一种生产纽莫康定B0的基因工程菌及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种纽莫康定b0的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术：

1、纽莫康定b0(pneumocandin b0)是棘白菌素类抗真菌药物卡泊芬净(caspofungin)的前体。棘白菌素类化合物可以通过非竞争性抑制真菌细胞壁中的β-1,3-d-葡聚糖合成酶活性而抑制真菌细胞壁的合成。

2、纽莫康定b0是由苏氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、3,4-二羟基高酪氨酸、3-羟基谷氨酰胺、反式-3-羟基脯氨酸、4,5-二羟基鸟氨酸这6个氨基酸组成的肽环，通过肽环上的4,5-二羟基鸟氨酸的氨基酸残基n-末端连接一个10,12-二甲基肉豆蔻酸组成的酯肽。

3、目前，丝状真菌glarea lozoyensis是生产纽莫康定b0的重要的工业生产菌。

4、2013年，刘杏忠课题组和安志强课题组在完成了g.lozoyensis atcc 20868(纽莫康定a0高产菌株)基因组测序的基础上，发现了合成纽莫康定b0的基因簇，确定了纽莫康定b0的生物合成途径为i型聚酮合酶(polyketide synthase，pks)-非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，nrps)杂合途径。纽莫康定b0生物合成基因簇全长约116kb，包含聚酮合酶(glpks4)、非核糖体肽合成酶(glnrps4)、高酪氨酸合成酶系(glarea37-40)、多个加氧酶p450、一个锌指转录因子(glarea10050)和一个abc转运体(glarea10036)。

5、纽莫康定b0的生物合成以8种前体分子为基础，经由pks-nrps系统所调节、组装和修饰，最终合成纽莫康定b0。纽莫康定b0起始合成单元来源于乙酰辅酶a，在pks(glpks4)催化下，按照i型pks合成机制，在第一个酰基coa基础上共完成7次聚酮链的延伸循环。pks包含的甲基转移酶，会在延伸过程中将来自甲硫氨酸的甲基转移至聚酮化合物中间体上，形成10,12-二甲基肉豆蔻酸的两个甲基侧链。因为glpks4没有硫酯酶(thioesterase，te)结构域，所以定位在pks的酰基载体蛋白(acp)上的10,12-二甲基肉豆蔻酰在包含有ii型te的glhyd作用下生成10,12-二甲基肉豆蔻酸，并以游离羧酸的形式从pks上释放。游离的10,12-二甲基肉豆蔻酸通过酰基amp连接酶(glligase，glarea10043)转变成辅酶a硫酯形式并定位到glnrps4的第一个模块中的硫醇化(t)结构域，t结构域接受由腺苷化(a)结构域腺苷化的鸟氨酸，启动了六肽延伸。继而以核糖体多肽合成机制依次连接苏氨酸，4-羟基脯氨酸，3-羟基高酪氨酸，3-羟基谷氨酰胺和3-羟基脯氨酸形成肽链，nrps的缩合(condensation，c)结构域对形成的六肽链进行环化。再由glp450-1对高酪氨酸的4位进行羟基化以及glp450-2对鸟氨酸的4、5位进行羟基化，最终得到纽莫康定b0。

6、纽莫康定b0的生产涉及到杂质纽莫康定c0的去除，文献《crispr/cas9-basedgenome editing in the filamentous fungus glarea lozoyensis and itsapplication in manipulating glof》公开了采用crispr/cas9基因编辑技术对菌株g.lozoyensis sipi1208进行改造的方法，敲除glof基因，替换为ap-htye基因，进而得到一个新的菌株，新的菌株用于生产纽莫康定b0可以很好的避免杂质纽莫康定c0的产生。然而，对于纽莫康定b0生产菌株中其它关键基因如gloa、glod、glol并未做研究。其中g.lozoyensis sipi1208基因簇中gloa、glod和glol分别对应g.lozoyensis atcc 20868中的glnrps4(非核糖体肽合成酶，nonribosomal peptide synthetase)、glligase(酰基amp连接酶，acetyl-coa synthetase)和glpks4(聚酮合酶，polyketide synthase)。

7、因此，对于纽莫康定b0生产菌株中其它关键基因的研究对于纽莫康定b0的产量提升也特别重要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中纽莫康定b0合成产量较低、生产成本高的缺陷，提供一种基因工程菌、其制备方法，及其在制备纽莫康定b0中的应用。利用本发明基因工程菌生产纽莫康定b0具有产量高且整体成本低的优势。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因工程菌，其出发菌株为丝状真菌glarea lozoyensis，所述基因工程菌过表达编码非核糖体肽合成酶的基因；所述非核糖体肽合成酶的ncbi登录号为xp_008078276.1。

3、在某些实施例中，编码所述非核糖体肽合成酶的基因的ncbi登录号为xm_008080085.1；和/或，所述丝状真菌glarea lozoyensis为g.lozoyensis atcc 20868。

4、优选地，所述过表达是利用强启动子使丝状真菌glarea lozoyensis的基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因过表达；

5、所述强启动子选自gpd启动子或tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如seqid no:4所示；所述tef1启动子的核苷酸序列如seq id no:6所示。

6、在某些实施例中，所述强启动子整合于g.lozoyensis atcc 20868的基因组上，并使编码所述非核糖体肽合成酶的基因过表达。

7、较佳地，所述整合是将所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子替换为所述强启动子。

8、本发明第二方面提供一种制备如本发明第一方面所述的基因工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：将含有强启动子的质粒或线性片段转化入丝状真菌glarealozoyensis细胞内，使所述强启动子替换所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子，获得过表达编码非核糖体肽合成酶的基因的基因工程菌；所述强启动子选自gpd启动子或tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述tef1启动子的核苷酸序列如seq id no:6所示。

9、较佳地，所述替换使用crispr/cas9基因编辑技术进行。

10、在某些实施例中，所述丝状真菌glarea lozoyensis在所述转化前通过溶解细胞壁的酶液酶解其细胞壁。

11、较佳地，所述酶液包括丝状真菌细胞壁溶解酶(yatalase)、溶壁酶(lyticase)、纤维素酶(cellulase)中的一种或多种。

12、更佳地，所述酶液包括：2％丝状真菌细胞壁溶解酶、3％溶壁酶、1％纤维素酶，所述％为g/100ml。

13、本发明第三方面提供一种纽莫康定b0的制备方法，其包括：在适合培养如本发明第一方面所述的基因工程菌的条件下发酵即得。优选地，所述的制备方法为在种子培养基中培养后，转至发酵培养基中进行发酵。

14、更优选地，所述种子培养基包括棉籽饼粉、甘露醇、kh2po4、葡萄糖、mgso4·7h2o、氯霉素，所述发酵培养基包括豆油、葡萄糖、甘露醇、棉籽饼粉、大豆浓缩蛋白、复合氮源、脯氨酸、磷酸二氢钾、氯霉素，和/或，

15、所述培养和发酵的温度为21-28℃，例如为24℃，和/或，

16、所述培养在震荡中进行，所述震荡的转速为200-250rpm，例如为220rpm，和/或，

17、所述培养的时长为5-10天，例如为5-7天，和/或，

18、所述发酵的时长为15-25天，例如为20天。

19、进一步更优选地，所述种子培养基包括棉籽饼粉25g/l、甘露醇50g/l、kh2po4 4g/l、葡萄糖10g/l、mgso4·7h2o 0.1g/l、氯霉素0.1g/l，所述发酵培养基包括豆油8g/l、葡萄糖9g/l、甘露醇110g/l、棉籽饼粉9g/l、大豆浓缩蛋白9g/l、复合氮源3.5g/l、脯氨酸10g/l、磷酸二氢钾8.5g/l、氯霉素0.1g/l。

20、本发明第四方面提供一种表达盒，所述表达盒包括启动子，编码非核糖体肽合成酶的基因和终止子；

21、所述启动子选自gpd启动子或tef1启动子；例如gpd启动子；

22、所述gpd启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示；

23、所述tef1启动子的核苷酸序列如seq id no:6所示；

24、编码所述非核糖体肽合成酶的基因的ncbi登录号为xm_008080085.1。

25、其中，所述终止子为g.lozoyensis atcc 20868的基因组中编码所述非核糖体肽合成酶的基因的原终止子。

26、本发明第五方面提供一种重组质粒，所述重组质粒包括如本发明第四方面所述的表达盒；优选所述的重组质粒的骨架质粒为puc57质粒。

27、本发明第六方面提供一种重组质粒组合，其包括cas9表达质粒、sgrna质粒，以及如本发明第五方面所述的重组质粒；所述cas9表达质粒和sgrna质粒的线性片段用于将如本发明第四方面所述的表达盒同源重组至纽莫康定b0的生产菌的基因组中；

28、优选地，所述cas9表达质粒的骨架质粒为pfc333质粒，和/或，所述sgrna质粒的骨架质粒为puc57质粒；和/或，所述表达盒在如本发明第五方面所述的重组质粒中，并在同源重组前所述的重组质粒发生了线性化。

29、本发明第七方面提供如本发明第一方面所述的基因工程菌或如本发明第四方面所述的表达盒或如本发明第五方面所述的重组质粒或如本发明第六方面所述的重组质粒组合在制备纽莫康定b0中的应用。

30、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

31、本发明所用试剂和原料均市售可得。

32、本发明的积极进步效果在于：

33、通过启动子调控提高gloa的表达量有利于b0产量的提升。本发明提供的基因工程菌的纽莫康定b0发酵产量比野生型菌株提高16-37.4％，在优选实施例中提高了37.4％。