一种新型对映-贝壳杉烯19位氧化酶及其应用

本发明属于生物，更具体地，本发明涉及一种新型对映-贝壳杉烯19位氧化酶及其应用。

背景技术：

1、对映-贝壳杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase)催化对映-贝壳杉烯19位甲基的氧化，该氧化过程经历对映-贝壳杉烯-19-醇、对映-贝壳杉烯-19-醛，最终生成对映-贝壳杉烯-19-酸。对映-贝壳杉烯-19-酸是植物赤霉素代谢中的重要前体，亦是多种贝壳杉烯氧化产物合成的关键前体，具有重要的生物学意义和经济价值。本研究旨在挖掘并改造一系列植物来源的对映-贝壳杉烯19位氧化酶，提升对映-贝壳杉烯19位的氧化效率，实现对映-贝壳杉烯-19-酸及其下游产物甜菊醇的产量。

技术实现思路

1、本发明第一个方面提供了一种新型对映-贝壳杉烯19位氧化酶(ko)或其变体，所述氧化酶选自甜叶悬钩子(rubus suavissimus s.lee)来源的rsko、明日叶(angelicakeiskei(miq.)koidz.)来源的akko和小粒咖啡(coffea arabica l.)来源的cako，优选为选自seq id no:1的rsko、seq id no:2的akko和seq id no:3的cako。

2、在一个或多个实施方案中，所述ko变体的序列与seq id no:1-3中任一项所述的序列具有至少90％(例如至少96％，至少98％，至少99％)序列同一性，同时保留其生物学活性。

3、在一个或多个实施方案中，所述ko变体是ko的截短变体，优选为截去n端跨膜区域的截短变体。在一个或多个实施方案中，所述变体具有：seq id no:1截去第1-35位的氨基酸后的序列、seq id no:2截去第1-32位的氨基酸后的序列、或seq id no:3截去第1-37位的氨基酸后的序列。

4、在一个或多个实施方案中，所述ko变体是在ko或其截短变体的n端融合有助溶标签的变体，所述标签能增加蛋白可溶性、稳定性等。优选地，所述标签是17α或2b1，序列分别如seq id no:7和8所示。

5、本发明第二个方面还提供了一种核酸分子，其编码本文第一个方面所述的对映-贝壳杉烯19位氧化酶或其变体，包含选自以下的序列：

6、(1)编码本文第一个方面任一实施方式所述对映-贝壳杉烯19位氧化酶或其变体的核酸序列；

7、(2)(1)的互补序列；

8、(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。

9、在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。

10、在一个或多个实施方案中，(1)所述核酸序列经大肠杆菌密码子优化。

11、在一个或多个实施方案中，所述编码序列是dna或rna。

12、在优选的实施方案中，(1)所述核酸序列具有选自以下的一项或多项所述的序列：

13、(a)seq id no:4-6中任一项所示的序列，

14、(b)seq id no:4截去第1-105位的氨基酸后的序列、seq id no:5截去第1-96位的氨基酸后的序列、或seq id no:3截去第1-111位的氨基酸后的序列，

15、(c)(a)或(b)的n端融合助溶标签的编码序列的序列。

16、在一个或多个实施方案中，所述标签是17α或2b1；其编码序列分别如seq id no:9和10所示。

17、本发明第三个方面还提供了一种核酸构建物，含有本文第二个方面任一实施方式所述核酸分子。

18、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、整合载体或表达载体。

19、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还可含有ggpps、ent-cps、ks、cpr、ka13h的编码序列中的任一种或多种。

20、在一个或多个实施方案中，所述载体具有长rbs或短rbs序列。优选地，所述载体具有t7 gene 10leader rbs序列或核心rbs序列。在一个或多个实施方案中，所述t7 gene10leader rbs序列如seq id no:11所示，所述核心rbs序列如seq id no:12所示。

21、本发明第四个方面还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞：

22、(1)表达本文第一个方面任一实施方式所述的ko或其变体，或

23、(2)含有本文第二个方面任一实施方式所述的核酸分子和/或本文第三个方面任一实施方式所述的核酸构建物。

24、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞还表达选自以下的一种或多种或全部蛋白：ggpps、ent-cps、ks、cpr、ka13h，或含有编码所述蛋白的核酸构建物。

25、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞还表达mva通路的蛋白，或含有编码所述蛋白的核酸构建物。所述mva通路的蛋白包括选自以下一种或多种：mvd、pmk、mvk、hmgr、hmgs、aact，优选包括选自以下的一种或多种：atob、mvas、mvae、mvk1、mvk2、mvad和fni。

26、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在优选的实施方案中，所述大肠杆菌为k系大肠杆菌，包括jm109(de3)、hms174(de3)和novablue(de3)；更优选为大肠杆菌jm109(de3)。

27、本发明第五个方面还提供一种提升对映-贝壳杉烯-19-酸(ka)和/或甜菊醇的产量的方法，包括：使用本文第一方面任一实施方案所述的ko或其变体催化对映-贝壳杉烯、对映-贝壳杉烯-19-醇和/或对映-贝壳杉烯-19-醛的步骤。

28、在一个或多个实施方案中，所述方法包含在适于生产对映-贝壳杉烯-19-酸和/或甜菊醇的条件下培养本文第四个方面任一实施方案所述的宿主细胞的步骤。

29、在一个或多个实施方案中，所述条件包括tb培养基。优选地，所述tb培养基含有碳源，优选为甘油；优选地，碳源的浓度为2％。

30、在一个或多个实施方案中，所述培养的温度为20-25℃，优选22℃。

31、在一个或多个实施方案中，所述培养至少24小时，优选至少96小时。

32、在一个或多个实施方案中，所述条件包括诱导剂，优选为iptg；优选地，iptg的浓度为至少0.05mm。

33、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括由宿主细胞分离得到对映-贝壳杉烯-19-酸和/或甜菊醇的步骤；具体包括：破碎细胞后使用有机溶剂萃取并真空干燥，有机溶剂优选乙酸乙酯。

技术特征：

1.一种对映-贝壳杉烯19位氧化酶或其变体，所述氧化酶选自甜叶悬钩子(rubussuavissimus s.lee)来源的rsko、明日叶(angelica keiskei(miq.)koidz.)来源的akko和小粒咖啡(coffea arabica l.)来源的cako，

2.如权利要求1所述的对映-贝壳杉烯19位氧化酶或其变体，其特征在于，

3.一种核酸分子，包含选自以下的序列：

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，(1)所述核酸序列具有选自以下的一项或多项所述的序列：

5.一种核酸构建物，含有权利要求4所述的核酸分子，

6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述载体具有长rbs或短rbs序列，

7.一种宿主细胞，所述宿主细胞：

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述mva通路的蛋白包括选自以下的一种或多种：mvd、pmk、mvk、hmgr、hmgs、aact，优选包括选自以下的一种或多种：atob、mvas、mvae、mvk1、mvk2、mvad和fni。

9.如权利要求7或8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞，

10.一种提升对映-贝壳杉烯-19-酸(ka)和/或甜菊醇的产量的方法，包括：使用本文第一方面任一实施方案所述的ko或其变体催化对映-贝壳杉烯、对映-贝壳杉烯-19-醇和/或对映-贝壳杉烯-19-醛的步骤，

技术总结
本发明涉及新型对映‑贝壳杉烯19位氧化酶及其应用，具体提供一种新型对映‑贝壳杉烯19位氧化酶(KO)或其变体，所述氧化酶选自甜叶悬钩子来源的RsKO、明日叶来源的AkKO和小粒咖啡来源的CaKO。本发明的氧化酶能够特异和高效地催化对映‑贝壳杉烯及其衍生物的羟基化、醛基化、羧基化。

技术研发人员：王勇,陈卓,孙雨伟
受保护的技术使用者：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25