一株血清2型禽腺病毒毒株以及疫苗和用途

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一株血清2型禽腺病毒毒株以及疫苗和用途。


背景技术：

2.禽腺病毒是全球家禽和野禽常见的传染病病原。禽腺病毒分为ⅰ亚群禽腺病毒、ⅱ亚群禽腺病毒、ⅲ亚群禽腺病毒三个亚群。ⅰ亚群禽腺病毒即禽腺病毒属（aviadenovirus）。根据国际病毒分类委员会（ictv）第10次报告，禽腺病毒属有14个种（species），包括禽腺病毒a-e种（fowl aviadenovirus a-e），鸭腺病毒b种（duck aviadenovirus b），隼腺病毒a种（falcon aviadenovirus a），鹅腺病毒a种（goose aviadenovirus a），鸽腺病毒a、b种（pigeon aviadenovirus a-b），鹦鹉腺病毒b种（psittacine aviadenovirus b），火鸡腺病毒a-c种（turkey aviadenovirus a-c）。
3.禽腺病毒a~e种共有12个血清型（fowl adenovirus 1-8a，8b-11）。血清1型禽腺病毒（fowl adenovirus 1，fadv-1）属于a种；血清5型禽腺病毒（fowl adenovirus 5，fadv-5）属于b种；血清4型（fowl adenovirus 4，fadv-4）和血清10型禽腺病毒（fowl adenovirus 10，fadv-10）属于c种；血清2型（fowl adenovirus 2，fadv-2）、血清3型（fowl adenovirus 3，fadv-3）、血清9型（fowl adenovirus 9，fadv-9）和血清11型禽腺病毒（fowl adenovirus 11，fadv-11）属于d种；血清6型（fowl adenovirus 6，fadv-6）、血清7型（fowl adenovirus 7，fadv-7）、血清8a型（fowl adenovirus 8a，fadv-8a）和血清8b型禽腺病毒（fowl adenovirus 8b，fadv-8b）属于e种。而鸭腺病毒2型（duck adenovirus 2，dadv-2）和鸭腺病毒3型（duck adenovirus 3，dadv-3）则都属于鸭腺病毒b种。鸭腺病毒2型于1977年分离自法国患病番鸭，感染鸭主要表现精神沉郁、下痢、消瘦等。鸭腺病毒2型与血清2型禽腺病毒属于完全不同的种，两个病毒具有完全不同感染宿主和发病特点。
4.肝炎-心包积液综合征（hepatitis-hydropericardium syndrome，hhs），又叫心包积液综合征（hydropericardium syndrome，hps）。之前的研究报道，禽腺病毒12个血清型感染鸡均引起包涵体肝炎。血清4型、血清11型禽腺病毒感染鸡除了引起肝炎，还会引起心包积液（即引起肝炎-心包积液综合征或心包积液综合征）。具体可参考的文献如下：cn202210046888.7公开了表达禽腺病毒血清8b型（fadv-8b）纤突蛋白（fiber）的禽腺病毒血清4型（fadv-4）重组病毒及其构建方法和应用。所述重组病毒是利用fadv-8b的fiber基因替换fadv-4 fiber1基因得到，该重组病毒可用于制备防控鸡肝炎-心包积液综合征和/或鸡包涵体肝炎的二联疫苗。
5.cn201710505267.x公开了一种ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法及其制品。本发明首先公开了一种ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体的制备方法，包括：(1)培养ⅰ群血清4型禽腺病毒，制备灭活疫苗；(2)将灭活疫苗免疫产蛋鸡，收获鸡蛋，分离卵黄；(3)从卵黄中提取卵黄抗体，即得。该发明方法对卵黄抗体的提取效果好，不仅能够有效提高卵黄抗体除脂率，而且可以提高卵黄抗体的纯净度，减少杂蛋白，工艺简单。该发明进一步公开了所述方法制备得到的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵黄抗体。本发明制备的ⅰ群血清4型禽腺病毒卵
黄抗体，能够安全有效的预防ⅰ群4型禽腺病毒引起的禽心包积液-肝炎综合征。
6.cn202111600154.0 公开了一种禽腺病毒4、8和11型三价疫苗及其制备方法和应用。所述禽腺病毒三价疫苗包括禽腺病毒4型疫苗株qyh2019-yn、禽腺病毒8型疫苗株qyh2020-hb和禽腺病毒11型疫苗株qyh2020-sy。该发明提供了一种禽腺病毒三价疫苗，由最新分离得到的禽腺病毒4型疫苗株、禽腺病毒8型疫苗株和禽腺病毒11型疫苗株制备得到，其对于4、8和11型禽腺病毒及其引起的鸡包涵体肝炎和心包积液-肝炎综合征具有有效的预防作用。
7.目前，国内外已经发现的血清2型禽腺病毒感染鸡只引起肝炎，没有发现血清2型禽腺病毒感染鸡引起心包积液综合征案例。近年来，国内外血清2型禽腺病毒感染鸡的病例报道逐渐增多。血清2型禽腺病毒对鸡群和养禽业有巨大威胁。
8.对于禽腺病毒引起的疾病，国内外主要以鸡胚或者禽源细胞培养禽腺病毒制备灭活疫苗进行防控。但是不同血清型禽腺病毒之间无交叉保护，目前已有的其它血清型的疫苗对血清2型禽腺病毒引起的疾病不能提供良好的保护。因此，急需开发血清2型禽腺病毒疫苗用于预防控制该病毒引起的疾病。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一株血清2型禽腺病毒毒株及其用途，该病毒滴度高、免疫原性好，采用其制备的灭活疫苗对鸡群能够提供有效的免疫保护。
10.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一株血清2型禽腺病毒毒株，保藏编号为：cctcc no：v202236 ；保藏日期：2022年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（简称：cctcc），保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072。
11.在上述的血清2型禽腺病毒毒株中，其基因序列如seq id no：1所示。
12.此外本发明还公开了一种疫苗，含灭活的如上所述的血清2型禽腺病毒毒株。
13.上述的血清2型禽腺病毒毒株可用于制备用于预防血清2型禽腺病毒引起的鸡包涵体肝炎和肝炎-心包积液综合征的疫苗或抗体。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对临床肝炎-心包积液综合征样本进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株血清2型禽腺病毒毒株，经过透射电子显微镜观察、pcr试验、全基因序列测定和动物回归试验，确定所筛选的病毒为血清2型禽腺病毒毒株，与ncbi已知的血清2型禽腺病毒毒株（fadv-2 ga/1358/1995株和fadv-2 685株）orf25 cds区非连续的特点不同，gx01株orf25两个cds区是连续的。动物回归试验表明该毒株感染会引起鸡肝炎-心包积液综合征，鸡体重增长显著抑制，排毒持续期长，对生产造成严重影响。
15.本发明所提供的疫苗所使用的毒株是血清2型禽腺病毒gx01株，是适应细胞规模化培养，病毒滴度高、免疫原性好。其能预防gx01这个毒株，理论上能够预防所有的血清2型禽腺病毒。
16.本发明制备的禽腺病毒灭活疫苗安全性高、稳定性好。本发明研制的疫苗免疫试验鸡后未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。本发明中制备的灭活疫苗对鸡群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景，为我国养鸡场对该病的综合防控提供基础。
17.此外ncbi上显示的血清2型禽腺病毒毒株全基因序列只有两个，fadv-2 685毒株和 fadv-2 sr48毒株。其中685毒株分离自英国。sr48毒株分离自日本，文献证实ncbi显示的fadv-2 sr48毒株有错误，根据分类标准它实际是fadv-11毒株。另外一株d种未确定血清型分离自美国的腺病毒ga/1358/1995毒株，通过遗传进化分析确定这株为fadv-2。本案的fadv-2 gx01毒株全基因序列是中国的第一株血清2型禽腺病毒全长序列，是世界的第三株血清2型禽腺病毒全长序列。
附图说明
18.图1为血清2型禽腺病毒gx01电镜图片；图2为禽腺病毒pcr产物琼脂糖凝胶电泳；图3为血清2型禽腺病毒gx01基因组特点；图4为gx01株的dna聚合酶氨基酸序列和hexon loop-1基因序列的遗传进化分析；图5为gx01株攻毒鸡大体病变：肝脏出血性炎症和心包积液；图6为gx01株攻毒鸡病理切片：肝脏炎性细胞浸润和脾脏大量淋巴细胞坏死；图7为gx01株攻毒鸡体重变化：gx01感染严重抑制鸡体重增长；图8为gx01株攻毒鸡排毒检测：血清2型禽腺病毒能够在鸡体内增殖，排毒持续期长。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1病毒株gx01的分离和鉴定流行病学调查2020年7月广西某肉鸡场，20日龄鸡出现了一种肝炎-心包积液综合征的传染性疾病。对病死的鸡进行剖检，主要的病理变化表现为肝脏广泛出血性肝炎，心脏包膜内有心包积液。经临床调查和实验室检测，初步诊断为ⅰ亚群禽腺病毒即禽腺病毒引起的肝炎-心包积液综合征。遂将有典型症状发病鸡的肝脏、心脏等病料组织采集后置于﹣80℃冰箱保存备用。
21.病毒的分离在无菌环境取病死鸡的肝脏经研磨后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，4℃ 12000r/min离心10min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000iu/ml，经0.22μm的微孔滤器过滤，保存备用。将上述制备的样本处理后得到的过滤液接种生长至大约80%左右的单层lmh细胞，5% co2培养箱37
ꢀ°
c吸附1h后，弃去吸附液，灭菌pbs洗涤两遍，补加含2%胎牛血清的dmem/f-12维持液。观察细胞病变，待细胞病变达80%，收集细胞液，﹣80℃保存。
22.血清2型禽腺病毒的鉴定透射电镜鉴定
生长在t75细胞培养瓶中的细胞接毒，待细胞病变达到50%，倒出培养液，用细胞刮刮下细胞，而后带培养液一起低速离心，1200转/分钟，离心10分钟使细胞沉淀成团，离心完后倒出培养液，沿壁缓慢加满电镜固定液（2.5%中性戊二醛）。4℃下固定15分钟或以上。将病毒颗粒用60μl pbs重悬，用1％的磷钨酸负染30s，在透射电镜下观察病毒颗粒结构。电镜下可观察到lmh细胞核中有大量腺病毒粒子，有些病毒粒子呈晶格状排列（图1）。
23.鉴定核酸提取取200μl融液离心后的病毒液上清，使用天隆生物科技有限公司rna/dna核酸提取纯化试剂盒（天隆，货号t180h）按照说明书操作步骤提取病毒核酸。
24.pcr/rt-pcr扩增分别用禽腺病毒（fadv）、鸡传染性喉气管炎病毒(iltv)、马立克氏病病毒(mdv)、鸡传染性贫血病毒(ciav)、减蛋综合征病毒(edsv)、禽流感病毒(aiv)、新城疫病毒(ndv)、鸡传染性法氏囊病病毒(ibdv)、鸡传染性支气管炎（ibv）、禽白血病病毒(alv)和禽呼肠孤病毒(arv)引物进行pcr或者rt-pcr检测。
25.pcr/rt-pcr扩增结果pcr/rt-pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示扩增出了禽腺病毒特异性目的片段，片段大小为728bp，与预期片段大小相符(图2)；未扩增出其它病原片段。pcr结果表明试验中分离并检测到了禽腺病毒，病毒液ha试验均为0，表明不含有血凝性外源病毒污染(禽流感病毒、新城疫病毒)。pcr/rt-pcr对鸡传染性喉气管炎病毒(iltv)、马立克氏病病毒(mdv)、鸡传染性贫血病毒(ciav)、减蛋综合征病毒(edsv)、禽流感病毒(aiv)、新城疫病毒(ndv)、鸡传染性法氏囊病病毒(ibdv)、鸡传染性支气管炎（ibv）、禽白血病病毒(alv)和禽呼肠孤病毒(arv)检测均为阴性证明禽腺病毒毒中不含有其它外源病毒污染。
26.病毒基因组的扩增及序列分析用分段设计引物扩增病毒基因组序列，扩增的片段头尾之间有50-300bp重叠区域，通过扩增、测序、拼接，最终获得血清2型禽腺病毒基因组全长。从genbank下载已知禽腺病毒毒株的序列，利用dnastar软件包中的megalign进行与其他禽腺病毒毒株序列进行同源性分析。利用mega 7.0软件，利用最大释然法将本发明分离得到的血清2型禽腺病毒gx01株分别构建dna聚合酶氨基酸和hexon loop-1基因的构建进化树。结果表明，本发明分离到的血清2型禽腺病毒gx01株病毒基因组全长43，663 bp，g+c含量为53%。全基因组序列包含36个orfs (图3)。我们目前的研究获得中国首株fadv-2全基因组序列gx01（ncbi序列号on014843），此fadv-2与ncbi已知全长的血清2型禽腺病毒毒株（fadv-2 ga/1358/1995株和fadv-2 685株）orf25 cds区非连续的特点不同，gx01株orf25两个cds区是连续的(图3)。 根据国际病毒分类委员会(ictv)的物种划分标准，禽腺病毒的种的划分依赖于dna聚合酶氨基酸序列的遗传距离分析，dna聚合酶氨基酸序列的进化树结果显示gx01属于fadv-d(图4)。禽腺病毒hexon loop-1基因是区分fadvs血清型的基因，禽腺病毒hexon loop-1基因的进化树结果表明gx01与fadv-2 685株的亲缘关系最近(图4)。但是 gx01与fadv-2 685株 hexon loop-1基因相比有碱基突变和缺失，基因同源性97.7%，属于相同的血清型不同的毒株。血清2型禽腺病毒gx01株（fowl aviadenovirus d fowl adenovirus 2）的序列如seq id no：1所示。
27.本发明分离的血清2型禽腺病毒gx01株与其它d种禽腺病毒毒株核苷酸和氨基酸序列同源性比对如下表1。
28.表1 gx01株与d种腺病毒其它毒株的基因和氨基酸序列比较前期国内外发现的血清2型禽腺病毒对鸡不致病或只引起鸡肝炎病，gx01株是国内外首次发现的既能引起肝炎也能引起心包积液的血清2型禽腺病毒毒株。临床感染和实验室感染血清2型禽腺病毒gx01株的鸡，均表现出肝炎-心包积液综合征，这说明本发明分离到的血清2型禽腺病毒发生了明显改变，尤其是对鸡的致病力以及对鸡引起的临床症状上差异明显。
29.实施例2 病毒株gx01的特性考察病毒含量测定将gx01株病毒液用灭菌pbs作10倍倍比稀释，取10-1
、 10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
十个稀释度，分别接种96孔细胞板上的单层lmh细胞，每个稀释度接种8孔，每孔接种0.1ml，置37℃ 5% co2培养箱，3-5d后观察细胞病变，接种细胞出现典型病变则判为感染，按照reed-muench方法计算 tcid
50
。每0.1ml病毒含量应≥10
6.0
tcid
50
。
30.鸡回归试验
病毒对spf鸡致病力将0.3ml(≥10
6.0
tcid
50
) gx01株病毒液经静脉分别接种3日龄和10日龄spf鸡各10只，对照组各10只分别接种观察21日，所有的鸡均感染。感染后的鸡表现出(1)羽毛蓬松、采食减少、扎堆、精神萎靡等症状；(2)攻毒后21天，感染鸡虽然未发生死亡，但是剖检见明显的肝脏出血、肿胀等肝炎症状，心包膜内有淡黄色心包积液（图5）；（3）病理切片显示肝脏小叶及静脉周围可见几处炎性细胞灶性浸润，局部肝窦淤血扩张；肝细胞中有包涵体。脾脏红白髓大量淋巴细胞坏死，核固缩深染或碎裂溶解（图6）。动物回归试验首次证实我们分离的血清2型禽腺病毒gx01株可以引起肝炎-心包积液综合征。
31.病毒攻毒后对体重的影响gx01株攻毒后每周称量攻毒组和对照组鸡的体重，称重至第三周。结果显示3日龄攻毒组比3日龄对照组的鸡在攻毒后1、2、3周体重显著下降，到第三周攻毒组平均体重159.15g，对照组平均体重245.63g。10日龄攻毒组比10日龄对照组的鸡在攻毒后1、2、3周体重也显著下降，到第三周攻毒组平均体重261.90g，对照组平均体重334.69g（图7）。体重结果表明血清2型腺病毒gx01株感染显著抑制鸡的体重增长，严重影响鸡的生产性能。
32.病毒攻毒后鸡的泄殖腔排毒攻毒后采集1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、10d、14d、21d泄殖腔试纸，荧光定量绝对定量方法检测泄殖腔排毒的病毒拷贝数。结果显示3日龄攻毒组攻毒后1d即可检测到泄殖腔开始排毒126拷贝。3日龄攻毒组排毒从1d开始急剧上升，到5d达到排毒高峰，病毒拷贝数高达5.42
×
106，随后病毒拷贝数开始逐渐下降，到攻毒后21d，排毒病毒拷贝数仍然有264。10日龄攻毒组攻毒后1d也可检测到泄殖腔开始排毒193拷贝。10日龄攻毒组排毒从3d开始急剧上升，到4d达到排毒高峰，病毒拷贝数高达1.82
×
106，随后病毒拷贝数开始逐渐下降，到攻毒后21d，排毒病毒拷贝数仍然有126（图8，需要说明的是，在图8中，3日龄对照组和10日龄对照组在横坐标处基本重合，在图8中无法区分）。检测泄殖腔排毒结果表明，血清2型禽腺病毒在体内具有良好的增殖能力，排毒量高，并且排毒持续期长，一旦感染对环境和周围健康鸡有很大威胁。
33.实施例3 灭活疫苗的制备和检验gx01株病毒液的灭活取本发明gx01株病毒液接种lmh细胞，每天观察细胞病变，待病变至大约80%，收获病毒液，反复冻融3次。取病毒液缓慢加入甲醛溶液，使病毒液中甲醛的终浓度为0.1％，随后置37℃摇床内，200rpm振荡灭活24h后，置于4℃保存。
34.半成品检验病毒含量测定按照实施例2 病毒株gx01的特性考察 病毒含量测定中描述的方法测定tcid
50
，最终病毒滴度不低于10
6.0
tcid
50
/0.1ml。
35.无菌检验取灭活后的病毒液， 按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，确认无菌污染。
36.灭活检验取1ml灭活后的病毒液分别接种3瓶lmh细胞，另取一瓶lmh细胞作为空白对照，37℃，co2培养箱培养，每日观察并记录细胞病变情况，连续观察7天。将培养物反复冻融三次
后再盲传2代，设置未接毒的细胞作为空白对照，37℃，co2培养箱培养，观察7天，记录有无细胞病变。结果显示接种灭活后病毒液的细胞和空白对照细胞一样均没有病变，表明病毒灭活彻底。
37.疫苗的制备取制备好的彻底灭活的抗原液，按照1：2(v/v)加入montanide tm isa71vg佐剂(法国seppic公司)，置于乳化罐内，8000rpm/min剪切10分钟，制备成灭活疫苗。
38.疫苗的安全试验20只3日龄spf鸡随机分为两组，一组肌肉注射0.4ml灭活疫苗；另一组以相同的方式注射 0.4ml生理盐水，作为空白对照。免疫后连续观察21日，每日观察各组鸡的采食饮水、精神状态以及检查各组鸡注射部位是否出现红肿等局部注射反应。
39.结果显示在免疫后各组鸡的采食饮水、精神状态均正常，各组鸡注射部位疫苗吸收完全，没有红肿等局部反应，结果表明疫苗安全无害。
40.实施例4 灭活疫苗的免疫攻毒保护性检验将血清2型禽腺病毒gx01株毒种制成油乳剂灭活疫苗(抗原含量≥10
6.0
tcid
50
/0 .1ml)。30只3日龄spf鸡随机分为三组，第一组肌肉注射0.2ml灭活疫苗；第二组和第三组均肌肉注射0.2ml 生理盐水，作为空白对照。免疫免疫后3周，第一组免疫组和第二组对照组分别静脉注射接种fadv-2病毒0.3ml(病毒含量≥10
6.0
tcid
50
/0.1ml)；第三组接种0.3ml 生理盐水，作为不免疫不攻毒对照。攻毒后的三周每周测鸡的体重，三周后处死所有鸡观察病变情况。结果表明第一组免疫攻毒组的鸡和第三组不免疫不攻毒对照组的鸡的体重无差异，第一组和第三组的鸡的体重显著高于第二组不免疫攻毒组的体重。处死后的，第一组的鸡和第三组对照组的鸡均没有心包积液和肝炎症状，第二组的鸡有明显肝炎和心包积液症状。说明本发明的毒株作为抗原制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，能为fadv-2病毒攻毒提供很好的保护。
41.实施例5 灭活疫苗的免疫持续期测定将血清2型禽腺病毒gx01株毒种制成油乳剂灭活疫苗(抗原含量≥10
6.0
tcid
50
/0.1ml)。20只3日龄spf鸡随机分为两组，一组肌肉注射0.2ml灭活疫苗；另一组以相同的方式注射生理盐水0.2ml，作为空白对照。免疫后0-6周，每周所有试验鸡采血，分离血清，elisa测定抗体。结果表明此灭活疫苗免疫鸡能刺激起高水平血清抗体，免疫鸡的血清抗体均为阳性，对照鸡抗体水平均应为阴性。说明本发明的毒株作为抗原制备的灭活疫苗能刺激机体产生抗体，有良好的免疫原性。