 il-4rα)和cd抗体(例如cd4、cd14、cd19、cd20、cd38、cd40)。jak 小分子抑制剂(jak1、jak2、jak3、tyk2)则是迅速发展起来的有前景的新 型抗炎药。毫无疑问，目前的消炎药已经让患者受益匪浅。然而，抗炎药物仍面 临几个关键性的挑战，比如原发性无应答、耐药或者响应丢失、复发和多种副作 用。因此，当前的治疗方法还远远未能满足炎症性疾病临床治疗的需求。
4.nf-κb是一个序列特异性dna结合转录因子家族，包括rela/p65、p50、p52、 relb和c-rel，在炎症中起关键调节作用。被多种诱导剂诱导之后,活化的nf-κb (主要是rela-p50异二聚体)可以通过直接结合启动子和增强子来诱导靶基因 的表达，从而参与细胞增殖、凋亡、先天免疫反应等过程。其中，nf-κb能直接 调节多种炎症基因的表达，包括粘附因子(如icam-1、vcam-1)、细胞因子(如 il-1α、il-1β、il-2、il-6、il-8、il-10、il-11、il-12、il-13、il-15、il-17、 il-23、tnfα、ifnβ、ifnγ)和趋化因子(例如ccl5、ccl17、ccl19、ccl20、 ccl22、ccl23、ccl28)。诱骗寡核苷酸和小干扰核酸(sirna)也曾被作为 nf-κb的候选抑制剂。但是由于其活性不可控、递送困难、易降解，这两种nf-κb 抑制剂在临床试验中也未能成功。为了克服它们的局限性，申请人前期开发了一 种新的nf-κb抑制剂分子：一种结合了nf-κb诱骗子和microrna序列的质粒 载体dmp-mir533(int.j.biochem.cell.biol.2018,95:43-52；专利号 zl201710812983.2)。
5.申请人前期技术中已经在体外培养的细胞上初步论证dmp-mir533质粒载 体可感知并抑制细胞内的nf-κb活性，但质粒载体本身目前还不能直接用于动 物体内给药，也是说该种质粒载体无法实现体内细胞的转染和nf-κb活性的控 制。此外，炎症本身不是体外某种细胞的行为，而是哺乳动物活体水平的一种生 理或病理反应。因此，在体外培养细胞中可感知和控制nf-κb活性的 dmp-mir533是否能够在哺乳动物活体上控制nf-κb活性并实现炎症的治疗， 仍是未知。此外，体外培养的细胞是一种非常单纯的人工可控的环境，与具有复 杂生命系统的哺乳动物活体的体内生理及病理环境无法相提并论。这就是为什么 很多富有希望的候选药物分子在临床实验上都无法成为药物的与原因。因此，为 了论证和开发dmp-mir533在哺乳动物活体上控制nf-κb活性并实现炎症的治 疗的可能性，为人类的炎症治疗探索新的技术。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有炎症治疗存在的问题，本发明提供一种新型重组腺相关 病毒，该病毒可通过抑制细胞内nf-κb活性实现哺乳动物活体上炎症疾病的治 疗，有望用于制备新型生物药物，用于人类炎症性疾病的治疗。
7.本发明还提供所述重组腺相关病毒的构建方法和应用。
8.技术方案：为了实现上述目的，本发明提出一种用于炎症性疾病治疗的重组 腺相关病毒，所述重组腺相关病毒raav-dmp-mir533以腺相关病毒为载体，其 包含一个到多个拷贝的功能性dna片段dmp-mir；所述功能性dna片段 dmp-mir由两个功能元件dmp和mir构成，其中dmp为nf-κb特异性启动 子，所述mir为编码可靶向nf-κb mrna的microrna。
9.其中，所述dmp为nf-κb特异性启动子，由一个nf-κb诱骗子和一个最 小启动子组成，该dmp包括各种序列的nf-κb诱骗子和最小启动子。
10.作为优选，所述dmp的序列(seq id no.1)为5'-ggg aat ttc cgg ggactt tcc ggg aat ttc cgg gga ctt tcc ggg aat ttc cta gag ggtata taa tgg aag ctc gac ttc cag-3'。
11.其中，所述mir包括编码靶向nf-κb家族成员rela、relb或crel的 各种人工设计microrna。
12.作为优选，所述mir编码靶向nf-κb家族成员rela的人工microrna； 作为优选，mir编码mir533，其中mir533的序(seq id no.2)为5
′‑
caa agatgg gat gag aaa gga-3
′
。
13.其中，所述功能性dna片段dmp-mir被重组腺相关病毒导入细胞后，其 功能元件dmp可结合细胞核内的转录因子蛋白nf-κb，从而激活mir的表达。
14.进一步地，表达的mir经细胞内microrna成熟系统加工成熟后，可在细 胞质中结合nf-κb mrna，从而抑制nf-κb蛋白的表达；所述microrna成熟 系统加工成熟是指最初表达的mir必须经过这些系统(一些蛋白及其复合物) 剪切加工后变成成熟的mir才会发挥其功能；该过程的主要环节包括mir的最 初转录产物pri-mirna在细胞核内被drosh-dgcr8复合物加工为pre-mirna； pre-mirna经exportin 5蛋白辅助有细胞核进入细胞质；pre-mirna在细胞质内 经dicer-trbp复合物进一步加工为mirna。
15.其中，所述腺相关病毒包括各种血清型的腺相关病毒，如aav1到aav9 中的任意一种。
16.作为优选，所述腺相关病毒为aav2。
17.本发明所述的用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒的构建方法，包括如下 步骤：
18.(1)从pdmp-mir533载体上扩增dmp-mir533，将其连接到paav-mcs 载体上构建得到paav-dmp-mir533；
19.(2)使用paav-dmp-mir533和两种辅助质粒(paav-helper和paav-rc；stratagene)对293t细胞进行转染，细胞培养后，将细胞和培养基收集并冻融， 将纯氯仿加入细胞冻融完的裂解液中，震荡后，向混合物中加入nacl并摇动至 nacl溶解，离心后收集上清液，加入peg8000并摇动至其溶解，离心弃去上清 液，而后使沉淀溶解，然后将dnase和rnase加入溶解完的沉淀中，反应物在 室温下温育，再进行萃取，收集含有纯化病毒的水相，病毒定量后，将其分装至
ꢀ‑
80℃保存备用，获得的病毒命名为raav-dmp-mir533。
20.本发明所述的用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒在制备新型炎症性疾 病治疗试剂中的应用。
21.进一步的，炎症性疾病包括各种类型炎症相关疾病，如感染引起的炎症、自 发炎症、自身免疫病、神经退行性疾病、癌症等。
22.其中，所述炎症性疾病包括急性结肠炎、银屑病和关节炎。
23.本发明的raav-dmp-mir533能够制备以多种给药方式进行给药的新型安全 抗炎试剂。
24.作为优选，所述raav-dmp-mir533可以通过与凡士林等试剂混合制备用于 治疗银屑病等皮肤炎症的外用涂抹试剂或药物，这种给药方式极大便利了局部皮 肤炎症的治疗。
25.本发明制备了一种重组腺相关病毒raav-dmp-mir533，其中dmp是一种 nf-κb特异性启动子，由nf-κb诱骗子和最小启动子连接形成；其中mir533 可编码靶向nf-κb rela的人工microrna。实验研究表明，raav-dmp-mir533 病毒在小鼠上对葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎、咪喹莫特诱导的银屑病和胶原 诱导的关节炎具有良好的治疗效果，并在这些炎症模型小鼠治疗中具有良好的安 全性。本发明有望为多种炎症性疾病的治疗提供一种新技术及新试剂。
26.本发明中的dmp是一种nf-κb特异性启动子，由一个nf-κb诱骗子和一 个最小启动子组成。mir533是一种靶向nf-κb rela的人工microrna。前期 已经证明dmp-mir533可以感知和控制体外培养细胞内的nf-κb活性。通过转 染dmp-mir533可使nf-κb过度活化细胞发生凋亡，但对正常细胞几乎没影响。， 在本发明中，将dmp-mir533包装在腺相关病毒(adeno-associated virus，aav) 中以解决其体内递送问题，并以包装了dmp-mir533的重组aav(recombinantaav，raav)在论证dmp-mir533是否具有控制体内炎症的作用以及是否具有 安全性。本发明中，首先在体外评估了raav-dmp-mir533对体外炎性细胞的抑 制作用，论证了raav-dmp-mir533的包装成功、对细胞的侵染能力以及对细胞 内过度活化nf-κb活性的抑制。然后，将raav-dmp-mir533用于治疗具有三 种典型炎症性疾病的小鼠，包括葡聚糖硫酸钠(dss)诱发的急性结肠炎、咪喹 莫特(imq)诱发的银屑病和胶原诱发的关节炎。以此论证raav-dmp-mir533 在哺乳动物活体上治疗炎症的可行性、可靠性及安全性。
27.在机制方面，本发明发现raav-dmp-mir533可以使炎性细胞凋亡，从而根 除炎性细胞。炎性细胞可以分泌促炎细胞因子，从而加剧和恶化炎症过程。 raav-dmp-mir533可以
通过根除炎性细胞从而去除炎症源。这种机制不同于目 前依赖于细胞因子及其受体的抗体或拮抗剂的抗炎策略。nf-κb的直接靶基因大 多数是细胞因子，而用抗体抑制细胞因子只能瞬时中和其产生的细胞因子，不能 根除产生它们的炎性源。这就导致炎性细胞仍然可以持续产生细胞因子。因此， 用细胞因子的抗体去治疗炎症性疾病复发率高。此外，许多细胞因子与其受体的 多效性和冗余性结合会限制单一中和试剂的功效。这也是炎症性疾病对当下治疗 策略具有抗性的原因。重要的是，作为特定炎症性疾病的关键参与者或关键调节 剂的细胞因子可能因人而异，导致了目前大多数治疗方法对患者应答率低。相比 之下，raav-dmp-mir533通过根除炎性细胞而抑制了与炎症相关的所有细胞因 子。例如，在三种炎症小鼠模型中，raav-dmp-mir533在mrna和蛋白质水平 上均显著降低了血清中两种主要的促炎因子tnf-α和il-6的水平。这种血液中 主要炎性因子水平的降低，对于治疗局部炎症症状和消除炎性因子的全身性病理 作用具有极其重要的意义。因此，raav-dmp-mir533提供了一种更具广谱性抗 炎的新策略，该工具可能克服当前抗炎治疗的一些关键挑战，如低响应、耐药、 复发和副作用等。
28.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
29.目前的炎症治疗试剂主要是各种细胞因子的抗体(如tnf-α抗体)和新兴的 jak小分子抑制剂，这些治疗试剂存在应答率低和耐药的关键临床问题。为了突 破现有的炎症治疗技术，发展基于aav的新型炎症基因治疗新技术。本发明中 将申请人前期发明的dna片段dmp-mir533包装到安全的基因递送载体aav 中，制造了新型aav颗粒——raav-dmp-mir53。系统研究了raav-dmp-mir533 在细胞和活体水平上的抗炎作用。结果表明，raav-dmp-mir533在体外和体内 均具有优异的抗炎作用。特别是，这种raav在三种典型的炎症小鼠模型中均表 现出了良好的炎症治疗效果，包括急性结肠炎模型的葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的 小鼠急性结肠炎、咪喹莫特(imq)诱导的银屑病模型和胶原诱导的小鼠关节炎 模型。此外，在体内治疗过程中，raav-dmp-mir533还展现出了良好的生物安 全性。因此，本发明研制的raav-dmp-mir53有望用于制备新型生物药物，用 于人类炎症性疾病的治疗。
30.相对于传统的nf-κb小分子抑制剂、诱骗子和sirna，raav-dmp-mir533 的优势在于它可以避免对正常细胞中nf-κb活性的过度抑制。这是传统nf-κb 小分子抑制剂、诱骗子和sirna为什么不能成为药物的根本原因。例如，作为 nf-κb抑制剂的典型小分子nf-κb抑制剂bay 11-7082，会使炎性细胞和正常细 胞均发生显著凋亡。本发明实验研究表明，raav-dmp-mir533能够诱导具有 nf-κb过度活化的癌细胞(一种典型的炎性细胞)的显著凋亡，但对正常细胞几 乎没有影响。但是当正常细胞被nf-κb诱导剂tnf-α诱导后成为炎性细胞时， raav-dmp-mir533则能诱导炎性化的正常细胞凋亡。说明raav-dmp-mir533 能够特异性低作用于炎性细胞，这种高度选择性对于提高体内应用型和降低副作 用具有重要意义。因此，raav-dmp-mir533克服了传统nf-κb抑制剂的副作用 缺陷，具有临床转化潜力。
31.aav是一种安全的基因传递工具，它具有免疫原性低、无致病性、无基因组 插入、长期稳定表达等优点，已被获批用于人类临床基因治疗。本发明实验研究 表明，在已使用剂量的前提下，raav-dmp-mir533对三种炎症性疾病的小鼠均 没有显现出生物毒性。特别是，对关节炎cia小鼠进行了三次高剂量的静脉给 药，raav-dmp-mir533对小鼠的血清生化指标和脾脏均没有产生影响。相比之 下，广泛使用的抗关节炎药物mtx，对小鼠肝脏和脾脏展示出了显著的毒副作 用。此外，在本发明中，首次发现raav-dmp-mir533可以通过与凡士
林混合外 用涂抹治疗银屑病。这一给药方式极大便利了局部皮肤炎症的治疗。这一发现在 国际上上没有报道，是对raav基因治疗给药途径的重要创新。因此， raav-dmp-mir533是一种能够以多种给药方式进行给药的新型安全抗炎试剂。 虽然raav-dmp-mir533潜在的临床应用仍然会受到预先存在或体内能中和 aav载体的抗体的挑战，因为这些抗体能够阻断aav的给药和再给药，这也是 目前基于aav疗法的普遍障碍。然而，这一障碍可以通过一些新的方法来克服， 例如利用内肽酶(例如imlifidase，ides)或者igg降解酶(idez)去消除预先 存在的抗aav抗体，用crispr瞬时抑制内源性myd88,以及使用具有tlr9 抑制序列的aav改造载体等。此外，其他非病毒载体，如脂质纳米粒(lnps) 也能被用于dmp-mir533的递送。此外，认为raav包装中残留的空壳raav也 可能时一种有效raav抗体中和剂。
32.在本发明中，同时开发了一种基于aav的基因疗法用于炎症性疾病的治疗。 目前，基于aav的基因疗法主要用于治疗人类遗传疾病。其中，几种基于aav 的基因疗法已开展了临床试验，例如通过表达ifn-β或tnfr-igg1 fc的融合蛋 白来治疗炎症性疾病，尤其是自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎。然而，这些 治疗仍然只针对一种炎症相关的细胞因子。相比之下，raav-dmp-mir533直接 靶向炎症中枢nf-κb本身。三种典型炎症疾病的治疗表明，基于aav基因治疗 的raav-dmp-mir533为炎症性疾病提供了更广谱的治疗策略。
附图说明
33.图1为质粒和病毒载体。paav-mcs、paav-dmp-nt、paav-dmp-mir533、 paav-cmv-egfp、paav-dmp-mir533-cmv-egfp的质粒图谱，及其包装成重 组aav(raav)。制备的raav分别命名为raav-mcs、raav-dmp-nt、 raav-dmp-mir533、raav-cmv-egfp和raav-dmp-mir533-cmv-egfp。
34.图2为raav-dmp-mir533的炎症治疗示意图。(a)raav-dmp-mir533的 炎症治疗示意图。dmp，诱骗子-最小启动子；pol ii，rna聚合酶ii；risc， rna诱导的沉默复合物。(b)炎性细胞和正常细胞中nf-κb的表达水平。具有 nf-κb活性的癌细胞ht-29和ct-26被视为天然炎性细胞。正常细胞hl7702和 nih-3t3没有nf-κb活性。然而，当用促炎细胞因子tnf-α诱导时，这两种细 胞成为了具有nf-κb活性的诱导性炎性细胞。通过qpcr检测nf-κb rela的 表达(n＝3孔)。
35.图3为用paav-dmp-mir533处理炎性细胞。用各种质粒转染ht-29细胞， 然后分别培养24、48和72小时。(a)吖啶橙(oa)染色后ht-29细胞的代表 性荧光图。比例尺：100μm。(b)不同时间点的活细胞计数(n＝3个图像)。 使用image-pro plus软件对吖啶橙染色后的荧光图像进行细胞计数。(c)cck-8 检测ht-29细胞的生长曲线(n＝3孔)。(d)转染各种质粒48小时后，qpcr 检测ht-29细胞中nf-κb及其靶基因的相对表达量(n＝3孔)。rq＝2
–
δδct
。 rq，相对定量。(e)吖啶橙染色后，hl7702细胞的代表性荧光图。比例尺：100 μm。根据需要，对hl7702细胞使用tnf-α诱导，然后进行质粒转染。转染的 细胞分别培养24、48和72小时。空白组、mcs和mir533：分别用lipofectamine、 paav-mcs和paav-dmp-mir533转染细胞；tnf-α：tnf-α诱导的细胞(用 终浓度为10ng/ml的tnf-α诱导细胞1小时)；tnf-α+mcs和tnf-α+mir533： 分别用paav-mcs和paav-dmp-mir533转染的tnf-α诱导后的细胞。
36.图4为用raav-dmp-mir533-cmv-egfp处理炎性细胞。根据需要，对 hl7702细胞使用tnf-α诱导，然后用各种raav侵染48小时。(a)细胞荧光 图。比例尺：100μm。(b)流式细胞
术分析的细胞荧光强度(n＝3孔)。(c) 代表性细胞凋亡的流式细胞术分析图。(d)流式细胞术分析的细胞凋亡(n＝3 孔)。(e)cck-8检测的细胞活力(n＝3孔)。(f)通过qpcr检测病毒侵染48 小时后细胞的nf-κb及其靶基因的表达(n＝3孔)。空白组、mcs、mir533、 egfp和mir533-egfp：分别用磷酸盐缓冲盐水(pbs)、raav-mcs、raav-dmp-mir533、raav-cmv-egfp和raav-dmp-mir533-cmv-egfp侵染 细胞；tnf-α：tnf-α诱导的细胞(用终浓度为10ng/ml的tnf-α诱导细胞1 小时)；tnf-α+mcs、tnf-α+mir533、tnf-α+egfp、tnf-α+mir533-egfp： 分别用raav-mcs、raav-dmp-mir533、raav-cmv-egfp和 raav-dmp-mir533-cmv-egfp侵染tnf-α诱导的细胞。
37.图5为egfp荧光强度的流式细胞仪分析。将hl7702细胞用或不用10 ng/ml终浓度的tnf-α诱导1小时，然后用各种病毒感染48小时。mcs、 mir533、egfp和mir533-egfp：分别用磷酸盐缓冲液(pbs)、raav-mcs、 raav-dmp-mir533、raav-cmv-egfp和raav-dmp-mir533-cmv-egfp侵染 细胞；tnf-α+mcs、tnf-α+mir533、tnf-α+egfp、tnf-α+mir533-egfp：分 别用raav-mcs、raav-dmp-mir533、raav-cmv-egfp和 raav-dmp-mir533-cmv-egfp侵染tnf-α诱导的细胞。
38.图6为用raav-dmp-mir533治疗结肠炎小鼠。通过葡聚糖硫酸钠(dss) 诱导建立结肠炎小鼠模型，并通过静脉注射raavs(i.v.)进行治疗。(a)dss 诱导的急性结肠炎小鼠模型构建及治疗示意图。(b)小鼠肛门周围的血迹。(c) 小鼠的体重。(d)小鼠的结肠。(e)小鼠的结肠长度(n＝6只小鼠)。(f)代 表性结肠样本的h&e染色切片。黑框表示放大区域。比例尺：200μm(10
×
) 和100μm(20
×
)。(g)结肠样本的组织病理学评分(n＝6只小鼠)。(h)elisa 检测血清中的tnf-α和il-6水平(n＝6只小鼠)。(i)qpcr检测结肠样本中 nf-κb rela及其靶基因的表达(n＝6只小鼠)。空白组，小鼠饮用正常水并用 pbs治疗；dss组，小鼠饮用含3％dss的水(dss诱导小鼠)并用pbs治疗； mcs组，用raav-mcs治疗dss诱导小鼠；mir533，用raav-dmp-mir533治 疗dss诱导的小鼠。ns，没有显著性差异。
39.图7为通过葡聚糖硫酸钠(dss)诱导建立结肠炎小鼠模型，并通过静脉注 射raavs(i.v.)进行治疗(生物学重复2)。(a)dss诱导的急性结肠炎小鼠模 型构建及治疗示意图。(b)小鼠肛门周围的血迹。(c)小鼠的体重。(d)小鼠 的结肠。(e)小鼠的结肠长度(n＝6只小鼠)。(f)代表性结肠样本的h&e染 色切片。黑框表示放大区域。比例尺：200μm(10
×
)和100μm(20
×
)。(g) 结肠样本的组织病理学评分(n＝6只小鼠)。空白组，小鼠饮用正常水并用pbs 治疗；dss组，小鼠饮用含3％dss的水(dss诱导小鼠)并用pbs治疗；mcs 组，用raav-mcs治疗dss诱导小鼠；mir533，用raav-dmp-mir533治疗dss 诱导的小鼠。(h)elisa检测血清中的tnf-α和il-6水平(n＝6只小鼠)。
40.图8为raav-dmp-mir533静脉注射治疗银屑病小鼠。银屑病小鼠模型通过 咪喹莫特(imq)诱导建立，并通过静脉注射raavs(i.v.)进行治疗。(a)银 屑病小鼠模型的构建及治疗示意图。(b)小鼠背部皮肤的直观图。(c)代表性 皮肤样本的h&e染色切片。比例尺：200μm(10
×
)和100μm(20
×
)。(d)imq 诱导6天后皮肤样本的组织病理学评分(n＝3只小鼠)。(e)imq诱导12天后 皮肤样本的组织病理学评分(空白组和mcs组，n＝3只小鼠；mir533组，n＝ 6只小鼠)。(f)elisa检测血清中的tnf-α和il-6水平(空白组和mcs组， n＝3只小鼠；mir533组，n＝6只小鼠)。(g)qpcr检测皮肤样本中tnf-α和 il-6的mrna水平(空白组和mcs组，n＝3只小鼠；mir533组，n＝6只小 鼠)。空白组，用pbs治疗经凡士林涂抹的小鼠；mcs，用
raav-mcs治疗imq 诱导的小鼠；mir533，用raav-dmp-mir533治疗imq诱导的小鼠。ns，没有 显著性差异。
41.图9为imq诱导的银屑病小鼠经raav-dmp-mir533尾静脉注射治疗后相关 组织的h&e病理分析和基因表达检测。(a)不同组(空白组、mcs、mir533) 中所有皮肤样本的h&e染色切片。(b)通过qpcr检测皮肤样本中表达nf-κb 及其靶基因的表达。
42.图10为raav-dmp-mir533皮下注射(i.h.)和皮肤给药(ad us.ext.)(外用) 对银屑病小鼠模型的疗效。这些实验只用一只老鼠进行试验。(a)第0、6、12 天小鼠背部皮肤的照片。(b)典型的h&e染色皮肤样本组织切片。(c)elisa 检测血清中的tnf-α和il-6。(d)qpcr检测皮肤样本中nf-κb及其靶基因的 表达。f，皮下注射(i.h.)；t，皮肤给药(ad us.ext.)。
43.图11为raav-dmp-mir533皮肤外用给药治疗银屑病小鼠。银屑病小鼠模型 通过咪喹莫特(imq)诱导建立，并通过皮肤涂抹给药(外用)raavs进行治疗。 (a)银屑病小鼠模型的构建及治疗示意图。(b)小鼠背部皮肤的直观图。(c) 银屑病面积和严重程度指数(pasi)评分(n＝6只小鼠)。(d)代表性皮肤样本 的h&e染色切片。比例尺：200μm(10
×
)和100μm(20
×
)。(e)皮肤样本的 组织病理学评分(n＝6只小鼠)。(f)小鼠脾直观图。(g)脾重(n＝6只小鼠)。 (h)每组小鼠平均体重(n＝6只小鼠)。(i)elisa检测血清中tnf-α和il-6 水平(n＝6只小鼠)。空白组，用pbs治疗经凡士林涂抹的小鼠；mcs，用 raav-mcs治疗imq诱导的小鼠；mir533，用raav-dmp-mir533治疗imq诱 导的小鼠。ns，不显著。
44.图12为通过皮肤涂抹给药raav-dmp-mir533治疗咪喹莫特(imq)诱导的 银屑病小鼠模型。(a)不同组(空白组、mcs、mir533)中所有皮肤样本的h&e 染色切片。(b)皮肤样品中tnf-α和il-6的mrna表达水平。(c)通过qpcr 检测皮肤样本中nf-κb及其靶基因的表达(n＝6只小鼠)。
45.图13为paav-dmp-mir533对ct-26细胞凋亡和活力的影响。ct-26细胞 经多种质粒转染后分别培养24、48、72h。(a)细胞凋亡流式细胞仪分析的代 表性图像。(b)细胞凋亡(n＝3孔)。(c)细胞活力(n＝3孔)。lipo，用 lipofectamine 2000处理的细胞。nt，用paav-dmp-nt转染的细胞；mir533， 用paav-dmp-mir533转染的细胞。
46.图14为paav-dmp-mir533对nih-3t3细胞凋亡和活力的影响。nih-3t3 在转染前用或不用tnf-α(终浓度为10ng/ml)诱导1小时。然后用各种质 粒转染nih-3t3细胞，然后分别培养24、48和72小时。(a)细胞凋亡流式细 胞仪分析的代表性图像。(b)细胞凋亡(n＝3孔)。(c)细胞活力(n＝3孔)。 nt，用paav-dmp-nt转染的细胞；mir533，用paav-dmp-mir533转染的 细胞。
47.图15为ct26和nih-3t3细胞中nf-κb及其靶基因表达检测。用 paav-dmp-mir533转染48小时。根据需要，在转染前对nih-3t3细胞使用终 浓度为10ng/ml的tnf-α诱导1小时。用去pcr检测ct26(a)和nih-3t3 (b)细胞中nf-κb及其靶基因的表达。lipo，用lipo2000处理的细胞。nt， 用paav-nt转染的细胞。mir533，用paav-dmp-mir533转染的细胞。
48.图16为用raav-dmp-mir533治疗关节炎小鼠。通过胶原(collagen)诱导 建立关节炎(cia)小鼠模型，并通过静脉注射raavs进行治疗(i.v.)。(a)cia 小鼠模型构建及治疗示意图。pbs，用磷酸盐缓冲盐水处理的健康组。(b)不同 组前后爪的代表性图片。(c)小鼠脾脏直观图。(d)脾重(n＝6只小鼠)。(e) 每组小鼠的平均体重(n＝6只小鼠)。(f)关节炎严重
程度的临床评分(n＝6只 小鼠)。(g)爪子厚度(n＝6只小鼠)。(h)脚踝厚度(n＝6只小鼠)。(i)尾 部宽度(n＝6只小鼠)。(j)elisa检测血清中tnf-α和il-6水平(n＝6只 小鼠)。(k)qpcr检测后爪样本中tnf-α和il-6的mrna水平(n＝6只小鼠)。 (l)后爪与踝关节的micro-ct成像。轮廓区域展示了高分辨的micro-ct成像 图。(m)代表性踝关节的h&e染色切片。比例尺：50μm。(n)踝关节的组织 病理学评分(n＝6只小鼠)。pbs组，用pbs治疗的正常小鼠；cia组，用pbs 治疗的cia小鼠；mtx组，用甲氨蝶呤(mtx)治疗的cia小鼠；nt组，用 raav-nt治疗的cia小鼠；mir533组，用raav-dmp-mir533治疗的cia小鼠。 ns，没有显著性差异。nt，无靶点的microrna。
49.图17为用raav-dmp-mir533治疗关节炎小鼠。通过胶原诱导建立胶原诱 导的关节炎(cia)小鼠模型，并通过静脉注射(i.v.)raavs进行治疗。不同组 (pbs、cia、nt、mtx、mir533)中所有小鼠的前爪和后爪照片(n＝6只小 鼠；pbs，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)治疗的正常小鼠；cia，用pbs治疗的cia 小鼠；mtx，用甲氨蝶呤(mtx)治疗的cia小鼠；nt，用raav-nt治疗 的cia小鼠；mir533，用raav-dmp-mir533治疗的cia小鼠。ns，不显著。 nt，无靶标。
50.图18为用raav-dmp-mir533治疗关节炎小鼠。通过胶原诱导建立胶原诱 导的关节炎(cia)小鼠模型，并通过静脉注射(i.v.)raavs进行治疗。(a) 所有小鼠踝关节的代表性h&e染色切片。比例尺：50μm。(b)qpcr检测到 后爪中nf-κb及其靶基因的表达(n＝6只小鼠)。pbs，用磷酸盐缓冲盐水(pbs) 治疗的正常小鼠；cia，用pbs治疗的cia小鼠；mtx，用甲氨蝶呤(mtx) 治疗的cia小鼠；nt，用raav-nt治疗的cia小鼠；mir533，用 raav-dmp-mir533治疗的cia小鼠。ns，不显著。nt，无靶标。
51.图19为用raav-dmp-mir533治疗关节炎小鼠。通过胶原诱导建立胶原诱 导的关节炎(cia)小鼠模型，并通过静脉注射(i.v.)raavs进行治疗。(a) 主要器官的代表性h&e染色部分。比例尺：100μm。(b)肝脏的血清生化指 标(n＝6只小鼠)。(c)肾脏血清生化指标(n＝6只小鼠)。pbs，用磷酸盐 缓冲盐水(pbs)治疗的正常小鼠；cia，用pbs治疗的cia小鼠；mtx， 用甲氨蝶呤(mtx)治疗的cia小鼠；nt，用raav-nt治疗的cia小鼠； mir533，用raav-dmp-mir533治疗的cia小鼠。ns，不显著。nt，无靶标。 alt，丙氨酸氨基转移酶；ast，天冬氨酸氨基转移酶；alp，碱性磷酸酶；bun， 血尿素氮；cr，肌酐；ua，尿酸。
52.图20为paav-dmp-mir533和paav-dmp-mir533-5对ct-26和 nih-3t3细胞凋亡和活力的影响。用各种质粒转染细胞，然后分别培养24、48 和72小时。(a)oa染色的hl7702细胞的代表性荧光图像。(b)细胞活力 (n＝3孔)。paav-dmp-mir533含有单拷贝dmp-mir533。 paav-dmp-mir533-5含有五拷贝dmp-mir533。(c)paav-dmp-mir533和 paav-dmp-mir533-5对ct-26和nih-3t3细胞凋亡和活力影响示意图。
具体实施方式
53.以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
54.实施例1
55.载体构建与病毒制备
56.载体构建：靶向人或鼠rela的microrna序列在block-it
tm
rnaidesigner网站上(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)设计(表1和 表2)。dmp-mir533片段从pdmp-mir533载体上扩增，然后使用mlui(上游) 和xbai(下游)限制性酶切位
点将其连接到paav-mcs载体(vpk-410，stratagene)上构建得到paav-dmp-mir533(图1)。cmv-egfp片段用一对引物扩增，其上游mlui和下游eocri酶切位点来自pegfp-c1(clontech)，然后将cmv-egfp片段克隆到paav-mcs中以获得载体paav-cmv-egfp(图1)。使用hieff
tm
pcrmastermix(withdye)(yeasen)对dna片段进行pcr扩增。用琼脂糖凝胶电泳和axyprepdna凝胶提取试剂盒(axygen)对pcr扩增得到的dna片段进行纯化回收。消化连接反应包含适当的限制性内切核酸酶(thermofisherscientific)和t4dna连接酶(thermofisherscientific)。通过将cmv-egfp片段构建到paav-dmp-mir533载体中得到质粒paav-dmp-mir533-cmv-egfp(图1)。作为阴性对照载体，根据质粒pcdna
tm
6.2-gw/emgfp-mir-neg(thermofisherscientific)的序列合成mir-nt片段，将其插入至pdmp-mir中，获得pdmp-nt质粒载体。从pdmp-nt拷贝dmp-nt片段并插入至paav-mcs中以获得paav-dmp-nt载体(图1)。所有质粒包括paav-mcs、paav-dmp-nt、paav-cmv-egfp、paav-dmp-mir533、paav-dmp-mir533-cmv-egfp、paav-helper和paav-rc都分别转染至大肠杆菌dh5α(tiangen)中并用endofreeplasmid试剂盒(cwbio)纯化。所有质粒均通过dna测序验证。本实施例中使用的寡核苷酸和引物由sangonbiotech(中国上海)合成(表2和表3)。
57.表1.mirna的靶序列
58.namemirna target(5
′‑3′
)human relacaaagatgggatgagaaaggamouse relatactcttgaaggtctcataggntgtctccacgcgcagtacattt
59.表2.用于构建mirna表达载体的寡核苷酸序列
[0060][0061]
细胞培养：实施例中使用的所有细胞系均来自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心，包括hek-293t(人胎肾细胞)、ht-29(人结肠癌细胞)、ct-26(小鼠结肠癌细胞)、hl7702(人正常肝细胞)、nih-3t3(小鼠胚胎成纤维细胞)。ht-29、ct-26、hl7702细胞在roswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640培养基(gibco)中培养。nih-3t3、hek-293t在dulbecco’smodifiedeaglemedium(dmem)培养基(gibco)中培养。所有培养基均添加终含量为10％的胎牛血清(hyclone)、100单位/ml的青霉素(thermofisher)和100μg/ml的链霉素(thermofisher)。所有细胞均在含有5％co2的37℃加湿培养箱中培养。
[0062]
病毒制备：hek-293t以每瓶5
×
106个细胞的密度接种到75cm2的培养瓶 中，培养24小时。然后根据说明书使用lipofectamine 2000(thermo fisher)对 两种辅助质粒(paav-helper和paav-rc；stratagene)和一种paav质粒 (paav-mcs、paav-dmp-nt、paav-dmp-mir533、 paav-dmp-mir533-cmv-egfp、paav-cmv-egfp)进行共转染。细胞继续培 养72小时后，将细胞和培养基收集并置于-80℃下保存过夜。随后将细胞和培 养基置于37℃水浴锅中孵育2小时。整个冻融过程重复3次。按1：10体积比 例将纯氯仿加入细胞冻融完的裂解液中，并使该混合物在37℃下剧烈振荡1小 时。震荡完后，向混合物中加入nacl至终浓度其为1摩尔并摇动至nacl溶解。 将溶解液置于4℃下以15,000转/分钟(rpm)离心15分钟，随后收集上清液， 加入终浓度为10％(w/v)的peg8000并摇动至其溶解。将反应物再在4℃下 以15,000rpm离心15分钟，弃去上清液，而后使沉淀溶解在pbs中。然后将 dnase和rnase加入溶解完的沉淀中，核酸酶终浓度为1μg/ml。反应物在室温 下温育30分钟。最后将温育完的试剂用氯仿(1:1体积)萃取一次，把含有纯化 病毒的水相转移到新的试管中。通过使用引物aav-f/r和qpcr检测确定aav 的滴度(表3)。病毒定量后，将其分装至-80℃保存备用。获得的病毒分别命名 为raav-mcs、raav-dmp-nt、raav-dmp-mir533、 raav-dmp-mir533-cmv-egfp和raav-cmv-egfp。
[0063]
nf-κb广泛过度活化于炎性细胞中，为了抑制nf-κb活性，本实施例设计 了一个名为raav-dmp-mir533的raav(图2a)，其中dmp是一个启动子， 由一个nf-κb诱骗子和一个最小启动子组成，而mir533则编码一段人工 microrna用于靶向nf-κb rela。当dmp-mir533转染人结肠癌细胞(ht-29)、 小鼠结肠癌细胞(ct-26)、tnfα诱导的人正常肝细胞(hl7702)和小鼠胚胎成 纤维细胞(nih-3t3)等炎性细胞时(图2b)，dmp将会与过度活化的nf-κb 结合，从而激活mir533的转录。而当nf-κb被mir533干扰抑制时，炎性细胞 因子(nf-κb靶基因)，如tnf-α和il-6表达量将会下调。因此，nf-κb的抑制 可进一步导致炎性细胞凋亡。相比之下，在正常细胞如人正常肝细胞(hl7702) 和小鼠胚胎成纤维细胞(nih-3t3)(图2b)中，dmp-mir533由于缺乏nf-κb 活性而无法发挥作用(图2a)。为了充分评估dmp-mir533在细胞和动物中的 抗炎作用，设计并制备了分别靶向人和小鼠nf-κb rela转录物的mir533(表 1)。人细胞用靶向人nf-κb rela的dmp-mir533处理，小鼠细胞和小鼠用靶 向小鼠nf-κb rela的dmp-mir533处理。
[0064]
本实施例中采用血清型aav2为重组腺相关病毒载体。本实例中用 paav-mcs载体(vpk-410，stratagene)插入功能性dna片段dmp-mir，并 使用两种辅助质粒paav-helper和paav-rc共转化293t细胞制备重组腺相关 病毒；上述三质粒系统所包装制备的重组腺相关病毒则为血清型aav2重组腺相 关病毒，因为在辅助质粒paav-rc上含有aav2的rep和cap基因。aav2具 有比较广泛的组织侵染能力，这样所构建的raav-dmp-mir533就可以通用性地 治疗发生不同组织器官的炎症，如本发明治疗的位于肠道组织的炎症结肠炎、位 于皮肤组织的炎症银屑病、位于关节组织的炎症关节炎。如果使用某种组织侵染 具有显著偏向性的血清型aav，如偏向神经组织的aav9，所构建的raav在治 疗不同组织器官的炎症时，就必须构建不同血清型的raav-dmp-mir533，过程 繁琐且成本高。此外，aav2也是天然腺相关病毒之一，经过长期于人类共存进 化，人体对这种aav具有极低的免疫原性，使其使用更安全。此外，aav2的 专利已经过期，在制备治疗试剂时不存在专利限制，有利于推广应用。
[0065]
实施例2
[0066]
炎性细胞处理
[0067]
将细胞(ht-29、ct-26、hl7702和nih-3t3)(1
×
105)接种到24孔板中， 37℃5％co2培养过夜。然后根据说明书，使用lipofectamine2000(thermo fisher) 将用各种实施例1制备的paav质粒(500ng/孔)转染至细胞内。转染后，细胞 分别培养24小时、48小时、72小时。如果需要，在转染前，先用终浓度为10ng/ml 的tnf-α(sigma-aldrich)诱导正常细胞1小时。随后根据说明书，使用吖啶橙 (solarbio)对细胞进行染色，其中活细胞呈现均匀的绿色。细胞用荧光显微镜 (ix51，olympus)成像，并用image-pro plus软件计数。
[0068]
细胞活力检测：同时使用cell counting kit-8(cck-8，yeasen)测定并分析 细胞活力。将细胞(ht-29、ct-26、hl7702和nih-3t3)(5
×
103)接种到96 孔板中，37℃5％co2培养过夜。然后使用lipofectamine 2000(thermo fisher) 将各种实施例1制备的paav质粒(200ng/孔)转染至细胞内。转染后，细胞分 别培养24小时、48小时、72小时。如果需要，在转染前，先用终浓度为10ng/ml 的tnf-α(sigma-aldrich)诱导正常细胞1小时。最后往细胞中加入cck-8试 剂(10μl/孔)并孵育1小时，使用酶标仪(biotek)在450nm处测量溶液吸 光度。
[0069]
细胞凋亡检测：将细胞(ht-29、ct-26、hl7702和nih-3t3)(5
×
105)接 种到6孔板中，37℃5％co2培养过夜。然后使用lipofectamine 2000(thermofisher)将各种实施例1制备的paav质粒(4μg/孔)转染至细胞内。转染后， 细胞分别培养24小时、48小时、72小时。如果需要，在转染前，先用终浓度为 10ng/ml的tnf-α(sigma-aldrich)诱导正常细胞1小时。然后根据制造商的说 明，通过使用annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒(vazyme)和流式细胞术 (calibur，bd，usa)检测分析定量细胞凋亡。
[0070]
细胞egfp荧光检测：将细胞(ht-29、ct-26、hl7702和nih-3t3)(5
×
103) 接种到96孔板中，37℃5％co2培养过夜。然后用各种实施例1制备的raav (5
×
107vg/孔)侵染细胞。侵染后，细胞培养48小时。如果需要，在侵染前， 先用终浓度为10ng/ml的tnf-α(sigma-aldrich)诱导正常细胞1小时。egfp 荧光用荧光显微镜(ix51,olympus)成像，并通过流式细胞术(calibur,bd,usa) 进行定量分析。同时使用annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术 检测细胞凋亡。
[0071]
基因表达的定量pcr(qpcr)检测：按照说明书的实验方案，使用trizol
tm (invitrogen)从培养的细胞和小鼠组织中分离总rna。随后用带有gdna eraser 的primescript
tm rt试剂盒(takara)生成互补的dna(cdna)。往样品中混入 fast sybr green master mix(roche)，然后在abi stepone plus仪器(appliedbiosystems)上，通过定量pcr(qpcr)检测cdna上靶基因的表达量。每个 样品均进行三次技术重复。相对mrna转录水平计算为2
–
δct or 2
–
δδct
，其中，δct ＝ct
target-ct
gadph
；δδct＝δct
treatment
–
δct
control
。2
–
δδct
也被定义为相对定量(rq)。 使用熔解曲线分析验证了所有qpcr引物(表3)的特异性。
[0072]
表3.用于qpcr的引物序列
[0073]
[0074]
[0075][0076]
数据统计分析：所有数据均表示为平均值
±
标准偏差(sd)，并通过graphpadprism 8.0软件进行统计分析和图表绘制。使用双尾student’s t检验确定两组之 间的统计差异。根据数据，三组或更多组则通过使用单向或双向方差分析 (anova)与tukey’s或sidak’s多重比较配对进行统计分析检验。p《0.05的差异 被认为具有统计学意义。
[0077]
结果：为了评估dmp-mir533系统杀死炎性细胞的可行性，首先选用nf-κb 过度活化的人结肠癌细胞(ht-29)作为实验对象，用paav-dmp-mir533转染 24小时至72小时。细胞的吖啶橙(ao)染色显示paav-dmp-mir533对ht-29 细胞具有显著的细胞毒性(图3a和3b)。细胞生长曲线还显示ht-29细胞的 生长被paav-dmp-mir533显著抑制(图3c)。同时，paav-mcs(空病毒载体) 对细胞的活力和生长均不产生影响(图3b和3c)。为进一步验证 paav-dmp-mir533的体外干扰效率，通过qpcr检测了nf-κb rela及其靶基 因的表达。结果表明，这些基因的表达被paav-dmp-mir533显著抑制，但在 lipofectamine(空白组)和paav-mcs组无变化(图3d)。这些数据表明 paav-dmp-mir533可以通过敲低nf-κb及其靶基因的表达来显著抑制nf-κb 过度活化的细胞生长。
[0078]
为了进一步探索paav-dmp-mir533是否对炎症有影响，用已知的nf-κb 诱导物tnf-α诱导人正常肝细胞(hl7702)，构建细胞炎性模型。同时以未用 tnf-α诱导的hl7702细胞作为对照。细胞的ao染色显示paav-dmp-mir533 对正常hl7702细胞没有明显影响，但经tnf-α诱导后，hl7702的细胞数量大 幅减少(图3e)。这些结果表明paav-dmp-mir533可以引起炎性细胞死亡， 但对非炎性的细胞作用不明显。
[0079]
为了在体内应用，将不同的dna片段包装到腺相关病毒(aav)中，以此 来构建raav-mcs、raav-cmv-egfp、raav-dmp-mir533和 raav-dmp-mir533-cmv-egfp(图1)。同时将cmv-egfp片段插入 raav-dmp-mir533以监测raav-dmp-mir533对细胞的侵染情况。以包含cmv 启动子，不插入任何目的基因的空病毒raav-mcs作为阴性对照。首先将包装 好的病毒分别侵染tnf-α处理和未处理的hl7702细胞。通过流式细胞术分析 egfp的表达和细胞凋亡情况。结果表明，egfp在 raav-dmp-mir533-cmv-egfp侵染的hl7702细胞与raav-cmv-egfp侵染的 细胞中具有相似的表达量(图4a和4b；图5)，这说明制备的病毒可以有效地 侵染细胞。此外，raav-dmp-mir533和raav-dmp-mir533-cmv-egfp均能诱 导被tnf-α诱导的hl7702细胞显著凋亡；然而，相同的侵染对正常的hl7702 细胞影响甚微(图4c和4d)。细胞活力测定进一步显示，只有 raav-dmp-mir533和raav-dmp-mir533-cmv-egfp的侵染能导致tnf-α诱导 的hl7702细胞活力大幅下降(图4e)。
[0080]
为了进一步验证raav-dmp-mir533感染炎性细胞凋亡的原理，用qpcr技 术检测了hl7702细胞中nf-κb rela及其靶基因的表达。结果表明，tnf-α显 著诱导了nf-κb rela及其靶基因的表达(图4f)。但是raav-dmp-mir533和 raav-dmp-mir533-cmv-egfp的侵染能够逆转这一现象(图4f)。总之， dmp-mir533可以抑制nf-κb rela的表达并进一步导致炎性细胞凋亡以及活 力降低，表明raav-dmp-mir533具有良好的体外抗炎作用。
[0081]
实施例3
[0082]
结肠炎模型的构建与治疗
[0083]
将购自cavens(中国)的balb/c小鼠随机分为4组(n＝6)，包括空白组、 葡聚糖硫酸钠(dss)、dss+mcs和dss+mir533组。空白组小鼠饮水，其他3 组小鼠的饮用水中含有3％葡聚糖硫酸钠(dss)(m.w＝36000-50000)(mp)。 在饮用含3％dss的水后的第3天和第5天，dss+mcs和dss+mir533组小鼠 分别静脉注射100μl 1
×
10
10
vg/ml raav-mcs和raav-dmp-mir533。每天测量 体重。第8天处死小鼠，分离肛门至回盲部的结肠并采血，同时测量每只小鼠的 结肠长度。结肠组织用于石蜡切片的制备和基因表达检测。切片用苏木精-伊红 (h&e)染色、成像和评分。结肠组织的病理学评分由其他与项目无关的技术 人员根据四个等级进行盲评打分：0分，无明显病理变化；1分，局灶性炎症细 胞浸润；2分，广泛的炎性细胞浸润；3分，弥漫性炎症细胞浸润；4分，炎症 细胞浸润，组织变性坏死，纤维结缔组织增生。
[0084]
血清中tnf-α和il-6水平的测定：根据elisa说明书，使用tnf-α(ab208348， abcam)和il-6elisa试剂盒(ab222503，abcam)对血清中tnf-α和il-6的水 平进行测定。
[0085]
组织切片的制备及苏木精和伊红(h&e)染色：对包括心脏、肝脏、脾脏、 肺、肾脏在内的小鼠组织依次进行解剖，石蜡包埋，切片，苏木精和伊红(h& e)染色处理。简而言之，首先将组织切块，然后将其在室温下置于4％多聚甲 醛溶液(sangon biotech，china)中固定过夜。随后，取出固定好的标本，依次 完成脱钙，石蜡包埋，组织切片，苏木精染色溶液(c0107，beyotime)和曙红 染色溶液(c0109，beyotime)染色实验步骤。最后用显微镜(ix51，olympus) 对制备的载玻片成像拍照。组织病理学评分由其他无关的研究人员盲评打分。
[0086]
基因表达的qpcr检测：同实施例2。
[0087]
数据统计分析：同实施例2。
[0088]
结果：为了评估dmp-mir533的体内抗炎作用，葡聚糖硫酸钠(dss)被用 于小鼠结肠炎模型的诱导构建(图6a)。如图6b所示，每天对4组小鼠的精神 状态和大便状态进行观察，发现空白组小鼠一切正常，粪便硬实，无血。而dss 诱导的小鼠逐渐变得迟钝和不活跃，饮用3％dss后的第3天，粪便性状由正常 变为湿软，第5天粪便明显带血，第7天肛门仍然出血。这些症状表明dss诱 导的急性结肠炎小鼠建模成功。随后用各种试剂处理小鼠。用raav-mcs处理 的dss诱导小鼠与用pbs处理的dss诱导小鼠的症状相似，两组小鼠粪便均变 软，出现血便。而用raav-mir533治疗后的dss诱导小鼠粪便状态明显改善和 肛门出血显著减少。体重的动态测量显示，用raav-mcs和pbs处理的急性结 肠炎小鼠体重减轻，而用raav-dmp-mir533治疗后的急性结肠炎小鼠体重增加 (图6c)。小鼠结肠长度测量结果表明dss诱导导致小鼠结肠长度变短(图6d 和6e)。只有经raav-dmp-mir533的治疗才能使小鼠结肠长度恢复(图6d和 6e)。结肠组织h&e染色切片进一步显示，dss诱导后小鼠结肠出现了明显的 炎症病理损伤，如黏膜结肠隐窝消失、杯状细胞丢失、细胞变性、明显致密淋巴 细胞浸润、中性粒细胞和浆细胞明显浸润等。然而，raav-dmp-mir533的治疗 逆转了这些损伤，例如小鼠结肠具有相对完整的粘膜层结构、明显的隐窝结构和 极为少量的中性粒细胞和浆细胞浸润(图6f和6g)。血清中典型促炎因子的 定量结果表明，dss能诱导血清中tnf-α和il-6的大幅升高(图6h)。 raav-dmp-mir533则显著降低了这两个因子的水平(图6h)。此
外，dss还使 nf-κb rela及其靶基因过度激活表达(图6i)；同样地，raav-dmp-mir533 的治疗大幅下调了这些基因的表达(图6i)。此外，上述动物实验，还开展了另 一个独立生物学重复并获得了相似的结果(图7)。总之，这些数据充分表明 raav-dmp-mir533在dss诱导的急性结肠炎小鼠中具有显著的体内抗炎作用。
[0089]
实施例4
[0090]
银屑病模型的构建与治疗
[0091]
对雄性balb/c(8周；cavens，中国)银屑病造模小鼠开展了两批动物实 验。首先将小鼠背部进行剃毛处理(剃毛面积约2.5cm
×
2.5cm)，之后随机分 为3组(n＝6)，包括空白组、mcs和mir533组。空白组小鼠用凡士林乳膏涂 抹处理。mcs和mir533组小鼠的背部剃毛处每天涂抹5％w/w咪喹莫特(imq) (中国四川明欣药业)，剂量为62.5mg/每只。
[0092]
第一批动物实验中，imq给药6天后，空白组和mcs组各处死3只小鼠(n ＝3)，采集皮肤和血液样本。mcs组(n＝3)和mir533组(n＝6)的剩余小鼠 分别静脉注射100μl 1
×
10
10
vg/ml raav-mcs和raav-dmp-mir533。mcs和 mir533组的小鼠每天仍保持5％w/w的imq涂抹。空白组的小鼠继续采用凡士 林乳膏处理。持续6天后，处死所有小鼠并收集皮肤和血液样品，随后分别采用 rt-qpcr和elisa试剂盒检测皮肤和血清样品中tnf-α和il-6的表达水平。同 时，在另一只银屑病模型小鼠(n＝1)上尝试了raav-dmp-mir533的皮下给药 (i.h.)和外用药(外用)(ad us.ext.)治疗。银屑病模型小鼠每天进行皮下注射 或涂抹100μl 1
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10
10
vg/ml raav-dmp-mir533治疗。持续6天，处死小鼠，样 品采集和检测与之前的静脉注射实验相同。
[0093]
在5％w/w imq造模后的第二批动物实验中，分别对mcs组和mir533组 小鼠(n＝6)的背部剃毛区域涂抹100μl的1
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10
10
vg/ml raav-mcs和 raav-dmp-mir533，持续6天。类似地，mcs和mir533组的小鼠每天继续涂 抹5％w/w imq。空白组一直涂抹凡士林乳膏直至安乐死。在第12天处死所有 小鼠并拍照，同时收集背部皮肤和血液样品。每天监测和记录小鼠的体重和银屑 病面积和严重程度指数(pasi)。每只小鼠皮肤上的红斑、鳞屑和厚度从0到4 分别进行独立评分：0，无；1、轻微；2、适中；3、显著；4、极为显著。三个 指标的总和表示炎症的严重程度(评分，0-12)。
[0094]
血清中tnf-α和il-6水平的测定：同实施例3。
[0095]
组织切片的制备及h&e染色：同实施例3。
[0096]
基因表达的qpcr检测：同实施例2。
[0097]
数据统计分析：同实施例2。
[0098]
结果：为了进一步证实raav-dmp-mir533的体内抗炎作用，使用咪喹莫特 (imq)诱导构建小鼠银屑病模型，并用多种试剂尝试治疗(图8a)。在小鼠 剃毛的背部皮肤上连续涂抹imq，六天后小鼠皮肤出现了发红、发炎、发痒、 皮肤增厚以及银色鳞屑等症状(图8b)。随后分别对imq诱导的银屑病小鼠静 脉注射pbs、raav-mcs和raav-dmp-mir533。结果表明，raav-mcs的治疗 没有病理损伤恢复的效果；而raav-dmp-mir533的治疗使小鼠受损的皮肤明显 接近了pbs处理的健康小鼠(健康组)(图8b)。皮肤组织切片的h&e染色也 显示出imq诱导的小鼠皮肤有明显的脓肿、角化过度和炎症细胞浸润等病理特 征；而raav-dmp-mir533的处理能显著使皮肤恢复(图8c、8d和8e；图9a)。 血清促炎因子的检测表明imq诱导后，tnf-α和il-6水平升高(图8f)。而 raav-dmp-mir533的治疗大幅降低了血清中这两个因
子的水平(图8f)。皮肤 中基因表达的检测表明，imq显著激活了tnf-α、il-6、nf-κb rela及其靶基 因的表达(图8g和图9b)。但经raav-dmp-mir533治疗后，这些基因则被 显著抑制(图8g和图9b)。这些数据说明raav-dmp-mir533的静脉注射对 小鼠银屑病具有不错的疗效。
[0099]
为了寻找其他给药方式，还对一只imq诱导的银屑病小鼠分别进行了皮下 注射和皮肤涂抹给药治疗。结果表明，两种给药方式均获得了与上述静脉注射相 似的治疗效果(图10)，包括皮肤恢复(图10a和10b)、血清促炎因子(图10c) 以及nf-κb rela及其靶基因的表达下调(图10d)。考虑到更好的治疗效果 和给药便利性，选取皮肤涂抹给药方式进行了放大治疗，包含更多的小鼠个体(n ＝6)(图11a)。银屑病小鼠分别用凡士林和混合在凡士林中的raav-dmp-mir533 进行连续6天皮肤给药治疗(图11a)。结果显示，raav-dmp-mir533皮肤涂 抹给药方式获得了良好的治疗效果，包括皮肤外观恢复(图11b)、低银屑病面 积和严重程度指数(pasi)(图11c)、皮肤组织结构愈合(图11d和11e；图 12a)，脾肿大改善(图11f和11g)，体重增加(图11h)，血清中tnf-α和 il-6水平降低(图11i)，以及皮肤组织中tnf-α，il-6(图12b)和nf-κb rela 及其靶基因显著下调(图12c)。总之，这些结果充分证明raav-dmp-mir533 在imq诱导的银屑病小鼠中具有良好的体内抗炎疗效。
[0100]
实施例5
[0101]
关节炎模型的构建与治疗
[0102]
30只雄性的dba/1j小鼠(8周；cavens，中国)被随机分为5组，其中一 组仅注射pbs(n＝6)作为健康组对照。通过双重免疫建立胶原诱导关节炎(cia) 小鼠模型。对于第一次免疫，小鼠在尾部皮内注射等体积的鸡ii型胶原溶液(2 mg/ml)和完全弗氏佐剂(2mg/ml)(chondrex,redmond,wa,usa)。第一次 免疫21天后，用不完全弗氏佐剂(chondrex，redmond，wa，usa)乳化鸡ii 型胶原溶液，在与第一次免疫不同的位置对小鼠尾部进行免疫加强注射。对每只 小鼠的所有爪子进行评分来定性疾病：0，正常；1、轻度肿胀和红斑局限于中足 和踝关节；2、轻度肿胀和红斑延伸至足中部和踝关节；3、从跖骨关节到脚踝有 中度肿胀和红斑；4、脚、脚踝和手指严重肿胀和红斑。每只小鼠的临床评分是 四只爪子的评分总和。
[0103]
cia小鼠分为四个实验组：(1)cia组：cia小鼠注射pbs作为对照组(iv； n＝6)；(2)mtx治疗组：cia小鼠注射mtx(1mg/kg)，隔日给药，共6次 (iv；n＝6)；(3)nt治疗组：cia小鼠每隔一天静脉注射raav-nt(1
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109vg/ 小鼠；n＝6)，共3次；(4)mir533治疗组：cia小鼠每隔一天静脉注射 raav-dmp-mir533(1
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109vg/小鼠；n＝6)，共3次。小鼠的体重和临床评分每 隔一天进行监测和评估。用游标卡尺测量小鼠脚踝宽度、爪子厚度和尾部厚度。 所有小鼠在mtx或nt或mir533给药4周后被安乐死并拍照，同时采集各组 血清标本进行生化指标检测。采用elisa试剂盒检测后爪和血清样品中tnf-α 和il-6的表达水平。收集包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的组织用于h&e 染色分析。对所有小鼠的脾脏进行拍照和称重。踝关节组织用于后续的h&e染 色分析和基因表达检测，其组织病理学评分由其他无关的技术人员根据以下四个 等级盲评打分：0，正常滑膜；1、存在滑膜肥大和细胞侵袭；2、存在血管翳和 软骨糜烂；3、存在软骨和软骨下骨侵蚀；4、整个关节的功能障碍和僵硬。
[0104]
血清中tnf-α和il-6水平的测定：同实施例3。
[0105]
组织切片的制备及h&e染色：同实施例3。本实验还额外对小鼠爪子(包 括踝关节)
组织进行解剖处理。
[0106]
组织切片的制备及h&e染色：同实施例2。
[0107]
基因表达的qpcr检测：同实施例2。
[0108]
数据统计分析：同实施例2。
[0109]
微型ct(micro-ct)：处死所有dba/1j小鼠并收集它们的爪子(包括踝关 节)，使用体内微型ct扫描仪(vivact 80,scanco medical ag,switzerland) 对其进行微型ct成像(micro-ct)。高分辨率断层图像的重建和分析在scancogpu accelerated reconstruction系统中进行。
[0110]
结果：在上述细胞和小鼠实验中，paav-mcs和raav-mcs分别用作 paav-dmp-mir533和raav-dmp-mir533的阴性对照。为了给dmp-mir533提 供更合适的阴性对照，构建了一种新的载体dmp-nt，该载体编码了一个对人类 和小鼠基因组均无靶标(nt)的microrna。为了评估该载体，小鼠结肠癌细胞 (ct26)分别用paav-dmp-mir533和paav-dmp-nt转染。结果显示 paav-dmp-mir533对ct26的细胞生长产生了显著抑制并诱导了细胞凋亡(图 13a-13c)；而paav-dmp-nt对细胞的生长和凋亡没有显著影响(图13a-13c)。 为了进一步评估这两种载体，用这两种载体分别转染正常小鼠胚胎成纤维细胞 (nih-3t3)。结果表明，两种载体均未诱导细胞发生明显的细胞凋亡和生长抑 制(图14a-14c)。然而，当细胞被tnf-α诱导后，paav-dmp-mir533会诱导 细胞产生显著凋亡和生长抑制(图14a-14c)。paav-dmp-nt仍然对受到tnf-α 诱导的细胞没有影响(图14a-14c)。qpcr检测还显示paav-dmp-mir533显 著抑制了ct26和tnf-α诱导的nih-3t3的nf-κb rela及其靶基因的表达(图 15a和15b)；而paav-dmp-nt对两种细胞中的基因表达均没有影响(图15a 和15b)。总之，这些结果表明dmp-mir533通过抑制nf-κb活性产生了体外 抗炎作用。此外，将无细胞毒性的paav-dmp-nt包装到aav中来制备 raav-dmp-nt，并以raav-dmp-nt作为对应的阴性对照来进一步评估 raav-dmp-mir533的体内抗炎作用。
[0111]
类风湿性关节炎(ra)是一种以关节病变为主的慢性自身免疫性疾病。通 过双重免疫建立了胶原诱导的关节炎(cia)小鼠模型，用于ra治疗研究(图 16a)。在初次免疫后的第28天，cia小鼠被随机分为4组(n＝6)，分别静脉 注射pbs、甲氨蝶呤溶液(mtx)，raav-dmp-nt，和raav-dmp-mir533。健 康组小鼠仅静脉注射pbs作为健康对照(n＝6)。在第46天，对所有小鼠实施 安乐死。爪子(包括踝关节)的成像显示，raav-dmp-mir533获得了比mtx 更好的治疗效果(图16b和图17)。同时，raav-dmp-mir533的治疗使cia 小鼠恢复了正常的脾脏体积和重量，而mtx治疗后小鼠脾肿大的情况比cia模 型鼠更加严重(图16c和16d)。此外，raav-dmp-mir533治疗后小鼠体重维 持稳定，mtx治疗则使小鼠体重减轻(图16e)。小鼠病理变化的动态测量显示， raav-dmp-mir533和mtx的治疗均显著改善了临床评分(图16f)、爪子厚度 (图16g)和脚踝宽度(图16h)。值得注意的是，只有raav-dmp-mir533的 治疗使小鼠尾部宽度接近健康小鼠(图16i)。cia模型组中，血清促炎因子tnf-α 和il-6水平显著升高；raav-dmp-mir533和mtx均能显着降低血清中这两种 因子的水平(图16j)。但raav-dmp-mir533具有比mtx更好的疗效(图16j)。 这些治疗效果也通过后爪组织中这两种因子mrna的表达水平得到证实(图 16k)。更令人信服的是，小鼠后爪的micro-ct成像显示，cia小鼠的踝关节和 指关节具有严重的骨侵蚀现象(图16l)。而经raav-dmp-mir533治疗后，小 鼠骨侵蚀现象得到大大改善，且疗效明显优于mtx(图16l)。h&e染色和关 节组织病
理学评估的结果也支持了这一结论(图16m和16n；图18a)。cia 小鼠具有大量的血管翳、严重的骨破坏、广泛的软骨损伤、炎症细胞浸润等病理 特征，raav-dmp-mir533和mtx治疗均显著改善了这些病理变化。相比之下， raav-dmp-mir533的治疗更为突出。此外，raav-dmp-mir533的治疗还显著 抑制了前爪中nf-κb rela及其靶基因的表达(图18b)。mtx的治疗则不调 控这些基因的表达(图18b)，表明炎性细胞仍然存在。值得关注的是，在上述 所有实验中，raav-dmp-nt均没有显示出治疗效果(图16和图18)。主要器 官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的h&e切片染色表明raav-dmp-mir533 明显改善了cia建模所致的组织损伤，尤其是肺损伤(图19a)。而mtx则不 显著，甚至对肝脏和脾脏造成了一定损伤和坏死(图19a)。最后，对在第46 天收集的血清进行生化指标检测，数据进一步表明raav-dmp-mir533对这些生 化指标没有产生影响，具有良好的生物安全性(图19b)。而经mtx治疗后， 小鼠血清中alt、ast和alp普遍升高，表明其具有肝毒性(图19c)。总之， 这些结果证明了raav-dmp-mir533在胶原诱导的关节炎小鼠中具有良好的体内 抗炎作用。
[0112]
实施例6
[0113]
多拷贝dmp-mir533的抗炎效果
[0114]
为了进一步探讨增加dmp-mir533拷贝数对raav-dmp-mir533抗炎效果的 影响，还构建了一个含有5拷贝dmp-mir533的raav包装质粒 paav-dmp-mir533-5。用此质粒和含有单拷贝dmp-mir533的raav包装质粒 paav-dmp-mir533平行转染ct-26和nih-3t3。转染方法同实施例2。观察两 种质粒转染对两种细胞凋亡和活力的影响。结果表明，相较于 paav-dmp-mir533，paav-dmp-mir533-5进一步显著提高了对炎性细胞ct-26 的促凋亡效果和抑制其生长活力(图20)，而仍然对正常细胞nih-3t3的凋亡和 活力不产生显著影响(图20)。由此可以推断用paav-dmp-mir533-5包装的含 有5拷贝dmp-mir533的raav-dmp-mir533病毒，在体内应有更好的抗炎效果。