用于前列腺癌筛查的标记物、试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种用于前列腺癌筛查的标记物、试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、前列腺癌是目前男性面临的最常见癌症之一，是我国第六大恶性癌。在美国男性发病率第一位，死亡率第二位。前列腺癌在我国排男性恶性肿瘤的第三位。由于前列腺癌在早期没有任何症状，患者往往容易错过最佳的治疗时机，导致诊疗难度加大。常在体检时行直肠指检或检测血清psa升高被发现。前列腺特异性抗原（prostate specific antigen 或者 psa）是一种由前列腺上皮细胞分泌产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种糖蛋白。psa及其衍生物是目前早期筛查前列腺癌最常用的生物标志物，目前已经发展出了phi和4kscore等结合多指标联合检测结果的综合评判标准。但因psa特异性低带来的假阳性给患者带来了大量的经济和生理负担，人们仍然在寻找更好的前列腺癌生物标志物以更好的实现前列腺癌的筛查。尚没有一种结果可靠的早筛产品，目前体检用的psa难以满足早期筛查的要求，急需要一些崭新的技术问世。

2、非入侵性的前列腺癌的诊断方法一直是临床研究中的热点。尿液为前列腺最直接接触的液体，因此，我们认为尿液里应有大量的肿瘤外泌体。

3、鉴于此，申请此专利。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于前列腺癌筛查的标记物、试剂盒及其使用方法，解决穿刺活检带来的诸多问题，开发出高效准确的早诊早筛试剂盒，满足临床需求。减轻病人的痛苦，降低前列腺癌的死亡率。

2、本发明的目的是提供一种用于前列腺癌筛查的试剂盒。

3、本发明的另一目的是提供上述用于前列腺癌筛查的试剂盒的使用方法。

4、根据本发明的具体实施方式的用于前列腺癌筛查的尿液外泌体标记物，所述尿液外泌体标记物为pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr。

5、尿液外泌体标记物pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr的用途，所述尿液外泌体标记物用于前列腺癌筛查。

6、根据本发明的具体实施方式的用于前列腺癌筛查的试剂盒，所述试剂盒包含五种标记物的反应液和β-actin反应液；β-actin反应液中的前引物序列如seq id no:1所示，后引物序列如seq id no:2所示；通过逆转录聚合酶链反应检测尿外泌体中的pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr表达水平。

7、检测pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr的反应液所使用的试剂相同，只是引物不同。

8、具体的，检测五种标记物的反应液均包括：pcr buffer，mgcl2，dntp，taq聚合酶，前引物，后引物，探针；其中，pca3反应液中的前引物序列如seq id no:3所示，后引物序列如seq id no:4所示；tmprss2-erg反应液中的前引物序列如seq id no:5所示，后引物序列如seq id no:6所示；spdef反应液中的前引物序列如seq id no:7所示，后引物序列如seqid no:8所示；haah反应液中的前引物序列如seq id no:9所示，后引物序列如seq id no:10所示；amacr反应液中的前引物序列如seq id no:11所示，后引物序列如seq id no:12所示。

9、进一步的，检测五种标记物的反应液均包括：1x的pcr buffer，2mm的mgcl2，0.2mm的dntp，0.03u/ul的taq聚合酶，前引物 0.2μm，后引物0.2 μm，探针0.08 μm，余量为去离子水。

10、进一步的，β-actin反应液包括：pcr buffer，mgcl2，0.2mm的dntp，taq聚合酶，β-actin的前引物 0.2μm，β-actin的后引物0.2 μm，β-actin探针。

11、进一步的，β-actin反应液包括：终体系1x的pcr buffer，2mm的mgcl2，0.2mm的dntp，0.03u/ul的taq聚合酶，β-actin前引物 0.2μm，β-actin后引物0.2 μm，β-actin探针0.05 μm，余量为去离子水。

12、进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为质粒dna；所述阴性对照为tris-hcl。

13、进一步的，所述试剂盒还包括外泌体提取试剂，所述外泌体提取试剂按体积百分比包括：18% peg6000和10% peg800，余量为pbs缓冲液。

14、所述的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：

15、（1）收集尿液，提取尿液外泌体；

16、（2）尿液外泌体中加入外泌体裂解液，提取mrna；

17、（3）mrna反转录成cdna；

18、（4）通过逆转录聚合酶链反应，检测pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr表达。

19、进一步的，步骤（1）具体为：

20、第一步：收集尿液，备用；

21、第二步：将尿液进行离心，上清液转入新的离心管，加外泌体提取试剂 5ml，4℃过夜；外泌体提取试剂的组分包括体积百分比的18% peg6000、10% peg800和pbs ；

22、第三步: 将所述上清液进行第二次离心，弃上清，收集外泌体沉淀，-80℃保存。

23、进一步的，步骤（4）具体为：

24、按反应布局，向96孔板中加入20 ul的反应液；外泌体cdna稀释10倍，每个反应孔内加入10ul 的稀释后的cdna ；阳性对照用每反应1000拷贝的质粒dna，阴性对照用tris-hcl；在abi pcr仪上进行pcr反应。

25、haah的pcr程序：95℃taq酶激活 15min，95℃变性15s，58℃退火延伸30s，共50个循环；haah的pcr产物长度为138bp；β-actin的pcr产物长度为165bp。

26、pca3、tmprss2-erg、spdef和amacr的pcr程序中退火温度与haah不同，分别为53℃、57℃、59℃和52℃。

27、haah的pcr产物长度为138bp；pca3的pcr产物长度为233bp；tmprss2-erg的pcr产物长度为118bp；spdef的pcr产物长度为100bp；amacr的pcr产物长度为188bp；β-actin的pcr产物长度为165bp。

28、前列腺癌抗原3（pca3或dd3）是前列腺特异性基因，其具有高度的特异性且与前列腺的其它疾病和前列腺体积无关。pca3是目前研究和应用最为广泛的非编码ｒｎａ肿瘤标记物，尿液pca3检测具有简便、重复性高及敏感性强的特点。1996 年，pca3基因被发现在90%的前列腺癌组织中高表达。2002年，发现前列腺癌细胞会脱落到尿液中，从而“液体活检”的概念诞生。与血清psa相比，pca3具有较低的敏感性，但具有较高的特异性和较好的阳性和阴性预测值。pca3是目前最有可能替代psa进行前列腺癌筛查的生物标志物。

29、人类天冬胺酰基β－羟化酶(human aspartyl/asparaginyl β-hydroxylase，haah) 是胚胎期即存在于细胞内的一种酶，属于依赖α-酮戊二酸双加氧酶家族，可催化特定蛋白中表皮生长因子(egf)受体样结构域的天冬氨酸或天冬酰胺残基上的β－碳原子羟基化。研究表明haah在肿瘤细胞表面的高表达，是一种新型恶性肿瘤高特异性的分子标记物。本团队的研究证实haah是前列腺癌的理想标记物。

30、α甲酰辅酶ａ消旋酶（amacr）由ｐ５０４ｓ基因编码，主要参与支链脂肪酸的β氧化。利用尿液中ｐｓａ ｍｒｎａ校准过的amacr评分可被用于诊断前列腺癌，其敏感性约为70％。而在近期的研究中，ｏｕｙａｎｇ等则将amacr和pac３评分相结合，将诊断敏感性提高到81％。

31、tmprss2-erg基因融合是前列腺癌的主要分子亚型。tmprss2是雄激素调节的跨膜丝氨酸蛋白酶，其在正常前列腺上皮中表达，在前列腺癌组织中的表达增加。尽管tmprss2-erg的假阳性很低，但其在很多种癌症中都存在高表达，因此需要联合其它指标进行检测来提高其特异性。目前研究较多的是结合tmprss2-erg和pca3的联合检测来进行早期前列腺癌诊断。

32、本发明与现有技术相比，有益效果为：

33、（1）本发明的试剂盒采用逆转录聚合酶链反应检测pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr五个标记物，5个标记物结合使用，大大提高了诊断的敏感性和特异性。本试剂盒同时检测尿外泌体中的pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr，这在国内外还没有报导，完全属于首创产品。

34、（2）本发明的试剂盒既可用于前列腺癌诊断又可监控术后复发的新技术。

35、（3）本发明在对50例前列腺癌的尿外泌体的rt-qpcr pca3、tmprss2-erg、spdef、haah和amacr的检测显示，roc 特征曲线显示，本发明的试剂盒诊断前列腺癌的灵敏度为91.43%，特异性达到了89.66%；此结果优于市场其他产品。

36、（4）通过尿液检测，方便、无痛、成本低，病人容易接受；

37、（5）此外，本发明对尿外泌体的提取方法进行深入研究，探索出了能适合临床运用的外泌体提取方法。