检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、猴痘(monkeypox)是一种人畜共患病。虽被命名为猴痘病毒，但其首要宿主为老鼠、松鼠等啮齿类动物，机会宿主为灵长类动物，可通过被感染动物咬伤或直接接触感染动物的伤口、体液或呼吸飞沫而传染人类。猴痘为dna病毒，与天花同属痘病毒科，两者基因序列高度相似，导致两者的生物学特性和致病性也诸多相似。

2、猴痘患者的临床症状类似天花，包括发热、头痛、肌肉酸痛、背痛、瘙痒、疲惫等。发热后1～3d，皮肤出现痘状疱疹，从面部扩散至身体其他部位。大部分猴痘患者的病程呈自限性，少数可发展为重症，出现多器官衰竭，甚至危及生命。

3、猴痘的临床症状与天花相似，依靠临床表现来对其进行鉴别较为困难，尤其是曾经接种过天花疫苗再感染猴痘病毒的人群，其症状轻微甚至无明显症状。此外，猴痘病毒感染也常被误认为鸡痘病毒，上述情况仅依靠临床症状无法进行确诊。目前常用的猴痘特异性检测方法为检测病毒核酸的 pcr方法，该方法灵敏度和特异性较高。荧光pcr是目前国内外检测猴痘病毒的主要方法。

4、但是，作为正痘病毒，无论是临床表现还是传播途径甚至基因序列，猴痘病毒都与天花、牛痘、痘苗存在高度相似，市面上大多数试剂盒的检测区段普遍分布在f3l以及b6r等，这些区段虽然是中西非毒株共有的特异性区段，但与天花、牛痘、痘苗存在高度相似，无法实现对猴痘的特异性检测。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测待测样品中猴痘病毒核酸的方法、用于诊断猴痘病毒感染相关疾病试剂盒以及用于检测猴痘病毒感染相关疾病的试剂在制备用于诊断猴痘病毒感染相关疾病试剂盒中的应用。

2、为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂，所述试剂包括：

4、用于检测猴痘病毒基因组的第187882～188000位碱基区域的试剂，所述第187882～188000位碱基区域的核苷酸序列如seq id no:1所示。

5、在可选的实施方式中，所述试剂用于检测猴痘病毒基因组的第 (187882～187887)～(187995～188000)位碱基区域。

6、在可选的实施方式中，所述试剂包括引物，所述引物的核苷酸序列具有相对于猴痘病毒基因组的第(187882～187887)～(187995～188000)位碱基区域的18～25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。

7、优选地，所述试剂包括引物对，所述引物对的核苷酸序列如seq id no: 2～3所示。

8、更优选地，所述试剂还包括探针，所述探针的核苷酸序列如seq id no: 4所示。

9、在可选的实施方式中，所述探针为taqman探针，所述探针的5’端连接有报告荧光基团，所述探针的3’端连接有淬灭荧光基团。

10、在可选的实施方式中，所述报告荧光基团选自vic、fam、tet、joe、 hex、cy3、tamra、rox、texas red、lc red640、cy5或lc red705；

11、所述淬灭荧光基团选自bhq1、bhq2、dabcyl或qys-7。

12、第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述试剂在制备用于诊断猴痘病毒感染相关疾病试剂盒中的应用。

13、第三方面，本发明提供用于诊断猴痘病毒感染相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包括前述实施方式任一项所述的试剂。

14、在可选的实施方式中，所述试剂盒还包括缓冲液、dna聚合酶或taq 酶的至少一种。

15、优选地，所述缓冲液包括taq稀释缓冲液、dntp和mg2+。

16、第四方面，本发明提供了采用前述实施方式任一项所述试剂或试剂盒检测待测样品中猴痘病毒核酸的方法，所述方法包括，使用所述试剂对待测样品进行荧光定量pcr扩增，所述引物对在扩增体系中的终浓度为 10～500nm，所述探针在扩增体系中的终浓度为1～300nm。

17、优选地，所述引物对在扩增体系中的终浓度为100～300nm，所述探针在扩增体系中的终浓度为50～150nm。

18、进一步优选地，所述引物对在扩增体系中的终浓度为200nm，所述探针在扩增体系中的终浓度为100nm。

19、在可选的实施方式中，所述pcr扩增的反应条件包括：94～96℃预变性1～10min；94～96℃变性10～15s；55～60℃退火15～50s；变性至退火重复40～45个循环。

20、本发明选用猴痘中非毒株和西非毒株共有的特异性区段作为目标区段，设计特异引物，成功将猴痘病毒与天花、牛痘、痘苗病毒区分开，为有效检测猴痘感染导致的相关疾病提供了一种新途径。

技术特征：

1.检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂，其特征在于，所述试剂包括：

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测猴痘病毒基因组的第(187882～187887)～(187995～188000)位碱基区域。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物，所述引物的核苷酸序列具有相对于猴痘病毒基因组的第(187882～187887)～(187995～188000)位碱基区域的18～25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述探针为taqman探针，所述探针的5’端连接有报告荧光基团，所述探针的3’端连接有淬灭荧光基团。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述报告荧光基团选自vic、fam、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texas red、lc red640、cy5或lc red705；

6.权利要求1～5任一项所述试剂在制备用于诊断猴痘病毒感染相关疾病试剂盒中的应用。

7.用于诊断猴痘病毒感染相关疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、dna聚合酶或taq酶中至少一种；

9.采用权利要求1～5任一项所述试剂或权利要求7或8所述试剂盒检测待测样品中猴痘病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括，使用所述试剂对待测样品进行荧光定量pcr扩增，引物对在扩增体系中的终浓度为10～500nm，探针在扩增体系中的终浓度为1～300nm；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应条件包括：94～96℃预变性1～10min；94～96℃变性10～15s；55～60℃退火15～50s；变性至退火重复40～45个循环。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂、试剂盒及检测方法。本发明提供一种检测待测样品中猴痘病毒核酸的试剂，包括用于检测猴痘病毒基因组的第187882～188000位碱基区域的试剂，所述第187882～188000位碱基区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明选用猴痘中非毒株和西非毒株共有的特异性区段作为目标区段，设计特异引物，成功将猴痘病毒与天花、牛痘、痘苗病毒区分开，为有效检测猴痘感染导致的相关疾病提供了一种新途径。

技术研发人员：黄菁,徐璨,谭兰玉,许承佳
受保护的技术使用者：广东菲鹏生物有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25