一种改进的GLP-1受体激动剂和融合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及glp-1融合蛋白及其应用。

背景技术：

1、胰高血糖素样肽-1(glp-1)也称肠促胰素，是由小肠l细胞分泌，具有多器官靶向调控作用，包括促进胰岛激素分泌，抑制胰高血糖素释放，减缓胃排空，降低食欲，对营养摄取和促进营养吸收具有重要的调控作用。glp-1的生物作用主要通过激活glp-1 受体(glp-1r)。glp-1r是一种g蛋白偶联的膜蛋白，主要在胰腺β细胞中表达，在其他组织和细胞(肺、心、肾、胃肠道和脑)中也有一定程度的表达。glp-1与受体结合后激活腺苷酸环化酶(ac)，从而刺激第二信使环磷酸腺苷(camp)生成，并与蛋白激酶a(pka)和camp调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子(camp gefs)epac家族相结合[1]。

2、天然glp-1在人体内半衰期仅1-2分钟，主要是由于包括二肽基肽酶iv(dpp-iv)在内的快速酶失活[2]和/或肾清除率[3]所致。因此，科学家们研发了多种长效抗降解glp-1类似物，例如，人源glp-1类似物经过氨基酸替换[4,5]和/或n-末端修饰，包括脂肪酰化[6]n-乙酰化修饰[7]延长循环半衰期。白蛋白缀合的glp-1(阿必鲁肽)也具有延长的半衰期[8]。近年来，多种glp-1受体激动剂及其类似物已被广泛用于治疗糖脂代谢性疾病，尤其是2型糖尿病(t2dm)和肥胖症。glp-1受体激动剂在糖尿病治疗中发挥着重要的作用，而且对心血管疾病[9]和神经系统疾病[10,11]也起到了预防和治疗作用。此外，glp-1 还可与肾脏、皮肤等的glp-1受体结合，影响组织代谢及相关疾病[12]。

3、美国专利us8658174公开了glp-1融合蛋白，其包含与igg/fc结构域融合的glp-1多肽，可用于治疗糖尿病。

4、研究表明，glp1-fc融合蛋白中存在翻译后修饰。hou等人2019年报道，细胞培养过程中增加烟酰胺和半胱氨酸有助于降低一种glp类似物与igg4/fc融合蛋白(度拉鲁肽)的羟基化水平[13]。

5、运用基因工程重组蛋白技术制作治疗用途的融合蛋白旨在表达具有天然多肽的属性，过程涉及转录、翻译和翻译后修饰的细胞工程步骤，其工艺直接影响药物的理化特征、构象、在体内半衰期、生物活性以及生产制作的产量等。因此，目前仍然需要改进的glp-1融合蛋白，例如适合大规模生产，具有更高的产量和活性以及更长的半衰期等特征以用于临床治疗，具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有更高的活性和产量的改进的glp-1融合蛋白，该融合蛋白可以通过多种途径或方式来获得，例如在特定蛋白位置选择氨基酸替换、进行羟基化、氧化等，如通过在glp-1多肽的k34上羟基化和/或减少glp-1多肽的氧化。此外，本发明的glp-1融合蛋白特定位置的氨基酸替换，使改进的融合蛋白半衰期显著延长，同时在人类疾病、动物疾病模型中具有良好的预防和治疗效果。

2、因此，本发明的优势在于提供了一种改进的glp-1融合蛋白，具有产量和活性提高、或半衰期延长的特性。

3、本发明的一个方面，提供了一种glp-1融合蛋白，所述融合蛋白包含glp-1多肽和免疫球蛋白fc结构域，其中所述glp-1多肽选自人glp-1(7-37)、人glp-1(7-36)和 dppiv抗性人glp-1，所述glp-1多肽与免疫球蛋白fc结构域共价连接，其中所述glp-1 多肽包含a8g和/或g22e和/或r36g替换，所述免疫球蛋白fc结构域包括或者为 igg2/fc结构域，所述igg2/fc结构域包含c222s替换，和/或所述igg2/fc结构域还包含选自a330s替换和p331s替换中的一种或两种。

4、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽在相对于天然人glp-1的k34上具有一定水平的羟基化。优选地，所述羟基化水平在10％和100％之间，例如大于等于10％、或至少大于等于20％、或大于等于26％、或大于等于30％、或大于等于40％、或大于等于50％，或大于等于60％，或大于等于70％，或大于等于80％，或大于等于90％。

5、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，免疫球蛋白fc结构域(igg2/fc)中在相对于天然igg2的第251位蛋氨酸(m251)和/或glp-1多肽中在相对于天然glp- 1的第31位色氨酸(w31)氧化程度降低。在另一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，igg2/fc中的第251位蛋氨酸(m251)和/或glp-1多肽中在相对于天然glp-1 的第31位色氨酸(w31)在一定程度上被氧化。优选地，m251上氧化水平小于约5％、小于等于约4％、小于等于约3％或小于等于约2％，和/或w31上的氧化水平低于约0.5％或无法检测。

6、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽具有与seq idno: 1或seq id no:2或seq id no:3至少90％序列相同性并且包括a8g和/或g22e和/或r36g替换的氨基酸序列。

7、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述igg2/fc结构域具有与seqid no:5或seq id no:6至少90％序列相同性并且包含a330s和/或p331s替换，并且包含c222s替换的氨基酸序列。

8、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述融合蛋白还包含用于连接所述glp-1多肽和所述免疫球蛋白fc结构域的连接肽。

9、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述连接肽具有选自seq id no:9、 seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq idno: 15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18和seq id no:19中的任一氨基酸序列，优选seq id no:9。

10、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白具有seq id no:7的氨基酸序列或与seq id no:7具有至少约90％序列相同性的氨基酸序列。

11、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中还包含信号肽。优选地，所述信号肽是人cd33信号肽，或者所述信号肽具有seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4 具有至少约90％序列相同性的氨基酸序列。

12、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白具有与seq id no:8至少约90％序列相同性的氨基酸序列。

13、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白药品级的。

14、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽的氨基酸序列与seq id no:1或seq id no:2具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列相同性。在另一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述的glp-1多肽具有 seq id no:1或seqid no:2的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽包括选自a8g、g22e和r36g替换中的一个或多个。在另一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽具有与seq id no:3具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％序列、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同性并且包含a8g、g22e、r36g 替换的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽具有seq id no:3的氨基酸序列。

15、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述igg2/fc结构域具有与seqid no:5至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同性并且包含a330s和/或p331s 替换，并且包含c222s替换的氨基酸序列。

16、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述igg2/fc结构域具有与seqid no:6具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同性并且包含a330s、 p331s和c222s替换的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述igg2/fc结构域具有seq id no:6的氨基酸序列。

17、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白具有与seq id no:7至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约 97％、至少约98％或至少约99％序列相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白具有与seq id no:7至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列相同性并且包含a8g、g22e、r36g、a330s、p331s和c222s替换的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白具有seq id no:7或seq id no:8的氨基酸序列。

18、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白进一步包含信号肽。

19、在一个实施方式中，本发明的glp-1融合蛋白中，所述信号肽为人cd33信号肽。在实施例中，信号肽具有与seq id no:4具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述信号肽具有seq id no:4的氨基酸序列。

20、本发明的另一个方面，还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本发明涉及的glp-1融合蛋白的多核苷酸。

21、在一个实施方式中，该多核苷酸编码seq id no:7或seq id no:8的glp-1融合蛋白。在一个实施方式中，该多核苷酸具有与seq id no:26至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列相同性的多核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述多核苷酸为seq id no:26的多核苷酸序列。

22、在一个实施方式中，该多核苷酸具有与seq id no:27至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约 98％或至少约99％序列相同性的多核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述多核苷酸为 seq idno:27的多核苷酸序列。

23、本发明的再一个方面，还提供了一种包含所述多核苷酸的载体。

24、本发明的又一个方面，还提供了一种药物组合物，其包含所述glp-1融合蛋白、多核苷酸或载体。

25、在一个实施方式中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

26、在一个实施方式中，所述组合物包含glp-1融合蛋白，所述融合蛋白含有在k34上一定羟基化水平的glp-1多肽。在另一个实施方式中，所述glp-1融合蛋白含有在m251 上一定氧化水平的igg2/fc。在另一个实施方式中，所述glp-1融合蛋白含有在w31一定氧化水平的glp-1多肽。

27、在一个实施方式中，所述glp-1多肽在k34上羟基化的水平为至少约10％、至少约20％、至少约26％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％。在另一个实施方式中，羟基化水平为100％。

28、在一个实施方式中，所述igg2/fc的m251或glp-1多肽w31的氧化水平小于5％，小于等于4％，小于等于3％，小于等于2％，小于等于1％或小于等于0.5％。在另一个实施方式中，glp-1多肽w31无任何氧化。

29、在一个实施方式中，所述组合物进一步包含缓冲盐水。

30、在一个实施方式中，所述组合物进一步包含表面活性剂。

31、在一个实施方式中，所述组合物包含glp-1融合蛋白，配制成制剂，给药剂量为约0.25mg至约20mg，例如，约0.25mg、约0.3mg、约0.35mg、约0.4mg、约0.45mg、约0.5mg、约0.55mg、约0.6mg、约0.65mg、约0.7mg、约0.75mg、约0.8mg、约 0.85mg、约0.9mg、约0.95mg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、约5mg、约5.5mg、约6mg、约7mg、约7.5mg、约 8mg、约8.5mg、约9mg、约9.5mg、约10mg、约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg、约17mg、约18mg、约19mg或约20mg的glp-1融合蛋白。

32、本发明的另一方面，提供了一种用于制备药物的glp-1融合蛋白、多核苷酸、载体或组合物。

33、本发明的另一方面，提供了所述glp-1融合蛋白、多核苷酸、载体或药物组合物在制备药物中的应用。

34、在一个实施方式中，本发明应用中，所述药物为治疗或预防糖脂代谢性疾病或神经退行性疾病药物。

35、在一个实施方式中，本发明应用中，所述糖脂代谢性疾病选自糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪肝病(nafld)和肥胖症，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、运动神经元病、亨廷顿病或帕金森病。

36、在一个实施方式中，本发明应用中，所述糖脂代谢性疾病是糖尿病，优选2型糖尿病。

37、在一个实施方式中，本发明应用中，将所述glp-1融合蛋白、多核苷酸、载体或组合物与糖尿病药物联合应用。在一个优选例中，本发明应用中，所述糖尿病药物可以是目前已经上市的药物，例如胰岛素、二甲双胍，磺酰脲类主要包括格列美脲、格列本脲、格列齐特、格列喹酮等，α葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖等，还包括其它已经上市和正在研发的治疗糖尿病的药物。在一个实施方式中，糖尿病药物是二甲双胍或胰岛素。在一个实施例中，组合物可以与阿尔茨海默病药物和/或非药物干预如认知疗法联合使用。

38、在一个实施方式中，本发明应用中，所述药物为glp-1受体激动剂。

39、本发明的另一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防糖脂代谢性疾病或神经退行性疾病的方法，所述方法是给予受试者治疗有效量的所述glp-1融合蛋白、多核苷酸、载体或组合物。

40、在一个实施方式中，本发明方法中，所述糖脂代谢性疾病选自包括糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪性肝病(nafld)和肥胖症等在内的疾病。

41、在一个实施方式中，本发明方法中，所述糖脂代谢性疾病为糖尿病。在另一优选例中，所述糖尿病为2型糖尿病。

42、在一个实施方式中，本发明方法中，所述糖脂代谢性疾病为nash。

43、在一个实施方式中，本发明方法中，所述糖脂代谢性疾病为nafld。

44、在一个实施方式中，本发明方法中，所述神经退行性疾病选自阿尔海默茨病、运动神经元障碍类疾病、亨廷顿病或帕金森病。

45、在一个实施方式中，本发明方法中，所述神经退行性疾病为阿尔海默茨病或帕金森病。

46、在一个实施方式中，本发明方法中，所述glp-1融合蛋白或其组合物还可以与治疗糖尿病的药物联合应用。在一个实施方式中，所述治疗糖尿病的药物可以是目前已经上市的药物，例如胰岛素、二甲双胍，磺酰脲类主要包括格列美脲、格列本脲、格列齐特、格列喹酮等，α葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖等，还包括其它已经上市和正在研发的治疗糖尿病的药物。在一个实施方式中，糖尿病药物是二甲双胍或胰岛素。在一个实施例中，组合物可以与阿尔茨海默病药物和/或非药物干预如认知疗法联合使用。

47、在一个实施方式中，所述glp-1融合蛋白或其组合物通过胃肠外、静脉、皮下或肌肉内等途径给药。

48、在一个实施方式中，所述glp-1融合蛋白或其组合物给药剂量约为含有0.2mg至20mg的glp-1融合蛋白。

49、在一个实施方式中，所述给药剂量优选为含有约0.25mg，约0.3mg，约0.35mg，约0.4mg，约0.45mg，约0.5mg，约0.55mg，约0.6mg，约0.65mg，约0.7mg，约 0.75mg，约0.8mg，约0.85mg，约0.9mg，约0.95mg，约1mg，约1.5mg，约2mg，约2.5mg，约3mg，约3.5mg，约4mg，约4.5mg，约5mg，约5.5mg，约6mg，约 6.5mg，约7mg，约7.5mg，约8mg，约8.5mg，约9mg，约9.5mg，约10mg，约 11mg，约12mg，约13mg，约14mg，约15mg，约16mg，约17mg，约18mg，约 19mg或约20mg的glp-1融合蛋白。

50、在一个实施方式中，所述glp-1融合蛋白或其组合物给药次数为每3天一次，或每周一次，或每两周一次。

51、在一个实施方式中，所述glp-1融合蛋白或其组合物给药方案为一周一次后停药，随后每周给药一次。在另一优选例中，所述停药时间为2周。

52、本发明的另一个方面，提供了一种重组细胞，所述细胞包含编码所述glp-1融合蛋白的多核苷酸，或包含所述多核苷酸，或包含所述载体。

53、在一个实施方式中，本发明的重组细胞中，所述细胞还重组或天然表达赖氨酰羟化酶。

54、在一个实施方式中，本发明的重组细胞中，所述重组细胞与cos-7细胞相比赖氨酰羟化酶活性水平增加。

55、在一个实施方式中，本发明的重组细胞是由中国仓鼠卵巢细胞经悬浮驯化获得，以 chok1细胞为示例。

56、本发明的再一个方面，提供了一种重组细胞的构建方法，包括：将编码本发明的glp-1融合蛋白的多核苷酸引入载体中以构建表达载体；将所述表达载体导入重组或天然表达赖氨酰羟化酶的细胞以得到重组细胞。

57、在一个实施方式中，所述重组或天然表达赖氨酰羟化酶的细胞表达的赖氨酸羟化酶较其它细胞如cos-7细胞表达的赖氨酸羟化酶活性升高。

58、在一个实施方式中，所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞，特别是chok1细胞。

59、在一个实施方式中，所述载体可以是pkn012载体。

60、在一个实施方式中，所述重组细胞的构建方法包括以下步骤：

61、将seq id no:27所示的多核苷酸序列插入pkn012载体的ncoi和hindiii位点，生成pkn012-glp-1-igg2/fc；

62、将pkn012-glp-1-igg2/fc表达载体导入chok1细胞中得到重组细胞。

63、本发明的再一个方面，提供了一种生产所述glp-1融合蛋白的方法，包括使用所述重组细胞得到glp-1融合蛋白的步骤。

64、本发明的其它特征和优点将在下文如实施例中的详细描述中显而易见。详细描述和具体示例在本发明的优选实施例的同时仅以说明的方式给出，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。