球虫抗原肽/IL5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途的制作方法

球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的制备及用途
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种食品级枯草芽孢杆菌(不含耐药基因)预防和治疗禽球虫病的球虫抗原肽/il5与枯草芽孢杆菌分泌肽融合蛋白、融合基因、表达载体及其基因工程菌。


背景技术：

2.球虫病每年给我国畜禽养殖带来数十亿的损失，目前主要依靠抗生素来抑制球虫爆发，但不能解决根本问题。抗生素的使用造成耐药性增加，养殖成本升高。兽药残留危害人类健康。
3.为了对付球虫等原虫寄生虫的耐药性问题，世界上每1～2年就必需推出一种新药。随着人们对环境与健康要求的不断提高，研制新药的费用越来越高，使许多制药公司已放弃了新药的研制。另一个必须认识的事实是，几乎没有一种药是完美无缺的，很多药物不仅有毒副作用，而且其在肉、蛋内的残留也危及人的健康。为此，规定了一定的停药期限。这使得养禽者和科研人员面临着一个严重的问题，即在停药期间如何避免球虫病的暴发。因此，急需一种安全高效的球虫病等原虫预防类药物，口服球虫疫苗是理想的选择，安全高效，制作简单，成本低廉，拌料口服节约注射人工等诸多优势。
4.国外对球虫生物工程苗的研究已进行了不少工作，并获得了裂殖子、子孢子、折光体及棒状体的多种抗原，为重组球虫苗和亚单位球虫苗的研制提供了可能性。现有的研究表明，用重组抗原免疫鸡只能提供部分保护力，其保护水平还不足以抵抗毒力虫株的侵袭。因此生物工程球虫苗要想达到商业应用，还必须解决许多问题，如保护力的提高，制苗费用的降低等等。
5.目前，我国农业农村部印发《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》农办牧【2021】43号文件指出，转基因发酵制品生产菌株应不具有获得性耐药、不产生临床相关抗菌药物、无致病性/产毒能力、遗传修饰未引入/改变关注基因，且在发酵制品中未检出生产菌株重组dna的生产菌株判定为无危害，发酵制品无生产菌株引起的风险。具有获得性耐药的生产菌株判定为具有危害。若发酵制品生产菌株携带获得性耐药基因，并在发酵制品中检测到耐药基因的完整dna片段，则发酵制品对靶动物和暴露物种具有风险，不建议该菌株用于发酵制品的生产；若发酵制品中未检出生产菌株相关耐药基因dna片段，则认为不具有风险。因此要求转基因菌株中，转入dna片段不含耐药基因。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种食品级球虫抗原肽/il5的融合蛋白及分泌表达该融合蛋白的基因工程菌，用于预防和治疗家畜细菌性腹泻，解决现有球虫病疫苗保护力不高的问题。
7.本发明的技术方案为：球虫抗原肽/il5的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列为：
8.miqkrkrtvsfrlvlmctllfvslpitktsaavgssrvdvpggsgddddkmrthlyfllltvgisatplrsnlaelqtwlqqiyqsvdmlnlrietpvsaddenciktlfegtallknnpemrrfgtffqsfdklrpsltaqltgegecdterknvkkfieklrtfirklsrdarvgsgddddkshgmvmcanaedkssvellqgsggaymqlsrrggdaafdekevgsgggaggdggagggtggsgeeegsgnglsvdetikvtsagwtksegsgssssccallqlekqdleqslgsgfndsqrqatkdagtiaglnvgsgalndpvvyndravsfvalyngsgawdtsvkewlvdtgkvyagggsgawdtsvkewlvdtgkvyagggsgrltvrgglqekeavkvtanggsgsdaleywkgglsqfndkippgsggrissyytsplllsgtcslsgsgnpsssatadcrvvtctqtntgsgkasqrdfqllkhltrwynhmgsgaevaaacatkasaeaalltggsgfypsyhstpqrp(seq id no:1)。
9.上述氨基酸序列中：
10.miqkrkrtvsfrlvlmctllfvslpitktsaavgssrvdvpg为信号肽序列。
11.mrthlyfllltvgisatplrsnlaelqtwlqqiyqsvdmlnlrietpvsaddenciktlfegtallknnpemrrfgtffqsfdklrpsltaqltgegecdterknvkkfieklrtfirklsrdarv为il5序列片段。
12.shgmvmcanaedkssvellq,gaymqlsrrggdaafdekev,ggaggdggagggtgeee,nglsvdetikvtsagwtkse,ssssccallqlekqdleqsl,fndsqrqatkdagtiaglnv,alndpvvyndravsfvalyn,awdtsvkewlvdtgkvyagg,awdtsvkewlvdtgkvyagg,rltvrgglqekeavkvtang,sdaleywkgglsqfndkipp,grissyytsplllsgtcsls,npsssatadcrvvtctqtnt,kasqrdfqllkhltrwynhm,aevaaacatkasaeaalltg为抗原基因蛋白预测片段，通过gsg连接，具有较高的免疫原性。
13.fypsyhstpqrp为树突细胞诱导肽，帮助抗原靶向树突细胞，提高抗原被免疫细胞吞噬的可能性。
14.本发明的融合蛋白通过gsgddddk氨基酸序列链接，gsgddddk在枯草芽孢杆菌外周蛋白酶切割成独立的活性结构域，利用gsgddddk氨基酸柔性序列保护了抗原多肽与白细胞介素5的独立折叠，gsgddddk氨基酸序列保障该融合蛋白能够有效的被分泌蛋白酶激酶切割识别。有效地保障了球虫抗原肽/il5在肠黏膜层释放，抑杀肠道内病原微生物，调节免疫应答，同时，球虫抗原肽/il5能够通过m细胞调节肠系膜淋巴结(p氏小结)内部的淋巴细胞。
15.本发明的球虫抗原肽/il5的基因参照ncbi－gene bank数据库的基因序列。该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点，通过自动分割位点的碱基片断连接球虫抗原肽/il5蛋白，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。
16.编码球虫抗原肽/il5的融合蛋白的碱基序列。
17.进一步地，所述碱基序列为：
18.atgatccaaaaacgtaaacgtacagtttctttccgtcttgttcttatgtgcacacttcttttcgtttctcttcctatcacaaaaacatctgctgctgttggctcttctcgtgttgatgttcctggcggctctggcgatgatgatgataaaatgcgtacacatctttacttccttcttcttacagttggcatctctgctacacctcttcgttctaaccttgctgaacttcaaacatggcttcaacaaatctaccaatctgttgatatgcttaaccttcgtatcgaaacacctgtttctgctgatgatgaaaactgcatcaaaacacttttcgaaggcacagctcttcttaaaaacaaccctgaaatgcgtcgtttcggcacattcttccaatctttcgataaacttcgtccttctcttacagctcaacttacaggcgaaggcgaatgcgatacagaacgtaaaaacgttaaaaaattcatcgaaaaacttcgtacattcatccgtaaactttctcgtgatgctcgtgttggctctggcgatgatgatgataaatctcatggcatggttatgtgcgctaacgctgaagataaatcttctgtt
gaacttcttcaaggctctggcggcgcttacatgcaactttctcgtcgtggcggcgatgctgctttcgatgaaaaagaagttggctctggcggcggcgctggcggcgatggcggcgctggcggcggcacaggcggctctggcgaagaagaaggctctggcaacggcctttctgttgatgaaacaatcaaagttacatctgctggctggacaaaatctgaaggctctggctcttcttcttcttgctgcgctcttcttcaacttgaaaaacaagatcttgaacaatctcttggctctggcttcaacgattctcaacgtcaagctacaaaagatgctggcacaatcgctggccttaacgttggctctggcgctcttaacgatcctgttgtttacaacgatcgtgctgtttctttcgttgctctttacaacggctctggcgcttgggatacatctgttaaagaatggcttgttgatacaggcaaagtttacgctggcggcggctctggcgcttgggatacatctgttaaagaatggcttgttgatacaggcaaagtttacgctggcggcggctctggccgtcttacagttcgtggcggccttcaagaaaaagaagctgttaaagttacagctaacggcggctctggctctgatgctcttgaatactggaaaggcggcctttctcaattcaacgataaaatccctcctggctctggcggccgtatctcttcttactacacatctcctcttcttctttctggcacatgctctctttctggctctggcaacccttcttcttctgctacagctgattgccgtgttgttacatgcacacaaacaaacacaggctctggcaaagcttctcaacgtgatttccaacttcttaaacatcttacacgttggtacaaccatatgggctctggcgctgaagttgctgctgcttgcgctacaaaagcttctgctgaagctgctcttcttacaggcggctctggcttctacccttcttaccattctacacctcaacgtcct(seq id no.2)。
19.表达载体，含有编码球虫抗原肽/il5的融合蛋白的碱基序列或seq id no.2所示的碱基序列。
20.进一步地，所述的表达载体为质粒plasmid 2021，图谱如图2所示。dna序列如seq id no.4所示。该表达质粒能够去除在克隆过程中所使用的amp抗性基因片段。通过ecorⅰ，可实现酶切去除amp基因。
21.一种含有上述所述的表达载体的基因工程菌。
22.进一步地，所述的基因工程菌为枯草芽孢杆菌bs168/wxp，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24234。该菌株为枯草芽孢杆菌bs168的改进表达分泌型菌株，该菌株将多余的蛋白水解酶基因敲除掉，有利于分泌蛋白的稳定性。其基因型为：npre apre epr bpr mpr::ble nprb::bsrδvpr wpra::hyg cm::neo ydcde::pxyl-ycde；neor。
23.本发明的球虫抗原肽/il5的融合蛋白或上述所述的基因工程菌在制备预防或/和治疗家畜球虫感染药物上的应用。
24.本发明球虫抗原肽/il5的融合蛋白基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
25.1)以seq id no.3所示的dna片段为模板，以seq id no.5(gcggtaccgagctcgctcgag)和seq id no.6(tgcagcggctagcccctcgagtca)所示的核苷酸序列为引物，pcr扩增，得到融合基因扩增片段；
26.2)采用xholⅰ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；所述载体质粒plasmid 2021的dna序列如seq id no.4所示。
27.3)将连接产物转化大肠杆菌杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到融合基因表达载体。进一步地，步骤2)中，采用xholⅰ酶切。
28.进一步地，步骤2)中，所述载体为质粒plasmid 2021。
29.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30.本发明的融合蛋白对禽球虫具有显著预防和治疗调节作用。食品级枯草芽孢杆菌
表达的多肽复合物通过黏膜免疫引起动物肠道的获得性免疫应答，产生抗球虫的抗体。白细胞介素5是嗜酸性粒细胞激活因子，可以激活肠道的嗜酸性粒细胞，分泌抗寄生虫活性物质，修复由于球虫感染引起的肠道黏膜受损。
31.本发明的重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌不含任何抗性基因，符合农业部转基因工程菌的新产品认证要求。该菌可以在肠道定殖，持续表达抗原片段及免疫激活多肽，核心功能为预防球虫感染，作为类似口服疫苗的产品，具有使用方便，可以在饲料及饮水中作为日常添加。
附图说明
32.图1：为pcr片段电泳图片，重组质粒构建图片；m0：marker dl5000；m1：重组基因ct-amp1与载体质粒，m2：构建好的融合基因质粒；
33.图2：plasmid 2021质粒图谱；
34.图3：嵌合体抗原结构分析；
35.图4：为重组融合蛋白亲水性分析；
36.图5：禽抗球虫实验肉鸡存活对比；
37.图6：禽抗球虫实验肉鸡平均重量对比；
38.图7：禽抗球虫实验肉鸡相对增重率对比；
39.图8：禽抗球虫实验肉鸡抗球虫抗体效价对比。
具体实施方式
40.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
41.本发明用到的生物材料
42.质粒plasmid 2021来自于pht43，具有amp抗性，改造主要是在amp的两端引入ecor i酶切位点。在大肠杆菌克隆完成后可以通过ecor i酶切，去掉氨苄抗性基因，从而在芽孢杆菌电转化后无抗性基因残留其中。质粒图谱见图2，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
43.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)bs168/wxp，于2022年1月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24234。
44.实施例1
45.球虫抗原肽/il5的融合蛋白，氨基酸序列如seqid no.1所示，通过球虫抗原肽/il5的融合基因的表达得到。该氨基酸序列中：
46.miqkrkrtvsfrlvlmctllfvslpitktsaavgssrvdvpg为信号肽序列。
47.mrthlyfllltvgisatplrsnlaelqtwlqqiyqsvdmlnlrietpvsaddenciktlfegtallknnpemrrfgtffqsfdklrpsltaqltgegecdterknvkkfieklrtfirklsrdarv为il5序列片段。
48.shgmvmcanaedkssvellq,gaymqlsrrggdaafdekev,ggaggdggagggtgeee,nglsvdetikvtsagwtkse,ssssccallqlekqdleqsl,fndsqrqatkdagtiaglnv,alndpvvyndravsfvalyn,awdtsvkewlvdtgkvyagg,awdtsvkewlvdtgkvyagg,rltvrgglqekeavkvtang,sdaleywkgglsqfndkipp,grissyytsplllsgtcsls,npsssatadcrvvtctqtnt,kasqrdfqllkhltrwynhm,aevaaacatkasaeaalltg为抗原基因蛋白
预测片段，通过gsg连接，具有较高的免疫原性。
49.fypsyhstpqrp为树突细胞诱导肽，帮助抗原靶向树突细胞，提高抗原被免疫细胞吞噬的可能性。
50.球虫抗原肽/il5的基因参照ncbi－gene bank数据库的基因序列。该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点，通过自动分割位点的碱基片断连接球虫抗原肽/il5蛋白，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。
51.实施例2编码球虫抗原肽/il5的融合蛋白的融合基因的合成
52.编码球虫抗原肽/il5的融合蛋白的融合基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
53.当将真核基因克隆在原核生物中表达时，需将真核生物偏爱的密码子改为原核生物(枯草芽孢杆菌)偏爱的密码子，才能实现高效表达。本发明根据相应细胞的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化，设计得到核苷酸序列seq id no.2。
54.本实施例的融合基因以脱氧核糖核苷酸为底物，在dna合成仪上合成目标序列的核苷酸片段。
55.实施例3球虫抗原肽/il5的融合蛋白编码基因表达载体的构建
56.为了与质粒载体连接，在编码序列上下游分别设计了同源臂序列和酶切位点。即在seq id no.2所述核苷酸序列的上游增加gcggtaccgagctcgctcgag，在下游增加tgactcgaggggctagccgctgca。改进后的核苷酸序列如seq id no.3所示。在dna合成仪上合成目标序列的核苷酸片段。
57.1)以seq id no.3所示的dna片段为模板，以seq id no.5
58.(gcggtaccgagctcgctcgag)和seq id no.6
59.(tgcagcggctagcccctcgagtca)所示的核苷酸序列为引物，pcr扩增，得到融合基因扩增片段；
60.2)采用xholⅰ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；所述载体质粒plasmid 2021的dna序列如seq id no.4所示。
61.3)将连接产物转化大肠杆菌杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到融合基因表达载体。
62.pcr扩增条件：
63.94℃1min
64.(94℃10s，52℃10s，68℃10s)5cycles
65.(94℃10s，68℃15s)30cycles
66.68℃1min
67.酶切体系：xholⅰ酶切q buffer(购自fermentals)1μl xholⅰ，10μl 2x q buffer，9μl ddh2o 16℃10min。
68.实施例4重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌的构建
69.将实施例3得到的融合基因的表达载体用ecorⅰ酶切，酶切后的片段电泳分离，大片段继续用t4连接酶连接后得到无抗性基因残留的质粒与融合蛋白基因，然后电转枯草芽孢杆菌bs168/wxp，该菌株保藏编号为cgmcc no.24234。该菌株由bs168枯草芽孢杆菌驯化得到，其主要特点是芽孢萌发加速，2-3小时即可见到菌体。
70.实验试剂：
71.gm:lb+0.5m山梨醇
72.etm:0.5m山梨醇，0.5m甘露醇，10％甘油
73.rm：lb+0.5m山梨醇+0.38甘露醇
74.电转仪：新芝基因导入仪
75.电转具体方法如下：
76.1)新鲜平板挑枯草芽孢杆菌bs168/wxp单菌落(小一点为好)接种于5ml lb培养基中，过夜培养。
77.2)测量摇管内od，控制好接种量，使接种完毕后培养基的od在0.19-0.2之间。培养基为
78.50mlgm。37℃，200rpm培养至od600＝1.0(大约3-4小时)左右。
79.3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm 8min 4℃离心收集菌体。
80.4)用40ml预冷的电转缓冲液etm洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。
81.5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的etm中，每管分装60μl。
82.6)将60μl感受态细胞中加入1-6μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪设置：2.0kv,25μf200ω，1mm,电击1次.(持续时间4.5ms-5ms之间)
83.7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基rm，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。
84.实施例5：重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌的生产工艺
85.菌种转生产种子
86.培养基：
87.(1)lb培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，蒸馏水1000ml，ph为7，(可溶性淀粉20g)琼脂20g。
88.(2)种子培养基：lb培养基+k2hpo
4 0.8％，ph：7.0-7.5。
89.培养条件：
90.转速220转每分，温度37-39℃；
91.培养时间：8-12小时；
92.表1
[0093][0094]
种子培养超过12小时，菌种形态变短，部分自融(抗菌肽低表达积累)，部分转芽孢，整体菌数下降，不利于接种。
[0095]
液体发酵：
[0096]
大罐发酵培养基1：lb培养基：工业蛋白胨10g，工业酵母膏5g，工业nacl 10g，工业
葡萄糖2-5g蒸馏水1000ml，ph为7。
[0097]
大罐发酵培养基2：豆饼粉5.6％，玉米粉7.2％，k2hpo
4 0.8％，(nh4)2so
4 0.4％，nh4cl0.13％，cacl
2 0.13％，mnso
4 0.2％，mgso
4 0.2％；
[0098]
大罐发酵培养基1用于固体发酵所需液体菌种，发酵时间一般为12-16小时，根据菌体生长状态调节；
[0099]
大罐发酵培养基2主要用于直接发酵，用于诱导芽孢形成，培养时间一般为24-36小时。罐压：0.05mpa，通气量/培养量＝1:1.2～1:1.5(l/分钟：/l)。
[0100]
实施例6：
[0101]
实验单位：成都市华科生物学研究中心
[0102]
实验分组情况：
[0103]
表2
[0104][0105]
饲养条件：
[0106]
严格按照肉鸡饲养管理与质量控制技术饲喂流程，重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌添加剂量为每吨料添加1kg，饲料中无任何抗生素及药品添加。攻毒毒株柔嫩艾美耳球虫来源于球虫及坏死性肠炎高发病鸡场。
[0107]
实验时间：2019.09.10—2019.10.10
[0108]
主要观察指标：
[0109]
添加组及攻毒组存活率；
[0110]
2，各组在饲养周期内增重情况；
[0111]
实验结果：
[0112]
存活率统计：
[0113]
表3：饲喂四周小鸡存活数率
[0114][0115][0116]
从表3及图5可以看出，采用无抗饲料，小鸡自然死亡率达到16％，而添加重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌的阳性对照组死亡率仅4％。在攻毒后，无添加组存活率仅为30％，用于发病后的治疗组存活率为52％。
[0117]
表4：各组不同时间相对增重比值及差异标注
[0118][0119]
从表4及图6、图7可以看出，与阴性对照组相比，添加重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌的组在第一周体重即有显著增加。在实验最后，1日龄开始持续添加的两组体重超过对照组约10％，而15日龄及以后添加的攻毒组体重较对照组减少15-20％。1日龄开始添加组较15日龄及攻毒以后添加组体重相差30％以上。
[0120]
表5通过球虫抗体检测试剂盒检测艾美耳球虫的抗体保护水平
[0121]
抗体效价14天29天c-/-0.5780.698c+/-0.674.356s1-/+0.784.987s2+/+0.7788.95s3+/+0.6636.432s4+/+0.4786.896
[0122]
抗体水平s2组最高，主要是由于1日龄预防使用本产品，在15日龄攻毒，相当于二次加强接种，因此抗体水平最高，如图8所示。c+/-组能有效的产生抗体。抗体水平略低于野毒攻毒产生的水平。同时与球虫抗原攻毒使用，可以有效的保护感染期的损伤。
[0123]
上述实验说明：重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌具有促进肉鸡生长的性能，与
球虫发病组差异可达30％；重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌在1日龄开始添加对预防球虫及腹泻有显著效果，保护率可达94％；重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌对于治疗经球虫感染发病的效果一般，保护率仅为52％；重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌对于预防交叉感染及控制球虫传播保护率可达74％；重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌能诱导机体产生大量保护性抗体，有效保护禽球虫感染。
[0124]
本发明的重组球虫抗原肽/il5枯草芽孢杆菌不含任何抗性基因，符合农业部转基因工程菌的新产品认证要求。该菌可以在肠道定殖，持续表达抗原片段及免疫激活多肽，核心功能为预防球虫感染，作为类似口服疫苗的产品，具有使用方便，可以在饲料及饮水中作为日常添加。