异常威克汉姆酵母WFDJ-1及其应用的制作方法

异常威克汉姆酵母wfdj-1及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及异常威克汉姆酵母wfdj-1及其应用。


背景技术：

2.随着经济不断发展，市场对农牧业及饲料行业的要求不断提高。农牧企业不断扩大养殖规模，随之而来的是对饲料的需求不断增长。为促进畜牧业发展，拓宽饲料资源，开发和利用饲料资源尤为重要。
3.酵母培养物的营养物质组成复杂，营养成分丰富，含有丰富的蛋白和核酸等营养物质，是一种良好的微生态制剂，在提供营养、调节胃肠道微生物环境、增强消化吸收、促进生长、增强免疫力方面具有积极作用。研究表明，在泌乳早期奶牛饲粮中添加酿酒酵母培养物，可以显著增加奶牛采食量，提高乳脂率、乳蛋白率，改善泌乳性能，显著提高纤维和蛋白吸收率。同时，酵母来源较广、产量大，生产渠道众多，价格适合，在一定程度上还可以增加饲料的可食性和适口性，是一种非常优良的饲料原料。此外，与抗生素类药物相比，微生态制剂具有无毒、无污染、无残留、不产生抗药性等特点，备受养殖和饲料行业的瞩目。因此，酵母在动物生产中具有广阔的应用前景。开发新的酵母菌菌种作为饲料添加剂应用于动物饲养具有重要的现实意义和应用价值。


技术实现要素：

4.本发明提供一株异常威克汉姆酵母wfdj-1及其应用。
5.本发明提供异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)wfdj-1，该菌株于2020年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为异常威克汉姆酵母wickerhamomyces anomalus，保藏编号为cgmcc no.19898。
6.异常威克汉姆酵母wfdj-1是从河南省某肉牛养殖基地收集的瘤胃液中分离筛选得到。
7.异常威克汉姆酵母wfdj-1的菌落形态为：表面平滑，边缘规则，中间凸起，颜色呈乳白色，不透明，粘稠易挑起。在光学显微镜下观察菌体呈现椭圆形或纺锤形，个体大，芽殖，单一或聚集分布。
8.异常威克汉姆酵母wfdj-1的生长特征为：生长最适温度为28℃，最适ph为6.0。该菌株的生长速度快，延迟期(0-2h)短，能快速进入对数期(2-10h)，摇床培养10小时进入稳定期(10-36h)，培养36小时后逐渐进入衰退期。该菌株在90℃处理后存活率仍可达到90％以上，具有较强的耐高温、耐胆盐能力。
9.本发明提供一种菌剂，所述菌剂含有所述异常威克汉姆酵母wfdj-1或由所述异常威克汉姆酵母wfdj-1制备得到。
10.以上所述的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。所述菌剂可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
11.在本发明的一些实施方式中，所述菌剂为冻干菌剂；所述冻干菌剂的制备方法包括：将所述异常威克汉姆酵母wfdj-1经培养获得菌体，将菌体进行冷冻干燥处理。
12.优选地，所述培养为在28-30℃，振荡、搅拌或通风条件下进行。
13.所述菌体的获得为将培养获得的培养液经离心等方式固液分离得到。
14.具体地，所述冻干菌剂的制备包括菌种活化、扩大培养、离心分离和冷冻干燥步骤。
15.优选地，上述冻干菌剂中异常威克汉姆酵母wfdj-1的活菌数为8-9
×
109cfu/g。
16.在本发明的一些实施方式中，所述菌剂为发酵菌剂；所述发酵菌剂的制备方法包括：将所述异常威克汉姆酵母wfdj-1进行液态发酵得到液态发酵菌液，将所述液态发酵菌液在有氧条件下进行固态发酵得到发酵物，将所述发酵物经自溶处理后进行干燥。
17.优选地，所述液态发酵为先在28-30℃发酵20-26h，然后在17-19℃无氧条件下发酵。
18.优选地，所述固态发酵为先在23-28℃有氧发酵20-26h，然后在33-35℃有氧发酵。
19.优选地，在液态发酵前还包括菌种活化和扩大培养步骤。
20.优选地，所述自溶处理为在42℃处理发酵物。
21.优选地，上述发酵菌剂中，异常威克汉姆酵母wfdj-1的活菌数为10
4-106cfu/g。
22.优选地，上述菌种活化使用的液体种子活化培养基包括如下组分：葡萄糖15-25g/l，蛋白胨15-25g/l，酵母浸粉8-12g/l，自然ph。
23.本发明提供所述异常威克汉姆酵母wfdj-1或所述菌剂在制备饲料或饲料添加剂中的应用。
24.本发明提供所述异常威克汉姆酵母wfdj-1或所述菌剂在制备食品或药物中的应用。
25.本发明提供所述异常威克汉姆酵母wfdj-1或所述菌剂在抗氧化中的应用。
26.本发明提供所述异常威克汉姆酵母wfdj-1或所述菌剂在提高动物的抗氧化能力中的应用。
27.本发明提供所述异常威克汉姆酵母wfdj-1或所述菌剂在促进动物营养消化吸收、提高动物采食量、促进动物生长、促进动物增重、降低动物腹泻率或提高饲料利用率中的应用。
28.本发明还提供一种饲料或饲料添加剂，其含有所述异常威克汉姆酵母wfdj-1或所述菌剂。
29.本发明的有益效果在于：本发明提供的异常威克汉姆酵母wfdj-1对高温、高浓度胆盐、氧化等不良环境具有很强的抗性，较强的抗逆性增加了其作为益生菌的潜力；该菌株生长速度快，延迟期短，能快速进入对数期，易于培养和菌剂制备；异常威克汉姆酵母wfdj-1能够有效清除自由基，具有较好的抗氧化活性。本发明通过小鼠饲喂实验进一步验证了异常威克汉姆酵母wfdj-1在动物饲养方面的应用安全性，表明异常威克汉姆酵母wfdj-1可作为一种新型的益生菌添加剂应用于饲料中，安全无害，在促进动物营养消化吸收、提高饲料利用率、降低动物腹泻等发病率方面具有积极作用，在动物养殖、饲料和饲料添加剂领域具有很好的应用前景。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明实施例1中异常威克汉姆酵母wfdj-1的菌落形态图。
32.图2为本发明实施例1中异常威克汉姆酵母wfdj-1在光学显微镜下的革兰氏染色形态图。
33.图3为本发明实施例2中异常威克汉姆酵母wfdj-1菌株最适温度测定结果。
34.图4为本发明实施例2中异常威克汉姆酵母wfdj-1菌株最适ph测定结果。
35.图5为本发明实施例3中异常威克汉姆酵母wfdj-1的生长曲线。
36.图6为本发明实施例4中异常威克汉姆酵母wfdj-1的耐高温检测结果。
37.图7为本发明实施例4中异常威克汉姆酵母wfdj-1的耐胆盐检测结果。
具体实施方式
38.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例1异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)wfdj-1的分离与鉴定
40.1、菌株的分离培养
41.取1ml河南省某肉牛养殖基地收集的瘤胃液装入有9ml生理盐水的试管中，混匀后得到10％的稀释液，随后再进行10倍梯度稀释，得到10-2
，10-3
，10-4
，10-5
，10-6
等稀释梯度，然后各取每个梯度的稀释液各0.1ml涂布于ypd固体培养基，每个稀释梯度做三个平行。将培养基平板置于30℃恒温培养箱中培养48h，观察菌落生长情况。挑取ypd培养基圆形的单菌在ypd固体培养基上进行划线分离纯化，挑取单菌落，对其染色，镜检，直至镜检结果中菌体形态一致。
42.将上述所获得的单一菌株通过斜面保存及甘油管保存的方法进行保存。斜面保存是将纯化后的菌种接种至置于玻璃试管中的ypd固体培养基斜面上，放置培养箱中培养48h后，保存在4℃冰箱中；甘油管保存是取通过ypd液体培养基扩大培养后得到的菌液与40％灭菌后的甘油1：1混合，并将混合液装于2ml无菌pe管中，于-80℃冰箱中下保存。
43.2、菌落形态观察
44.wl营养琼脂培养基(1l)：酵母浸粉4.0g，葡萄糖50.0g，氯化钾0.425g，氯化钙0.125g，硫酸镁0.125g，磷酸二氢钾0.55g，氯化铁0.0025g，硫酸锰0.0025g，溴甲酚绿0.0022g，琼脂20.0g，酸水解酪蛋白5.0g，ph 5.5
±
0.2。
45.ypd琼脂培养基(1l)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，琼脂粉17g，ph自然。
46.将菌种接种至wl和ypd固体培养基上，30℃培养48h，观察并记录其在wl和ypd固体培养基上菌落形态，结果如图1所示，菌落形态呈表面光滑、边缘规则的圆形，中间凸起，表面呈乳白色，不透明，微微湿润，质地粘稠，排列方式多数为单个存在，部分成对存在。
47.3、革兰氏染色
48.在无菌环境中取一片载玻片，用酒精棉擦拭干净，晾干后上滴一滴无菌蒸馏水，挑取一个单菌落在无菌蒸馏水中混匀，随后用酒精灯加热固定菌体，固定后进行染色，先使用结晶紫染液染色1min，水洗去掉浮色，自然晾干后滴加碘液媒染1min，倾倒出多余液体随后滴加乙醇溶液30s进行脱色，最后使用番红染液复染30s。制片结束后将其在光学显微镜下放大100倍后观察，结果如图2所示，菌体呈现椭圆形，芽殖，因而确定获得一株酵母，并将该菌株编号为wfdj-1。
49.4、分子生物学鉴定
50.从斜面保存的异常威克汉姆酵母菌wfdj-1挑取单一菌落于ypd液体培养基中，放于30℃，200r/min摇床中培养48h进行活化，得到种子发酵液。随后按照真菌dna提取试剂盒方法提取dna，鉴定所采用的扩增引物为真核生物18s rdna通用扩增引物，l8sf(5
′‑
cctggttgatcctgccag-3
′
)和l8sr(5
′‑
ttgatccttctgcag gttca-3
′
)。鉴定所采用的pcr程序包括：95℃预变性5min；然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，最后于72℃延伸10min。将扩增后的产物送到上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，测序结果如seq id no.1所示。将测定结果在ncbi网站genbank数据库中进行blast同源性比对，与其它多株异常威克汉姆酵母的18s rdna d1/d2区序列有99％的相似性，确定菌株类别为异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)。该菌株于2020年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为异常威克汉姆酵母wickerhamomyces anomalus，保藏编号为cgmcc no.19898。
51.实施例2异常威克汉姆酵母wfdj-1的最适温度和最适ph的确定
52.1、异常威克汉姆酵母生长最适温度
53.探究异常威克汉姆酵母wfdj-1菌株生长最适温度，设置24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃不同温度梯度，将活化后的待测菌株接种到ypd液体培养基中，于30℃条件下摇床培养24h，随后测定od
600
，结果如图3所示，可以看出异常威克汉姆酵母wfdj-1生长最适温度为28℃。
54.2、异常威克汉姆酵母生长最适ph
55.探究异常威克汉姆酵母wfdj-1菌株生长最适ph，设置4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0不同梯度ph，以ypd液体培养基作为基础，配制不同ph的ypd液体培养基。将活化后的待测菌株接种到ypd液体培养基中，于30℃条件下摇床培养24h，随后测定od
600
，结果如图4所示，可以看出异常威克汉姆酵母wfdj-1生长最适ph为6.0。
56.实施例3异常威克汉姆酵母wfdj-1的生长曲线测定
57.生长曲线代表了菌株在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。将活化好的异常威克汉姆酵母wfdj-1按2％(v/v)的接种量，接种到ypd液体培养基中，30℃培养36小时，每隔2小时测定其ph、od
600
值和活菌数。实验设三次重复，结果取其平均值，记录数据并绘制生长曲线。如图5所示，在0-2h时间内，异常维克汉姆酵母wfdj-1活菌数缓慢上升，属于菌株适应阶段，生长缓慢；在2-10h时间段，活菌数加速升高，菌株以最快的速度进行繁殖为对数生长期；10h后随着时间的增长，活菌数呈现缓慢上升的趋势，在10-36h异常威克汉姆酵母wfdj-1活菌数趋于稳定。因此，在相同培养条件下制备种子液，培养
至12～16h左右即可满足要求。
58.实施例4异常威克汉姆酵母wfdj-1的耐高温、耐胆盐性能分析
59.1、耐高温试验
60.将活化好的异常威克汉姆酵母wfdj-1分三等份菌液置于水浴锅内20min，设置50℃、70℃、90℃三个处理组，每个处理3个重复。随后从每个管中取0.1ml菌液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，每个处理组选取适当的稀释梯度采用涂布法测定其活菌数。结果如图6所示，处理组50℃处理后，异常威克汉姆酵母wfdj-1存活率可达99％；处理组70℃处理后其存活率可达95％以上，处理组90℃处理后仍其存活率可达到90％以上，说明异常威克汉姆酵母wfdj-1具有较强的耐高温能力。
61.2、耐胆盐试验
62.设置含不同浓度(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)牛胆酸钠的ypd固体培养基处理组，不加牛胆酸钠的ypd培养基做空白对照。取0.1ml活化好的异常威克汉姆酵母wfdj-1菌液，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1ml稀释液放于无菌培养皿里，用处理后的ypd固体培养基倾注平板，每个平板20～30ml，每个处理3个重复。随后将凝固后的平板倒置放在30℃培养箱中培养12h，测定其活菌数。结果如图7所示，浓度为0.1％的胆盐对异常威克汉姆酵母wfdj-1的影响较小，与对照组相比其活菌数减少程度低；0.2％和0.3％的胆盐对其生长具有抑制作用，异常威克汉姆酵母wfdj-1活菌数仍然在8.6lg cfu/ml左右；在0.4％的胆盐作用下，异常威克汉姆酵母wfdj-1活菌数平均为8.59lg cfu/ml，存活率较高，说明异常威克汉姆酵母wfdj-1具有较强的耐胆盐能力。
63.实施例5异常威克汉姆酵母wfdj-1的dpph清除自由基抗氧化活性检测
64.取1ml无水乙醇与3ml 0.2mmol/l的dpph溶液混合，测定波长517nm处的吸光度a0。取活化后的异常威克汉姆酵母wfdj-1菌液1ml与3ml 0.2mmol/l的无水乙醇溶液混合，离心30min后取上清测定波长517nm处的吸光度a1。取活化后的异常威克汉姆酵母wfdj-1菌液1ml与3ml 0.2mmol/l的dpph溶液混合，离心30min后取上清测定波长517nm处的吸光度a2。根据dpph自由基清除率公式：dpph自由基清除率(％)＝[1-(a2-a1)/a0]*100，其中，a0是dpph
+
无水乙醇的吸光值，a1是菌液+无水乙醇的吸光值，a2是菌液+dpph的吸光值。通过对菌株抗氧化性进行研究，发现异常威克汉姆酵母wfdj-1对0.2mmol的dpph自由基清除率在83.2％，说明wfdj-1菌株具备一定的抗氧化应用潜力。
[0065]
实施例6异常威克汉姆酵母wfdj-1发酵菌剂的制备
[0066]
1、液态发酵培养基(l)：糖蜜150g，无水硫酸2g，磷酸二氢钾3g，硫酸铵20g，无水氯化钙0.16g，酵母粉2g，消泡剂0.5g，加水溶解后调节ph至6.5，得到液态发酵培养基。
[0067]
2、固态发酵培养基(1kg)：300g玉米粉，250g麸皮，300g豆粕，150g玉米芯粉，0.2g硫酸铵，0.2g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g碳酸钙，0.3g低温淀粉酶，0.2g中性纤维素酶，0.25g酸性蛋白酶，分别灭菌后混匀，得到固态发酵培养基。
[0068]
3、液态发酵培养基在121℃，30min条件下在发酵罐中进行高温蒸汽灭菌，灭菌后等待培养基降温至30℃，进行接种，按照接种量5％(v/v)将异常威克汉姆酵母wfdj-1接种至发酵罐。发酵开始前，控制温度为30℃，保持搅拌叶转速200rpm，发酵培养24小时后调节温度18℃，关掉通风，保持搅拌叶转速70rpm，保持发酵罐压为0.04mpa，发酵48h后，获得液态低温无氧发酵菌液。液态发酵结束后，将菌液1:2(m/m)加入固态发酵培养基中进行室温
有氧发酵，发酵24h后，将发酵物装入带呼吸阀的呼吸袋中，调节烘箱温度为35℃，35℃培养48h。固体发酵结束后调节烘箱温度到42℃转入自溶阶段。自溶结束后，拆开呼吸袋，将酵母培养物装盘42度烘干，便得到异常威克汉姆酵母wfdj-1发酵制剂。
[0069]
实施例7异常威克汉姆酵母wfdj-1冻干菌剂的制备
[0070]
1、菌种活化
[0071]
挑取斜面保存的异常威克汉姆酵母wfdj-1接种于ypd液体培养基中，在30℃，200r/min的条件下用摇床培养24h，得到第一代酵母培养液。
[0072]
2、酵母菌扩大培养
[0073]
按照2％(v/v)的接种量，将第一代酵母培养液接种于ypd液体培养基中，在30℃，200r/min的条件下用摇床培养12h，得到第二代摇床培养液。
[0074]
3、离心分离
[0075]
将酵母二代培养液在6500r/min，5min条件下进行离心，去上清，得到的菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤2-3次，直至上清液没有颜色。此时所得到的菌体为异常威克汉姆酵母wfdj-1菌泥。
[0076]
4、冷冻干燥
[0077]
将上述得到的异常威克汉姆酵母wfdj-1菌泥装入离心管中，在-20℃或-80℃冰箱中预冻一夜，随后将其放入真空冷冻干燥机中，在温度-80℃与68
×
10-3
mb的条件下干燥2-3d，得到异常威克汉姆酵母wfdj-1菌剂。
[0078]
实施例8异常威克汉姆酵母wfdj-1菌剂在动物饲养中的应用及安全性评价
[0079]
本发明以小鼠作为实验动物，采用灌胃的方式，评价异常威克汉姆酵母wfdj-1菌剂在动物饲养应用的安全性，具体方法如下：
[0080]
1、菌剂准备
[0081]
将实施例7中冷冻干燥得到的异常威克汉姆酵母wfdj-1菌剂用无菌生理盐水溶解，通过平板计数测定其活菌数为8.7
×
109cfu/g。使用时用生理盐水溶解或稀释处理后使用。
[0082]
2、动物分组及处理
[0083]
选取54只实验小鼠适应性饲养7d后，将试验用小鼠标号、称重、分笼，设置三个实验组，每组3个重复，每个重复6只鼠。
[0084]
三个实验组处理如下：组
①
为对照组灌服无菌生理盐水，组
②
为高剂量组，每只鼠灌服菌液8.7
×
109cfu，组
③
为低剂量组灌服菌液8.7
×
107cfu。
[0085]
3、实验样本采集
[0086]
实验周期为7周，每天上午对小鼠灌服，并观察其饮食、行为活动、健康状况、毛色等外观体征，每周记录小鼠体重，固定时间采集小鼠粪便。
[0087]
7周后对小鼠进行断颈处死，眼球取血，解剖小鼠摘取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重，分别计算脏器指数＝(脏器湿重/体重)
×
100％。
[0088]
结果显示，7周后所有处理组的小鼠均处于存活状态，每个组小鼠发育正常，毛色正常；而且，高剂量处理组及低剂量处理组小鼠的体重及脏器指数与对照组相比没有明显变化，说明异常威克汉姆酵母wfdj-1菌剂没有造成小鼠各脏器异常。因此，异常威克汉姆酵母wfdj-1具有很高的安全性。
[0089]
实施例9异常威克汉姆酵母wfdj-1菌剂在动物饲养中的应用及益生性评价
[0090]
以64头杜长大杂交仔猪为实验对象，在28
±
1天断奶，断奶后预饲一周。仔猪(体重：9.18
±
0.24公斤)被随机分配到两个处理，每栏8头仔猪，每个处理有4个重复栏，按体重和性别平衡。实验日粮包含一个对照日粮，处理组日粮含有1g/kg按照实施例6的方法制备的异常威克汉姆酵母wfdj-1发酵菌剂。实验期28天，在整个试验过程中，仔猪可以自由采食，自由饮水。在实验期的不同时间测定仔猪的体重、采食量和腹泻情况，并计算平均日采食量、平均日增重、料重比和腹泻率，结果如表1所示。
[0091]
表1
[0092][0093][0094]
以上实验结果表明，在实验全期内，异常威克汉姆酵母wfdj-1发酵菌剂处理组与对照组相比，仔猪的日采食量增加，平均日增重增加，料重比显著降低，腹泻率显著降低，说
明异常威克汉姆酵母wfdj-1能够有效降低动物腹泻率，提高饲料利用率，在畜禽饲养上具有很好的应用前景。
[0095]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。