一种利用胞外聚合物抑制抗生素抗性基因转化的方法

1.本发明涉及一种抗生素抗性基因风险控制方法，具体是一种利用胞外聚合物抑制抗生素抗性基因转化的方法，属于抗生素抗性基因风险控制领域。


背景技术：

2.由于抗生素被广泛应用于人类疾病治疗和畜牧养殖，抗生素抗性在全球范围传播，引起了抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，args)在环境中的普遍存在和传播。args被认定为一种新兴污染物，在河流、湖泊、海洋、土壤和污水厂等地方均检测到args的存在。args可以通过水平基因转移，实现抗生素抗性的传播。水平基因转移包括接合，转导和转化三种方式，接合和转导主要由胞内args介导，而转化是由胞外args介导。
3.由于胞外args具有浓度高，存在时间久和容易迁移的特点，args的转化风险很高。转化是通过将args直接转入到细胞内部来实现的。从污水厂出水排入环境中的args被环境中的感受态细胞摄取后，会在细胞中表达出抗生素抗性，完成抗生素抗性的传播。因此，如何抑制args在环境中的转化，已经成为一项新的重要研究课题。
4.胞外聚合物(extracellularpolymeric substances，eps)是通过细胞裂解或细胞分泌而产生的由腐殖质(humic acid，ha)，多糖(polysaccharide，ps)和蛋白质(protein，pn)组成的复杂高分子量混合物。eps存在于细胞外部，对微生物聚集体的吸附和传质有着至关重要的作用。由于eps存在于细胞外部，args进入胞内转化的过程必然会受到eps的影响，args和eps之间的相互作用可能会改变其转化能力。此外，eps的组分(如ha、ps和pn)及其氧化还原状态可能会对args的转化产生不同的影响。在不同的环境条件下(如厌氧、缺氧和好氧条件)，不同微生物聚集体(如生物膜、絮凝物和颗粒)的eps组分和氧化还原状态可能存在差异。例如，颗粒污泥eps中的蛋白质含量普遍高于絮体污泥，因为污泥颗粒化的实现需要大量的eps蛋白质参与。厌氧或好氧环境中eps氧化还原状态的差异也会导致eps官能团的差异，可能会导致args和eps之间的相互作用发生变化，从而影响转化过程。因此，本发明设计一种args风险控制方法，利用eps抑制args转化，并同时验证了eps的组分和氧化还原状态对args转化抑制作用的影响。


技术实现要素：

5.本发明针对上述现有技术所存在的问题，提供了一种利用eps抑制args转化的方法。本方法能够抑制args的转化，降低args的传播风险。
6.本发明利用eps抑制args转化的方法，是在含有感受态菌和args的微生物培养体系中加入eps，以抑制args通过转化方式进入微生物胞内。此外，也可将eps组分和不同氧化还原状态的eps分别加入微生物培养体系，抑制args的转化过程。
7.所述胞外聚合物组分为腐殖质(ha)、多糖(ps)或蛋白质(pn)。所述腐殖质、多糖以及蛋白质在实验过程中分别用腐植酸、海藻酸钠和牛血清白蛋白模拟。
8.所述不同氧化还原状态的eps通过电化学方法获得，利用电化学工作站分别对eps
进行氧化或还原获得氧化态和还原态的eps。
9.在微生物培养体系中分别加入eps组分以及不同氧化还原状态的eps后，体系中eps组分的终浓度为0.1-10mg/l，不同氧化还原状态的eps的终浓度为10mg/l。
10.所述eps来源于曝气池活性污泥，为活性污泥经加热提取后获得的产物；具体是通过包括如下步骤的方法获得：从污水厂取样获得活性污泥，将活性污泥用nacl溶液清洗两次之后，在一定温度下进行加热提取，然后高速离心获得上清液；所得上清液经过膜过滤获得滤液；将滤液冷冻干燥即可获得eps。
11.所述nacl溶液的浓度为0.9％。
12.所述加热提取的温度为60℃，提取时间为60min。
13.所述高速离心的离心转速为10000rpm，时间为10min。
14.所述膜过滤采用0.22-μm的醋酸纤维膜。
15.所述冷冻干燥的温度为-50℃，时间为48h。
16.所述感受态菌为大肠杆菌(e.coli trans5α)；所述args为携带有四环素抗性的pbr322质粒。
17.所述微生物培养体系中含有lb培养基，lb培养基组分为：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物和10g/lnacl。
18.本发明通过向微生物培养体系中加入eps，抑制args进入细胞内部的过程，从而达到抑制args转化的效果。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
20.本发明通过对eps的研究，将其直接加入微生物体系，抑制args通过转化进入微生物细胞内。eps通过与args结合减少进入微生物胞内的args含量，并且eps的存在同时降低了微生物细胞膜的通透性，进一步降低进入胞内的args含量，从而显著抑制args的转化。
附图说明
21.图1为本发明添加eps与未添加eps对args转化的影响。
22.图2为本发明添加eps与未添加eps转化菌落示意图。
23.图3为本发明添加ha、ps和pn对args转化的影响。
24.图4为本发明添加氧化态或还原态eps对args转化的影响。
具体实施方式
25.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。
26.本发明通过对eps的研究，将其直接加入微生物体系，抑制args通过转化进入微生物细胞内。eps通过与args结合减少进入微生物胞内的args含量，并且eps的存在同时降低了微生物细胞膜的通透性，进一步降低进入胞内的args含量，从而显著抑制args的转化。
27.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
28.实施例1：
29.eps的制备：
30.选取的eps制备原料为污水厂活性污泥。
31.首先将40ml污泥样品8000rpm离心5min，去掉上清液；接着清洗污泥，即加入10ml0.9％nacl溶液震荡混匀，8000rpm离心5min，重复上一清洗步骤，去掉上清液，保留污泥；另外再加入10ml 0.9％nacl溶液，震荡均匀后，在60℃加热60min，然后10000rpm离心10min；将获得的上清液过0.22-μm醋酸纤维膜，滤液用冷冻干燥仪置于-50℃下冷冻干燥48h获得eps。
32.感受态菌和args的制备：
33.本实施例中以大肠杆菌(e.coli trans5α)作为感受态菌，从全式金生物公司购买，转化过程中lb培养基为e.coli生长基质。args由携带有四环素抗性的质粒(pbr322)提供，从上海生工公司购买。
34.lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l；
35.lb固体培养基配方：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂粉15g/l。
36.在锥形瓶中按上述配方配置好两种lb培养基后，将锥形瓶置于高压灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌完毕后备用。
37.取灭菌后的lb固体培养基，转移至超净工作台中，冷却后加入四环素溶液，最终混合溶液中四环素浓度为10mg/l。在超净工作台完成固体平板的制作，得到抗性平板。同时，本实施例还制备了一组不添加四环素的无抗性平板。
38.args在eps体系下的转化实验：
39.将10μleps加入到50μl感受态细胞体系中，eps的终浓度设置为10mg/l，静置30min，再加入10μl 0.2ng/μl的质粒(含有四环素抗性)，静置30min后，42℃水浴热激45s，迅速放回冰中放置2min左右，注意不要晃动，添加700μl不含抗生素的液体培养基，混合均匀。37℃振荡培养1h(160-225rpm)，稀释合适倍数后，吸取适量体积分别均匀涂布到含和不含四环素的lb琼脂培养基平板上，37℃正置至液体被吸收，然后倒置过夜培养。培养完毕后，对平板上的菌落进行计数(图1)。另外，单独添加超纯水至感受态细胞中进行转化实验并将其作为对照组。
40.eps体系下的args转化率如图2所示。args转化率数值是在抗性平板上长出的菌落数除以在无抗性平板上长出的菌落数的结果，具体计算如下：
41.转化率＝抗性平板菌落数(transformants)/无抗性平板菌落数(totalbacteria)
42.当eps的浓度为10mg/l时，添加eps体系的转化率为(1.11
±
0.16)
×
10-4
transformants/total bacteria，未添加eps体系的转化率为(6.90
±
0.14)
×
10-4
transformants/total bacteria，添加eps导致转化率显著下降了83.9％。以上结果表明，eps可以抑制args的转化。
43.实施例2：不同组分eps对于转化的抑制
44.ha、ps和pn的制备：
45.分别用腐植酸、海藻酸钠和牛血清白蛋白模拟ha、ps和pn。
46.感受态菌和args的制备：
47.本实施例中以大肠杆菌(e.coli trans5α)作为感受态菌，从全式金生物公司购买，转化过程中lb培养基为e.coli生长基质。args由携带有四环素抗性的质粒(pbr322)提供，从上海生工公司购买。
48.lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l；
49.lb固体培养基配方：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂粉15g/l。
50.在锥形瓶中按上述配方配置好两种lb培养基后，将锥形瓶置于高压灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌完毕后备用。
51.取灭菌后的lb固体培养基，转移至超净工作台中，冷却后加入四环素溶液，最终混合溶液中四环素浓度为10mg/l。在超净工作台完成固体平板的制作，得到抗性平板。同时，本实施例还制备了一组不添加四环素的无抗性平板。
52.args在ha、ps和pn影响下的转化实验：
53.将10μlha、ps和pn分别加入到50μl感受态细胞体系中，ha、ps和pn的终浓度均设置为0.1-10mg/l，静置30min，再加入10μl 0.2ng/μl的质粒(含有四环素抗性)，静置30min后，42℃水浴热激45s，迅速放回冰中放置2min左右，注意不要晃动，添加700μl不含抗生素的液体培养基，混合均匀。37℃振荡培养1h(160-225rpm)，稀释合适倍数后，吸取适量体积分别均匀涂布到含和不含四环素的lb琼脂培养基平板上，37℃正置至液体被吸收，然后倒置过夜培养。培养完毕后，对平板上的菌落进行计数(图1)。另外，单独添加超纯水至感受态细胞中进行转化实验并将其作为对照组，并用对照组的数据对实验组的转化率进行归一化处理(％ofcontrol)。
54.eps组分影响下的args转化率如图3所示。args转化率数值是在抗性平板上长出的菌落数除以在无抗性平板上长出的菌落数的结果，具体计算如下：
55.转化率＝抗性平板菌落数(transformants)/无抗性平板菌落数(totalbacteria)
56.当ha的浓度为0.1mg/l时，添加ha体系的转化率为对照组的49.4％，当ha的浓度为1mg/l时，添加ha体系的转化率为对照组的44.6％，当ha的浓度为10mg/l时，添加ha体系的转化率为对照组的9.6％。
57.当ps的浓度为0.1mg/l时，添加ps体系的转化率为对照组的89.7％，当ps的浓度为1mg/l时，添加ps体系的转化率为对照组的51.2％，当ps的浓度为10mg/l时，添加ps体系的转化率为对照组的23.6％。
58.当pn的浓度为0.1mg/l时，添加pn体系的转化率为对照组的88.0％，当pn的浓度为1mg/l时，添加pn体系的转化率为对照组的47.7％，当pn的浓度为10mg/l时，添加pn体系的转化率为对照组的31.6％。
59.添加ha、ps或pn导致转化率明显下降。以上结果表明，eps的不同组分均可抑制args的转化。
60.实施例3：不同氧化还原状态eps对于转化的抑制
61.氧化态和还原态eps的制备：
62.使用三电极池将eps在
±
0.7v的电化学工作站(chi600e；美国ch instruments公司)分别氧化或还原12h，以铂片和ag/agcl作为对电极和参比电极，以碳纸(1cm
×
2cm)作为工作电极，分别获得氧化态和还原态的eps。
63.感受态菌和args的制备：
64.本实施例中以大肠杆菌(e.coli trans5α)作为感受态菌，从全式金生物公司购买，转化过程中lb培养基为e.coli生长基质。抗生素抗性基因由携带有四环素抗性的质粒(pbr322)提供，从上海生工公司购买。
65.lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l；
66.lb固体培养基配方：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂粉15g/l。
67.在锥形瓶中按上述配方配置好两种lb培养基后，将锥形瓶置于高压灭菌锅中，121℃灭菌20min，灭菌完毕后备用。
68.取灭菌后的lb固体培养基，转移至超净工作台中，冷却后加入四环素溶液，最终混合溶液中四环素浓度为10mg/l。在超净工作台完成固体平板的制作，得到抗性平板。同时，本实施例还制备了一组不添加四环素的无抗性平板。
69.args在氧化态和还原态eps体系下的转化实验：
70.将10μl氧化态和还原态eps分别加入到50μl感受态细胞体系中，氧化态或还原态eps的终浓度均设置为10mg/l，静置30min，再加入10μl 0.2ng/μl的质粒(含有四环素抗性)，静置30min后，42℃水浴热激45s，迅速放回冰中放置2min左右，注意不要晃动，添加700μl不含抗生素的液体培养基，混合均匀。37℃振荡培养1h(160-225rpm)，稀释合适倍数后，吸取适量体积分别均匀涂布到含和不含四环素的lb琼脂培养基平板上，37℃正置至液体被吸收，然后倒置过夜培养。培养完毕后，对平板上的菌落进行计数(图1)。另外，单独添加超纯水至感受态细胞中进行转化实验并将其作为对照组，并用对照组的数据对实验组的转化率进行归一化处理(％ofcontrol)。
71.还原态或氧化态eps影响下的args转化率如图2所示。args转化率数值是在抗性平板上长出的菌落数除以在无抗性平板上长出的菌落数的结果，具体计算如下：
72.转化率＝抗性平板菌落数(transformants)/无抗性平板菌落数(totalbacteria)
73.当添加氧化态eps时，其转化率为对照组的73.6％，当添加原始eps时，其转化率为对照组的29.2％，添加还原态eps时，其转化率为对照组的22.2％。不论是氧化态、原始的或还原态eps均会导致转化率明显下降。以上结果表明，不同氧化还原状态的eps均可抑制args的转化。
74.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。