一种生产3,4-二羟基苯乙醇的温敏型重组菌株及应用的制作方法

1.本发明涉及一种生产3,4-二羟基苯乙醇的温敏型重组菌株及应用，属于基因工程领域。


背景技术：

2.3,4-二羟基苯乙醇是一种天然多酚类化合物，具有很强的抗氧化活性，主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中，具有抗癌、抗血栓、调血脂和抗动脉硬化、抗病原微生物、防治视网膜黄斑变性、保护软骨和抗骨质疏松等多方面的药理作用。
3.大多以生物合成技术生产3,4-二羟基苯乙醇，主要采用重组质粒通过诱导的方式异源表达目的基因；当目的基因在菌株正常生长时是沉默状态，若不进行诱导，目的基因则不能表达目的蛋白，若培养体系中有乳糖或乳糖类似物存在时，则目的基因开始正常表达，翻译出目的蛋白。
4.目前，绝大多数的大肠杆菌诱导方式是乳糖类似物异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg），但由于iptg价格高昂且使用过程不宜回收再利用，提高了3,4-二羟基苯乙醇的生产成本，另外iptg的毒性限制了菌株的大规模发酵生产。为此，本发明提供了一种生产3,4-二羟基苯乙醇的温敏型重组菌株及应用。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种生产3,4-二羟基苯乙醇的温敏型重组菌株及应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种生产3,4-二羟基苯乙醇的温敏型重组菌株，是先将hpabc目的基因pcr产物与线性化温敏型质粒载体连接，后转化导入xl1感受态细胞获取含有hpabc目的重组质粒，再将含有hpabc目的重组质粒导入宿主菌株感受态细胞中构建获得。
7.本发明还提供了一种生产3,4-二羟基苯乙醇的温敏型重组菌株的构建方法，包括以下步骤：s1、温敏型重组质粒的构建s1.1、以温敏型质粒为模板，使用引物ⅰ进行pcr扩增，后经消化酶dpni消化，得到线性化温敏型质粒载体；s1.2、以含有hpabc目的基因的质粒为模板，使用引物ⅱ进行pcr扩增，获得hpabc目的基因pcr产物；s1.3、将线性化温敏型质粒载体和hpabc目的基因pcr产物通过试剂盒连接，得到连接产物，取10μl连接产物转化导入50~100μl的xl1感受态细胞，待培养基上长出单菌落时挑取单菌落，通过质粒提取试剂盒抽提质粒，获得含有hpabc目的基因的温敏型重组质粒；s2、温敏型重组菌株的构建s2.1、取0.2~5μl含有hpabc目的温敏型重组质粒，加入50~100μl宿主菌株感受态
细胞中，先冰浴30min，再在42℃水浴中热敷60s进行热休克处理，立即冰浴2min，接着加入1ml的lb液体培养基，在37℃下培养1h使菌体复苏，获得复苏细胞液；s2.2、将复苏细胞液均匀涂布在lb琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养，待长出菌落后挑取单菌落，置于2~5ml的lb液体培养基上，再在37℃下培养12~16h，获得温敏型重组菌株。
8.其中，lb液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，ph 7.0，其余为纯水；其中，lb琼脂糖平板的配方：每升培养基，蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，琼脂20g，ph 7.0，其余为纯水。
9.优选地，温敏型质粒为pbv220、pob、pcali2的一种，其中，pbv220的核苷酸序列为seqidno.1所示，pob的核苷酸序列为seqidno.2所示，pcali2的核苷酸序列为seqidno.3所示。
10.其中，当温敏型质粒为pbv220时，引物ⅰ为pbv220-i-f/pbv220-i-r，所述pbv220-i-f的核苷酸序列为seqidno.5所示，pbv220-i-r的核苷酸序列为seqidno.6所示；引物ⅱ为pbv220-hpabc-f/pbv220-hpabc-r，所述pbv220-hpabc-f的核苷酸序列为seqidno.7所示，pbv220-hpabc-r的核苷酸序列为seqidno.8所示。
11.其中，当温敏型质粒为pob时，引物ⅰ为pob-i-f/pob-i-r，所述pob-i-f的核苷酸序列为seqidno.9所示，pob-i-r的核苷酸序列为seqidno.10所示；引物ⅱ为pob-hpabc-f/pob-hpabc-r，所述pob-hpabc-f的核苷酸序列为seqidno.11所示，pob-hpabc-r的核苷酸序列为seqidno.12所示。
12.其中，当温敏型质粒为pcali2时，引物ⅰ为pcali2-i-f/pob-i-r，所述pcali2-i-f的核苷酸序列为seqidno.13所示，pcali2-i-r的核苷酸序列为seqidno.14所示；引物ⅱ为pcali2-hpabc-f/pcali2-hpabc-r，所述pcali2-hpabc-f的核苷酸序列为seqidno.15所示，pcali2-hpabc-r的核苷酸序列为seqidno.16所示。
13.优选地，所述hpabc目的基因的核苷酸序列为seqidno.4所示。
14.优选地，宿主菌株感受态细胞为大肠杆菌bl21、大肠杆菌w3110、大肠杆菌mg1655的一种。
15.本发明还提供了一种生产3,4-二羟基苯乙醇的温敏型重组菌株发酵液的培养方法，步骤如下：将温敏型重组菌株按照体积比为1%的接种量接种于50~200ml的tb液体培养基中，在温度30℃、转速220rpm下培养，当细胞od600达到0.2~1.2，迅速转移至35~45℃、诱导表达2~12h，获得温敏型重组菌株发酵液。
16.其中，tb液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨11.8 g、酵母提取物23.6 g、k2hpo
4 9.4 g、kh2po
4 2.2 g、甘油4 ml，其余为纯水。
17.本发明还提供了一种温敏型重组菌株发酵液制备3,4-二羟基苯乙醇的方法，步骤如下：将温敏型重组菌株发酵液置于温度4℃、转速4000rpm下离心收集细胞，获得温敏型重组菌体，将干重量2g的温敏型重组菌体置于10ml磷酸盐缓冲液中，再加入1~10g/l的酪醇、1~6g/l的甲酸铵，在30~45℃反应，反应2-20h后，获得3,4-二羟基苯乙醇；其中，磷酸盐缓冲液的配方：每100ml，磷酸二氢钾0.68g，0.1mol/l氢氧化钠溶液
29.1ml，其余为纯水，ph 7.0。
18.本发明的有益效果：本发明以温敏型质粒为模板获取线性化载体，以hpabc目的基因为模板获取hpabc目的基因pcr产物，线性化载体与hpabc目的基因pcr产物连接，再转化导入xl1感受态细胞获取含有hpabc目的重组质粒，再导入宿主菌株感受态细胞中构建获得温敏型重组菌株；同时使用本发明的温敏型重组菌株培养生产3,4-二羟基苯乙醇的发酵液，使得目的基因表达由化学诱导转换为物理诱导，通过温度变化控制，解决现有的iptg价格高昂且使用过程不宜回收再利用的问题，降低了生产成本；本发明培养温敏型重组菌株发酵液的方法，避免了诱导剂的毒性存在；本发明的温敏型重组菌株，过程便于操作，节能环保，为工业发酵生产奠定了坚实的基础。
附图说明
19.图1为本发明的线性化温敏型质粒pbv220载体和hpabc目的基因pcr产物的连接产物的核酸电泳图。
20.图2为本发明的3,4-二羟基苯乙醇反应流程。
具体实施方式
21.为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。
22.实施例1 温敏型重组质粒的构建构建过程，步骤1：以表1中任一所示的温敏型质粒为模板，使用表1中与温敏型质粒对应的引物ⅰ进行pcr扩增，后经消化酶dpni消化，得到线性化温敏型质粒载体；步骤2：以含有核苷酸序列为seqidno.4所示的hpabc目的基因的质粒为模板，使用表1中与温敏型质粒对应的引物ⅱ进行pcr扩增，获得hpabc目的基因pcr产物；步骤3：将线性化温敏型质粒载体和hpabc目的基因pcr产物通过takara公司的in-fusion的试剂盒连接，得到连接产物，取10μl连接产物转化导入50~100μl的xl1感受态细胞，待培养基上长出单菌落时挑取单菌落，通过质粒提取试剂盒抽提质粒，获得含有hpabc目的基因的温敏型重组质粒，如表1所示。
23.表1
实施例2 温敏型重组菌株的构建构建过程，步骤1：取0.2~5μl表1中任意一种的含有hpabc目的温敏型重组质粒，加入50~100μl表2中任意一种的宿主菌株感受态细胞中，先冰浴30min，再在42℃水浴中热敷60s进行热休克处理，立即冰浴2min，接着加入1ml的lb液体培养基，在37℃下培养1h使菌体复苏，获得复苏细胞液；步骤2：将复苏细胞液均匀涂布在lb琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养，待长出菌落后挑取单菌落，置于2~5ml的lb液体培养基上，再在37℃下培养12~16h，待长出菌落后挑取单菌落，获得温敏型重组菌株；其中，lb液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，ph 7.0，其余为纯水；lb琼脂糖平板的配方：每升培养基，蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，琼脂20g，ph 7.0，其余为纯水。
24.表2序号123宿主菌株感受态细胞大肠杆菌bl21大肠杆菌w3110大肠杆菌mg1655实施例3 温敏型重组菌株发酵的培养培养过程，步骤如下：将温敏型重组菌株按照体积比为1%的接种量接种于50~200ml的tb液体培养基中，在温度30℃、转速220rpm下培养，当细胞od600达到0.2~1.2，迅速转移至35~45℃、诱导表达2~12h，获得温敏型重组菌株发酵液；其中，tb液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨11.8 g、酵母提取物23.6 g、k2hpo
4 9.4 g、kh2po
4 2.2 g、甘油4 ml，其余为纯水。
25.实施例4 温敏型重组菌株发酵液制备3,4-二羟基苯乙醇制备过程，步骤如下：将温敏型重组菌株发酵液置于温度4℃、转速4000rpm下离心收集细胞，获得温敏型重组菌体，将干重量2g的温敏型重组菌体置于10ml磷酸盐缓冲液中，
再加入1~10g/l的酪醇、1~6g/l的甲酸铵，在30~45℃反应，反应2~20h后，获得3,4-二羟基苯乙醇；磷酸盐缓冲液的配方：每100ml，磷酸二氢钾0.68g，0.1mol/l氢氧化钠溶液29.1ml，其余为纯水，ph 7.0。
26.实施例5~实施例9 由温敏型质粒和目的基因到3,4-二羟基苯乙醇的制备该实例5~实施例9的步骤过程从实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5按顺序依次进行，不同如表3所示，获得产物3,4-二羟基苯乙醇，结果如表3所示。
27.表3从表3中发现，选用pbv220作为温敏型质粒载体，培养获取的温敏型重组菌株催化酪醇合成获得的3,4-二羟基苯乙醇量更高，优选温敏型质粒pbv220。
28.最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。