烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物的合成方法

本发明属于生物，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物的合成方法。

背景技术：

1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad+)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadp+)及其相应的还原态nadh和nadph在生物体内作为一类重要的电子载体参与生物体内众多的氧化还原反应，如糖酵解、tca循环等。在生物体中，辅因子nad+还可以作为多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(parps)、环adp核糖合酶(cadpr synthases)、去乙酰化酶(sirtuins)等酶的底物而参与生物体内不同生理过程的调控。近年来，随着绿色合成概念的提出，辅因子nad(p)+/nad(p)h依赖型生物催化系统的开发和应用受到了人们越来越多的关注，而研究结果表明辅因子的高效供给是生物合成体系发展的关键限制因素之一。

2、回顾过往研究，在生物体内辅因子nad+主要有三种不同的从头合成方式。在植物、大部分细菌和古菌生物体内，基于天冬氨酸的从头代谢途径被用于nad+合成；在真菌和哺乳动物等真核生物以及某些细菌体内，起始于色氨酸的犬尿酸代谢途径被用于nad+的从头合成；另外，研究人员通过合成生物学手段开发出了一条起始于分支酸的人工设计nad+合成途径c3n途径。途径分析可以发现上述三条nad+合成途径均经过共同的中间代谢物喹啉酸，然后经由三步共通的代谢途径：喹啉酸磷酸核糖转移酶，烟酸单核苷酸腺苷酰基转移酶和nad+合酶后合成nad+。但是，在部分生物体中喹啉酸可以经过喹啉酸磷酸核糖转移酶，烟酰胺单核苷酸合酶和烟酰胺单核苷酸腺苷酰基转移酶的催化而合成nad+。此外，除了这些从头合成途径之外，部分食物来源或nad+降解产物如烟酸，烟酰胺和烟酰胺单核苷酸等均可以借助不同的nad+回补途径而被用于nad+的合成。

3、在高滴度nad+合成体系的开发过程中，基于代谢工程思路的途径调控，前体补给和酶工程等策略的应用在实际研究中面临着多种制约。如在利用天冬氨酸和色氨酸途径进行nad+细胞合成体系的设计中，nad+的合成与生物体蛋白合成之间激烈的氨基酸竞争会造成生长受限，同时调控网络的复杂性和中间代谢物的细胞毒性等会进一步限制nad+的高效合成。人工设计的c3n途径虽可高效合成nad+，但是部分途径酶学效率低和中间代谢物的过度积累等问题同样限制了其在nad+合成中的应用。在nad+体外合成体系的开发过程中，高化学计量atp的添加，高耗时的酶制备和反应组分的不稳定性等因素而造成其整体成本过高和效率过低而限制了它的进一步开发；而化学合成基本没有研究。因此，拓展nad+的生物合成方法以实现简约、高效的nad+生物合成仍然是亟须解决的问题。

技术实现思路

1、本发明通过对nad+合成途径的生物信息学分析，合成途径的理性再设计和关键酶系的挖掘与筛选构建了一条简约高效的nad+合成新通路，并在一定程度上规避了上述不同nad+合成方式中存在的限制因素。

2、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物具体可包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad+)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadp+)及其相应的还原态nadh和nadph。

3、本发明的目的之一在于提供一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成方法。

4、本发明提供了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成方法，包括如下步骤：

5、(a)制备喹啉酸；

6、(b)喹啉酸在喹啉酸磷酸核糖转移酶的催化下生成烟酸单核苷酸；

7、(c)利用烟酸单核苷酸完成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备。

8、步骤(a)包括如下步骤：

9、(1)以邻氨基苯甲酸为起始物，经过3-位羟基化合成3-羟基邻氨基苯甲酸；

10、(2)3-羟基邻氨基苯甲酸通过氧化开环和自发重排反应后生成喹啉酸。

11、本发明还提供了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的合成方法，包括如下步骤：

12、(i)按照上述的方法制备得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

13、(ii)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶催化下与atp反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。

14、本发明还提供了一种喹啉酸的合成方法，包括如下步骤：

15、(1)以邻氨基苯甲酸为起始物，经过3-位羟基化合成3-羟基邻氨基苯甲酸；

16、(2)3-羟基邻氨基苯甲酸通过氧化开环和自发重排反应后生成喹啉酸。

17、可选地，如上述的方法，

18、所述步骤(1)中，采用邻氨基苯甲酸3-单加氧酶催化邻氨基苯甲酸生成3-羟基邻氨基苯甲酸；

19、所述步骤(2)中，采用3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶催化3-羟基邻氨基苯甲酸的氧化开环重排反应生成喹啉酸。

20、步骤(1)还可包括采用fad还原酶催化fad生成fadh2。步骤(1)所需的fadh2也可通过其它方式获得。

21、可选地，如上述的方法，所述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶为邻氨基苯甲酸3-单加氧酶a或邻氨基苯甲酸3-单加氧酶b。

22、所述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶a是如下任一种蛋白质：

23、a1)氨基酸序列为seq id no.8的蛋白质；

24、a2)将seq id no.8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

25、a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有70％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

26、a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白，例如氨基酸序列为seq id no.9的蛋白质。

27、所述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶b是如下任一种蛋白质：

28、b1)氨基酸序列为seq id no.10的蛋白质；

29、b2)将seq id no.10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

30、b3)与b1)-b2)中任一所限定的氨基酸序列具有70％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

31、b4)在b1)-b3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

32、如下任一一种试剂在催化邻氨基苯甲酸生成3-羟基邻氨基苯甲酸中的应用也属于本发明的保护范围之内，

33、(1)包含上述的邻氨基苯甲酸3-单加氧酶的试剂；

34、(2)包含上述的邻氨基苯甲酸3-单加氧酶相关生物材料的试剂；

35、(3)包含上述的邻氨基苯甲酸3-单加氧酶和fad还原酶的试剂；

36、所述相关生物材料为如下任一种：

37、b1)编码上述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶的核酸分子；

38、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

39、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；

40、b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

41、b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

42、b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

43、b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

44、b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

45、b9)含有b1)所述核酸分子的重组细胞；

46、b10)含有b2)所述表达盒的重组细胞；

47、b11)含有b3)所述重组载体的重组细胞；

48、b12)含有b4)所述重组载体的重组细胞。

49、b1)所述的核酸分子可为如下任一种：

50、1)核苷酸序列是序列表中seq id no.1或seq id no.2所示的dna分子；

51、2)核苷酸序列是序列表中seq id no.3所示的dna分子；

52、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有70％或70％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的dna分子；

53、4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码具有相同功能的蛋白质的dna分子。

54、可选地，b3)所述的重组载体为具有seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示的dna分子的质粒，例如下述实施例制备的pab1s-han-bmq或pab1a-han-gtn。

55、可选地，b7)所述的重组微生物为具有seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示的dna分子的重组微生物，例如下述实施例制备的kn-ha-echpac或kn-ha-echpac-g。

56、可选地，fad还原酶为如下任一种蛋白质：

57、1)氨基酸序列为seq id no.12或seq id no.13的蛋白质；

58、2)将seq id no.12或seq id no.13所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

59、3)与1)-2)中任一所限定的氨基酸序列具有70％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

60、4)在1)-3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

61、fad还原酶的编码基因可为如下任一种：

62、1)核苷酸序列是序列表中seq id no.5或seq id no.6所示的dna分子；

63、2)与1)限定的核苷酸序列具有70％或70％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的dna分子；

64、3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码具有相同功能的蛋白质的dna分子。

65、本发明还提供了包含如下至少一种物质的试剂或包含如下至少一种物质的试剂的应用：(1)上述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶；

66、(2)上述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶的相关生物材料；

67、(3)上述3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶；

68、(4)上述3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶的相关生物材料；

69、所述应用为在如下任一中的应用：

70、(1)制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物；

71、(2)制备以邻氨基苯甲酸为起始代谢物的衍生代谢物；

72、(3)制备产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物菌株；

73、(4)制备产以邻氨基苯甲酸为起始代谢物的衍生代谢物菌株；

74、(5)制备产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物的产品；

75、(6)制备产以邻氨基苯甲酸为起始代谢物的衍生代谢物的产品。

76、上述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶的相关生物材料为如下任一种：

77、c1)编码上述邻氨基苯甲酸3-单加氧酶的核酸分子；

78、c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

79、c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体；

80、c4)含有c2)所述表达盒的重组载体；

81、c5)含有c1)所述核酸分子的重组微生物；

82、c6)含有c2)所述表达盒的重组微生物；

83、c7)含有c3)所述重组载体的重组微生物；

84、c8)含有c4)所述重组载体的重组微生物；

85、c9)含有c1)所述核酸分子的重组细胞；

86、c10)含有c2)所述表达盒的重组细胞；

87、c11)含有c3)所述重组载体的重组细胞；

88、c12)含有c4)所述重组载体的重组细胞；

89、上述3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶的相关生物材料为如下任一种：

90、d1)编码上述3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶的核酸分子；

91、d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；

92、d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体；

93、d4)含有d2)所述表达盒的重组载体；

94、d5)含有d1)所述核酸分子的重组微生物；

95、d6)含有d2)所述表达盒的重组微生物；

96、d7)含有d3)所述重组载体的重组微生物；

97、d8)含有d4)所述重组载体的重组微生物；

98、d9)含有d1)所述核酸分子的重组细胞；

99、d10)含有d2)所述表达盒的重组细胞；

100、d11)含有d3)所述重组载体的重组细胞；

101、d12)含有d4)所述重组载体的重组细胞。

102、3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶具体可为nabc，其为如下任一种蛋白质：

103、1)氨基酸序列为seq id no.11的蛋白质；

104、2)将seq id no.11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

105、3)与1)-2)中任一所限定的氨基酸序列具有70％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

106、4)在1)-3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

107、d1)所述的核酸分子可为如下任一种：

108、1)核苷酸序列是序列表中seq id no.4所示的dna分子；

109、2)与1)限定的核苷酸序列具有70％或70％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的dna分子；

110、3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码具有相同功能的蛋白质的dna分子。

111、可选地，d3)所述的重组载体为具有seq id no.4所示的dna分子的质粒，例如下述实施例制备的pcdf-nabc-echpac。

112、可选地，b7)所述的重组微生物为具有seq id no.4所示的dna分子的重组微生物，例如下述实施例制备的kn-ha-echpac。

113、本发明还提供了一种3-羟基邻氨基苯甲酸的合成方法，包括如下步骤：利用上述的邻氨基苯甲酸3-单加氧酶催化底物邻氨基苯甲酸生成3-羟基邻氨基苯甲酸。

114、本发明还提供了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物的生物合成方法，包括如下步骤；将出发生物体构建成能够实现上述合成途径的重组生物体，利用该重组生物体合成得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物；所述重组生物体能够完成如下反应：

115、(c1)喹啉酸与5-磷酸核糖-1-焦磷酸反应生成烟酸单核苷酸；

116、(c2)利用烟酸单核苷酸合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

117、(c3)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与atp反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；

118、可选地，根据上述生物合成方法，其包括向所述出发生物体中导入选自邻氨基苯甲酸3-单加氧酶编码基因、3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶编码基因和fad还原酶编码基因中的至少一种，得到所述重组生物体。

119、可选地，上述生物合成方法包括发酵上述重组微生物获得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物。

120、本领域技术人员可以采用现有技术中的发酵方法进行发酵。也可通过常规试验进行发酵方法的优化和改进。可以在本领域中已知的发酵条件下在合适的培养基中进行细菌的发酵。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的ph。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。

121、本发明还提供了一种重组生物体，其能够实现上述合成途径，并且所述重组生物体能够完成如下反应：

122、(c1)喹啉酸与5-磷酸核糖-1-焦磷酸反应生成烟酸单核苷酸；

123、(c2)利用烟酸单核苷酸合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成途径；

124、(c3)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与atp反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；

125、上述重组生物体在合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物中的应用也属于本发明的保护范围之内。

126、所述重组生物体具体可为向所述出发生物体中导入选自邻氨基苯甲酸3-单加氧酶编码基因、3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶编码基因和fad还原酶编码基因中的至少一种，得到的生物体。

127、所述出发生物体可为微生物，该微生物可为含有邻氨基苯甲酸代谢物(包括自然代谢合成和人工干预)的微生物，例如大肠杆菌(例如下述实施例所使用的bw25113：：δnadaδnadb)、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母，以及黑曲霉、米曲霉等具有较好表达效果的丝状真菌。

128、邻氨基苯甲酸3-单加氧酶编码基因具体可为b1)所述的核酸分子或c1)所述核酸分子。3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-双加氧酶编码基因具体可为d1)所述核酸分子。fad还原酶编码基因具体可为上述fad还原酶的编码基因。

129、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

130、上述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

131、本文中，同源性是指氨基酸序列或核苷酸序列的相似性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同源性，如ncbi主页网站的blast网页。

132、本文中，所述70％以上的同源性可为至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

133、所述严格条件可为在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

134、所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明dna分子的载体转化进宿主菌。导入的dna分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。

135、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。具体可为prsfduet-1或pab1s。

136、本发明提供的人工nad+新型合成途径是由邻氨基苯甲酸起始经过关键中间代谢物3-羟基邻氨基苯甲酸后合成喹啉酸进入nad+合成途径。

137、在本发明实施例中，以简单的大肠杆菌作为实例进行了途径的展示和验证，但是该途径的适用范围不仅仅局限于大肠杆菌，其还可以轻松的扩展至所有含邻氨基苯甲酸代谢物(包括自然代谢合成和人工干预)的生命体系。该合成途径不只限于生命体系，对于体外构建的无生命合成途径/体系(如固定化酶生产线)也在本发明保护范围内。

138、本发明实施例提供了可以在体内发挥催化邻氨基苯甲酸合成3-羟基邻氨基苯甲酸的反应酶系，通过生物信息学分析和蛋白序列比对找到了序列相似度较高的功能蛋白。此酶可以赋予在生命体或者非生命体内有效完成邻氨基苯甲酸到3-羟基邻氨基苯甲酸的绿色高效转化；并为后期衍生物的生物或者非生物合成体系的开发提供简洁的合成线路和应用实例。

139、本发明实施例涉及的邻氨基苯甲酸-3-单加氧酶还可被用于其他以邻氨基苯甲酸为起始代谢物的衍生代谢途径的开发，如喹啉酸，烟酰胺单核苷酸和朱砂精酸等的合成。

140、本发明的核心在于通过对生物体代谢途径的分析，nad+合成途径的拆分和比较设计了一条新型的nad+合成途径。本发明基于功能酶学的分析和挖掘设计了一条代谢途径更短，应用范围更广泛的nad+合成途径：邻氨基苯甲酸→3-羟基邻氨基苯甲酸→喹啉酸→nad+。

141、本发明提供的人工nad+新型合成途径赋予生物体合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nad+类物质的能力，且代谢途径更简约；其能够解除nad+合成与蛋白合成中氨基酸的耦联与代谢竞争；克服了中间代谢物的积累并实现了代谢途径的高效性。本发明实施例以大肠杆菌为实例分析，但其可以在不同的生物体内发挥作用。本专利设计的nad+合成途径起始物能被不同生物体合成或存在于生物体内。该nad+合成途径所使用的功能酶的大量表达和起始物的大量利用不会损害细胞的生长且对生物体的表型没有毒/副作用。

142、本发明提供的合成方法具有简单的生物或酶学合成方式，良好的经济效益；如对简单培养基(无机盐)和碳源(葡萄糖，淀粉等物质)等的适应性；本发明可以进一步借助经典的代谢工程，合成生物学和酶工程等方法手段来进一步对合成体系或者代谢途径进行优化，以期实现更高的产物积累能力，从而实现对整体经济效益的提高和产能的优化。