西瓜病毒A的外壳蛋白CP的基因及其蛋白、抗体和应用

西瓜病毒a的外壳蛋白cp的基因及其蛋白、抗体和应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，涉及植物病毒检测，具体涉及西瓜病毒a的外壳蛋白cp的基因及其蛋白、抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.植物病毒病害的暴发流行给全球范围内的农作物带来严重危害，导致其产量和品质的下降。病毒病具有种类多、繁殖快、变异快、传播迅速、破坏力强、防控难的特点，而且缺乏有效的防治药剂，成为生产上的一大难题。建立良好的病毒检测鉴定体系对植物病毒病的早期预警和综合防治显得尤为重要，病毒的检测手段和方法也在不断发展，目前常见的病毒鉴定方法主要包括生物学测定、血清学技术、电子显微镜技术以及分子生物学技术。
3.病毒病是为害瓜类的主要病害之一，目前在瓜类作物上已发现多种病毒，对瓜类作物的生产造成了严重危害。西瓜病毒a (watermelon virus a, wva) 是近几年在西瓜和葫芦上刚发现的新病毒，造成西瓜和葫芦叶片皱缩、斑驳、花叶等症状，影响了西瓜和葫芦的生长及产量 (xin et al. archives of virology, 2017, 162 (10): 3239-3242; li, et al. journal of integrative agriculture, 2022, 21(5): 1389
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1400）。wva是乙型线形病毒科 (betaflexiviridae) 西瓜病毒a属 (wamavirus) 的孤种，其基因组全长为8369 nt正义单链rna。除了可以侵染西瓜和葫芦，wva的其他寄主目前暂无报道，wva的传播方式也未知。对wva的检测方式仅限于rt-pcr，无抗原抗体相关检测方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种编码西瓜病毒a的外壳蛋白cp的基因，还涉及西瓜病毒a的外壳蛋白cp蛋白，并制备wva外壳蛋白cp多克隆抗体，以及该抗体在检测西瓜病毒a的应用。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案为wva毒源获取，wva基因组全长克隆，cp基因扩增，cp蛋白表位抗原分析，选取合适片段构建蛋白表达载体，蛋白表达纯化，动物免疫接种，获取多抗血清。更具体的，本发明提供如下技术方案：1.一种编码西瓜病毒a的外壳蛋白cp的核苷酸序列，所述核苷酸序列为序列表中seq id no.20所示的核苷酸序列。
6.2.本发明还提供序列表中seq id no.20所示的核苷酸序列编码得到的西瓜病毒a的外壳蛋白cp。
7.进一步，所述西瓜病毒a的外壳蛋白cp的氨基酸序列如序列表中seq id no.19所示。
8.3.本发明还提供含有序列表中seq id no.20所示的核苷酸序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
9.4.本发明还提供一种wva cp蛋白抗体，用于检测西瓜病毒a，该抗体以西瓜病毒a的外壳蛋白cp核苷酸序列的编码蛋白wva cp蛋白为抗原制备得到，所述核苷酸序列为序列
表中seq id no.20所示；所述编码蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no.19所示。
10.进一步，所述抗原为纯化的wva cp蛋白。
11.进一步，所述wva cp蛋白抗体的制备方法，包括如下步骤：将seq id no.20所示核苷酸克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌，收集表达蛋白；以表达蛋白为免疫原对模式动物进行注射免疫和三次加强免疫，最后收集血清得到抗体。
12.进一步，所述wva cp蛋白抗体的制备方法中，利用seq id no.21和seq id no.22的引物对扩增seq id no.20所示核苷酸。
13.进一步，所述wva cp蛋白抗体的制备方法中，原核表达载体为pet30a。
14.5. 本发明所述的wva cp蛋白抗体在制备检测西瓜病毒a的试剂或试剂盒中的应用也在本发明的保护范围内。
15.进一步，wva cp蛋白抗体在制备检测西瓜病毒a的试剂或试剂盒中的应用，所述试剂或试剂盒为elisa或/和western blot检测试剂或试剂盒。
16.6.本发明还提供采用所述的wva cp蛋白抗体检测西瓜病毒a的方法，包括如下步骤：样品制备，sds
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page 电泳，转膜至硝酸纤维素膜上，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，检测；一抗为以上所述wva cp蛋白抗体，所述二抗为羊抗兔hrp。
17.进一步，一抗孵育中，在封闭液中按照1:2000稀释比例加入wva cp蛋白抗体。
18.本发明的有益效果在于：本发明通过小rna深度测序分析组装，设计wva特异引物对，克隆得到wva病毒基因组全长序列，再进一步根据wva全长序列分析得到wva外壳蛋白cp基因序列，并对cp蛋白结构、亲疏水性、抗原性分析后选取全长作为免疫原制备抗体。且优化了表达cp蛋白的核苷酸序列，使得表达浓度较高，在大肠杆菌可溶性表达，有蛋白结构，具有较好的免疫原性，并进一步制备得到wva外壳蛋白cp多克隆抗体，可应用于wva检测及研究。优良的cp蛋白使得制备的wva外壳蛋白cp抗体效价高，与抗原有良好亲和力，在进一步的西瓜病毒a检测中，可快速准确的检测西瓜、葫芦等感病样品中的病毒，从而建立快速、高效和高灵敏度的瓜类作物中西瓜病毒a检测鉴定体系，对于植物病毒病的早期监测、诊断和综合防治具有重要应用价值，也为后续西瓜病毒a致病机制研究奠定基础。
附图说明
19.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为田间葫芦发病样品图。
20.图2为小rna深度测序拼接组装结果。
21.图3为rt-pcr检测各样品中wva病毒结果；hl 1-6，6个不同葫芦样品。m，dna marker。h，健康对照。
22.图4为cp蛋白疏水性分析。
23.图5为cp蛋白二级结构分析。
24.图6为蛋白小量表达电泳图；1：未诱导对照，2-4：iptg诱导；m：蛋白marker。
25.图7为蛋白大量表达电泳图；1：超声后全菌，2：超声后上清，3：超声后沉淀；m：蛋白marker。
26.图8为蛋白纯化电泳图；1：0.5mg/ml bsa，2：蛋白原样，3：流穿，4：15mm 咪唑洗脱，
5：60mm咪唑洗脱，6-8：300mm咪唑洗脱；m：蛋白marker。
27.图9为各葫芦样品westernblot结果图；hl1-6，6个葫芦样品。h，健康对照。
具体实施方式
28.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图，对本发明的优选实施例作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
29.下述实施例中用到的主要试剂、遗传资源和设备jm109大肠杆菌感受态细胞：上海唯地生物技术有限公司(dl1020）rosetta(de3)大肠杆菌感受态细胞：上海唯地生物技术有限公司(ec1010)rtaq酶：宝生物工程（大连）有限公司(r004q)pmd19-t载体：北京全式金生物技术股份有限公司(ct301-01)质粒提取试剂盒：北京全式金生物技术股份有限公司(em101-01)基因合成：北京华大蛋白质研发中心有限公司引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司镍柱：gehealthcare(17531806)基因测序：北京擎科生物科技有限公司实施例1一、感染wva病毒样品获取通过田间调查采样，采集疑似感染病毒病的葫芦样品，田间葫芦发病样品如图1所示。提取葫芦发病样品的总rna，进行小rna深度测序分析组装。
30.图2为小rna深度测序拼接组装结果，根据小rna深度测序拼接结果设计wva特异引物对：wva-f:ggggtgttaggttcaccata，seqidno.1；wva-r:gcatttattcttttccccccc，seqidno.2；对来源于6个不同葫芦植株的感病样品（分别标记为hl-1、hl-2、hl-3、hl-4、hl-5、hl-6）进行rt-pcr检测，检测结果如图3所，从而获得感染wva病毒的葫芦样品，hl-4、hl-5、hl-6为感染wva病毒的葫芦样品。
31.实施例2二、wva基因组全长克隆。
32.1.根据小rna拼接组装的结果设计7对特异引物对wva基因组全长进行分段克隆，7对特异引物如下表1所示：pcr扩增体系(20μl)：cdna3μl，正向引物1μl，反向引物1μl，rtaqmix10μl，ddh2o5μl，总体积20μl。
33.pcr扩增程序：94℃8min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，32个循环；72℃8min，4℃1min。
[0034] 表17对特异引物
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2. 将获得的7段pcr产物连接到pmd-19t载体上，测序并拼接得到wva病毒基因组全长序列（seq id no.17）：gaaaacgacatacctctccaaatccaccacagaacatctaaatccaacgttgcaaacatctatcaatttgaaacttcaaatggcacttctttcccaaaagaccggcctcgagaagttcatgggctctttagacagagctgaaacaaaattgatatatgctacagcagtcgaggaattaagaaataattctgtggatctcaacaaatttttctcttatgaaatggattcggagaagagactttatttgactaggcgtggggtggaattgtttcctggtggttacaaggcccactcacaccctgtgtcaaaaaccttagaaaattatatactgtatgttttactaccggtttatataggcgtaggcagaataaatatggtgtcaattcaaaggaaaaaagttttaaacctttcacttaaaatgaattacacagaattgaacaccttcaataggataatagactcgaaggacataagtagatatggcgctgatgaagatgtattcaatgatgaaagaaaagagctgttttcatcaactttcataaacaaatttagaacatcaaaggcatatgattgcatattcatacatgatgaatgtcatcactggtcattaaatgacataacgtattttattgaagaagtcaaaccaaaaaggatgcttgtgtctgttgtttatccccctgaattgttgttgggcatagagagcagcttgaacaaactggcatatgactttgaaattaacgatgatggcaccttcagtttttaccccgacggcgtaaaaactgaggcctataatcaaagggtaaatctggattggttaatgaaagggtcatacttaaggacaaacaatggcgtatacactattaggttacttaagactctagctgcgcatcatatgtttgagataaccaaaggcagatttgtgactgataacccaaggcattttgaagagtttgaatgtatagatttgtcctttttgaagcagagaagatggcgaaggaatgaatacatattcattaaaaaaacatggttaacgaaggtttatacgtatttgcaatgtctcaaaaaacctgacaaagagtctggattagcaaaattgagacagataatgggtgaagcacaagaccttaaggtaacaatgttttttgaaaatcttatgcctgaactgctccaaggctgccaaaaaaaaatatttgatgtatcattttttgagaaagtggtgtcaagtttttggaaactattccctataaccattcaaagattgtcttctgatttcaaggacaaaaatttctttgaggtcctgttcaactgtgaaaatttaagggtcaaaatcaagacaaggagttacgacagcagaggcatcattagcatggctgaacacaagattgatgacttcttggagggattttcttggatcccaaaagattatgatgccttagtcaaaagaagcagtgaaag
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[0035]
实施例3蛋白表达纯化1.密码子优化：将seqidno.18所示的核苷酸序列构建至重组质粒后在大肠杆菌中表达可溶性重组蛋白量比较低，难以满足多克隆抗体制备要求，后根据大肠杆菌蛋白表达密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，将cp基因1-238aa编码核苷酸序列进行优化，最终选取
以下序列为优化后的原核表达序列（seq id no.20）：atggcggaggaagacaaaggtgcgaagggcaaaagcgtgaagggtaaagcgagcgacaccaaggataaaaacaagtggaccgaggaaaagatcaaggaaaagttcaagggtaacccgttcctgaaatttattgcggttccgaaagaggaaaagggcgacatctacattgcggcgccgaagattgcgagcgcggagcagctggaaagcattatggaggcgatggaactgaaagaggatgcgtttatccgtcgtagcaagatttttgcgctgcagtgcgcgagcagccaagcgaccgaaaagaccatcttcaacgtggagggtaccgacggcgatcagcgttttgacctgaacagcttcgcgctgaccgttaaacgtttttgcaccatccgtcaattctgcgcggcgtgggcgaagtacacctgggattatatgattcgtaacaacctggcgccggacggttggaaagatcgtggctacccgatggcgcaccgttttgcggcgtttgacgcgttccacggcgtgatcagcgatcacagcattccgcacccgaacatgatccgtatgccgagcgaggacgaaattgcggcgaacgaggtgaacaagaacgttgcgatccaccgtagcagccagcgtcaaaacatcggttatagcattgcgaccgaagttaccaaaggcaagccgcaaaacgcgccgaaaatcaagtttattgaggat2. 表达载体构建：利用以下引物对：f1: gaattcatggcggaggaagacaaa；seq id no.21；r1: ctcgagatcctcaataaacttgatttt；seq id no.22；扩增上述cp基因1-238 aa核苷酸编码基因（seq id no.20），并构建到pet30a载体上，酶切及测序验证；经测序验证后该重组载体pet30a-cp（1-238）构建成功。
[0036]
3. 大肠杆菌转化将构建好的pet30a-cp（1-238）转化rosetta大肠杆菌。
[0037]
4. cp蛋白小量表达（1） 从转化的平板挑单克隆到2 ml含相应抗性的lb液体培养基中，37℃，200 rpm培养。
[0038]
（2） 培养至od=0.6-0.8，用0.5 mm iptg诱导，37℃，200 rpm培养4 h。
[0039]
（3） 取1 ml诱导的菌液，12000 rpm，离心1 min，弃上清，沉淀用50-100 μl 10 mm tris-hcl（ph8.0）溶液悬浮（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与缓冲液等体积的 2
×
sds loading buffer，100℃煮5 min，电泳检测，检测结果如图6所示，其中1：未诱导对照，2-4：iptg诱导；m：蛋白marker。
[0040]
5. cp蛋白大量表达（1）接100 μl活化的菌液到5 ml相应抗性lb液体培养基中，37℃，200 rpm培养过夜。
[0041]
（2）将培养的菌液转接到1000 ml相应抗性lb液体培养基中，37℃，200 rpm，培养至od=0.6-0.8，iptg（0.5 mm）16℃诱导过夜。
[0042]
（3）收集菌：8000 rpm，离心6 min。弃上清。
[0043]
（4）超声破菌：菌体用20-30 ml 10 mm tris-hcl（ph 8.0）溶液吹散，超声波破碎（500 w, 180次，每次5 s，间隔5 s）。
[0044]
（5） 电泳确定表达形式：取100 μl超声后的菌悬液，12000 rpm，离心10 min，取50 μl上清至另一ep管，上清去除干净后沉淀用50 μl 10 mm tris-hcl（ph 8.0）溶液吹散。电泳检测，检测结果如图7所示。其中1：超声后全菌液，2：超声后菌液上清，3：超声后沉淀。m：蛋白marker。
[0045]
（6）目的蛋白在上清和沉淀中均有表达，12000rpm，离心10min，转移上清至新的管中开始蛋白纯化。
[0046]
6.蛋白质纯化（1）用去离子水洗镍柱（nisepharose6fastflow，gehealthcare），至ph7.0。
[0047]
（2）10mmtris-hcl（ph8.0）溶液平衡镍柱，约100ml。
[0048]
（3）含0.5m氯化钠的10mmtris-hcl（ph8.0）溶液平衡镍柱，约50ml。
[0049]
（4）将前述样品稀释后上样。
[0050]
（5）上样结束后，用含0.5m氯化钠的10mmtris-hcl（ph8.0）溶液洗柱。
[0051]
（6）分别用含15mm咪唑、60mm咪唑、300mm咪唑的10mmtris-hcl（ph8.0）（含0.5m氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰。
[0052]
（7）电泳检测蛋白纯化效果，检测结果如图8所示，其中1：0.5mg/mlbsa，2：蛋白原样，3：流穿，4：15mm咪唑洗脱，5：60mm咪唑洗脱，6-8：300mm咪唑洗脱。m：蛋白marker。由电泳图可见，300mm咪唑洗脱纯化后的cp蛋白浓度高，纯度较好，相比较蛋白原样，已经去掉大部分的杂蛋白，以6-8洗脱混合液作免疫原。
[0053]
实施例4抗体制备1.免疫(1)免疫用兔子为2.0kg左右的新西兰大白兔。免疫之前耳静脉取阴性血清：用75%酒精擦拭兔子耳部静脉，擦至静脉充分扩张；用注射器插入静脉抽取阴性血1～2ml；全血在室温静置30～120min后，5000rpm离心10min，收取血清。
[0054]
(2)取400μg目的蛋白，用生理盐水稀释到200～500μl，再加入等体积弗氏佐剂（初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂）；用混匀仪器将溶液和佐剂混匀，形成油包水；将混匀好的免疫原进行背部皮下注射免疫，打8～10个点。
[0055]
(3)每隔12天进行一次加强免疫，每次免疫量为200μg蛋白，共进行三次加强免疫。
[0056]
(4).wvacp蛋白抗体elisa测定效价最后一次加强免疫后7天进行耳静脉取血，然后进行elisa免疫效价测定。
[0057]
1)试剂配制包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ph9.6pbs缓冲液ph7.4封闭液：含1%bsa或脱脂奶粉的pbs洗液：pbst（0.05%吐温，pbs）显色液:1%a液+10%b液（a液：含1%tmb的dmso；b液：含0.1%h2o2的柠檬酸缓冲液）终止液：2m硫酸二抗：山羊抗兔igg/hrp2)实验步骤1.1用包被液稀释抗原，终浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤2次。
[0058]
1.2封闭液封闭，200μl/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤1次。
[0059]
1.3多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释（inpbs），空白对照（blank）为pbs，阴性对照（negative）为阴性血清200倍稀释（inpbs）；均为100μl/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液
洗涤3次。
[0060]
1.4 加入pbs稀释20000倍的二抗，100 μl/孔，37℃孵箱，1 h；取出后用洗液洗涤3次。
[0061]
1.5 显色，显色液100 μl/孔，显色时间为5-15 min。
[0062]
1.6 每孔加入50 μl终止液终止。
[0063]
1.7 双波长（450nm，630nm）测吸光值，记录保存数据，并做图分析。效价为1/2最大od值所对应的稀释倍数。结果见表2，抗体效价达到了102400，符合要求。
[0064]
表2 稀释倍数对应的od值
名称200400800160032006400128002560051200102400空白阴性anti-wvacppro（1-238aa）1.831.7971.7421.7621.7421.7131.5721.4621.2891.050.0170.116
(5) 颈动脉取阳性血：用麻醉剂麻醉兔子（戊巴比妥钠，30mg/kg，静脉、腹腔、肌肉注射均可）；兔子麻醉后，用固定架固定；用手术器械剪开脖子外层皮毛，于气管侧面下方找到颈动脉，止血钳夹紧动脉管并剪断放血，收集，5000rpm离心10min，两次离心后收取血清。
[0065]
实施例5利用制备的wva cp蛋白抗体对wva侵染样品进行western blot验证。
[0066]
实验步骤：所用相关试剂：2
×
sds loading buffer；上层胶缓冲液；下层胶缓冲液；arc-bis；5
×
sds电泳buffer；10
×
tbst缓冲液；转膜缓冲液；脱脂奶粉；ecl化学发光显色液。
[0067]
1)样品制备：称取植物（hl-1、hl-2、hl-3、hl-4、hl-5、hl-6、h）组织样本，研磨后加入300~400 μl 1
ꢀ×ꢀ
sds loading buffer ，充分混匀，沸水浴10 min，离心，12000 rpm,10 min，取上清。
[0068]
2)sds-page凝胶电泳：取上清20μl，进行sds page 电泳，120v，2h 左右，待溴酚蓝指示剂到底部后停止。
[0069]
3)转膜：电转移方法将page凝胶上蛋白转移至硝酸纤维素膜上（200 ma，60 min）。
[0070]
4) 封闭：将硝酸纤维素膜浸入封闭液中，封闭液为含有5%脱脂奶粉的1
×
tbst缓冲液，37 ℃孵育1-2小时。
[0071]
5)一抗孵育：将实施例4制备的wva cp蛋白抗体用1
×
封闭液进行稀释，稀释比例为1:2000，将硝酸纤维素膜放入其中37℃孵育1-2小时。
[0072]
6)二抗孵育：一抗孵育结束后，将膜用1
×
tbst缓冲液中漂洗3次，每次10 min 。再按1:10000比例加入羊抗兔hrp二抗（sigma），37℃孵育40 min 。
[0073]
7)ecl显色：二抗孵育结束后，将膜用1
×
tbst缓冲液中漂洗3次，每次10 min 。加入化学发光底物，通过化学发光仪检测结果。
[0074]
检测结果如图9所示，hl 1-6，6个葫芦样品。h，健康对照。同rt-pcr检测结果一致，h、hl-1、hl-2、hl-3的样品没有显示条带，无wva病毒感染，hl-4、hl-5、hl-6均有显示条带，充分说明本发明制备的抗体质量好，效价高，和抗原结合的特异性高，无假阳性和假阴性，检测灵敏度好，可建立快速、高效和高灵敏度的瓜类作物中西瓜病毒a检测鉴定体系。
[0075]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。